2. 宁夏回族自治区畜牧工作站, 银川 750002
2. Ningxia Hui Autonomous Region Animal Husbandry Workstation, Yinchuan 750002, China
围产期是奶牛泌乳周期中最为关键的阶段，其涉及胎儿的生长发育、机体的健康维持、乳腺的更新和修复及泌乳启动等重要生理过程，围产期奶牛由于分娩应激、采食量下降及内分泌激素的剧烈变化，导致奶牛出现免疫抑制和氧化应激[1-2]，易诱发生产瘫痪、真胃移位、脂肪肝和酮病、瘤胃酸中毒、胎衣不下、乳房炎等代谢性疾病，增加淘汰风险。据统计，大约有75%的奶牛疾病是发生在围产期，产后1个月内尤为严重[3-4]，因此，如何有效缓解围产期奶牛应激及营养调控，对围产期奶牛生产性能的发挥及奶产业的健康发展具有重要意义。
蛋氨酸(Met)和赖氨酸(Lys)是反刍动物首要限制性氨基酸，两者的限制顺序因饲粮的不同而不同[5]。大量研究证明，当奶牛饲喂以玉米为基础的饲粮时，Met和Lys是限制性最高的2种氨基酸[6]，当奶牛饲喂玉米-豆粕型饲粮时，Met是第一限制性氨基酸[7]。近年来，有研究表明，Met对奶牛免疫功能[8]、乳蛋白质合成[9]和含硫抗氧化物合成[10]等方面有着重要的调控作用。因此，本研究旨在探讨围产前期添加蛋氨酸羟基类似物异丙酯(HMBi)的营养干预措施是否对围产期奶牛瘤胃发酵及微生物区系产生影响，以期为缓解围产期奶牛的应激及泌乳早期的营养调控提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计选择40头健康的荷斯坦围产期奶牛，根据年龄、体况、胎次、预产期及上一胎次泌乳量相近原则进行配对试验设计，分为试验组和对照组，每组20头牛，试验奶牛分组情况见表 1。在围产前期，对照组饲喂基础饲粮，试验组在饲喂基础饲粮的同时补充30 g/d HMBi(占干物质采食量的0.19%[8, 11])，在围产后期2组饲喂相同饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表 2，试验期44 d。试验期间，奶牛饲养管理按牧场标准化饲养管理流程执行(饲喂全混合日粮，每日2次；散栏式饲养，自由饮水，自由采食)。
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表 1 试验奶牛分组情况 Table 1 Grouping of experimental cows |
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表 2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
根据年龄、体况、胎次、预产期及上一胎次泌乳量相近的原则，试验组与对照组各选择6头奶牛，分别于产前7 d(-7 d)和产后7 d(+7 d)晨饲前用胃管式牛瘤胃液采样器采集瘤胃液50 mL，经4层纱布过滤，用台式酸度计测定瘤胃液pH。将滤液分装于5和10 mL无菌冻存管中，随后置于液氮速冻后置于-80 ℃的冰箱内保存，用于测定各组奶牛分娩前后瘤胃发酵指标和微生物区系的变化。
1.2.2 挥发性脂肪酸(VFA)、氨态氮(NH3-N)浓度及微生物蛋白(MCP)含量的测定用气相色谱仪(日本岛津GC-2014C)测定瘤胃液中的总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸的浓度[12]。利用比色法测定瘤胃液NH3-N浓度[13]。MCP含量采用嘌呤碱基法[14]测定。
1.2.3 瘤胃液微生物总DNA提取及瘤胃微生物测定使用Hipure Soil DNA提取试剂盒(Magen公司)抽提瘤胃液总DNA，DNA提取完成后，利用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度法对DNA的纯度及浓度进行检测，质检合格的样品-20 ℃保存。取适量检测合格的DNA样品于离心管中进行稀释，将稀释后的基因组DNA作为模板，DNA扩增目的片段为V3~V4区(测序引物为341F：5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′)，PCR扩增完成后，用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用AMPure XP Beads对第2轮扩增产物进行纯化，用ABI Steponeplus Real-Time PCR System(Life Technologies)进行定量，根据Illumina HiSeq2500的PE250模式Pooling上机测序。测序完成后，原始读数据上传在NCBI SRA(Sequence Read Archive)数据库。
使用UPARSE流程将clean tag按≥97%相似度聚类为操作分类单元(OTU)。选取丰度最高的tag序列作为每个OTU的代表序列。OTU代表序列比对Greengene数据库使用RDP注释软件(2.2)的朴素贝叶斯模型进行物种分类注释，置信阈值设为0.8~1.0。使用Krona(2.6)显示每个物种分类的丰度统计数据。
1.3 数据统计与分析用Excel 2016对试验数据进行初步整理后，采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。Alpha多样性指数数据采用ANOVA程序进行单因素方差分析，利用Duncan氏法对平均值进行多重比较。以P≤0.05为差异显著，0.05＜P＜0.10为有显著趋势，P < 0.01为差异极显著。在门和属水平上，主要对样品相对丰度在1%以上的菌群进行分析。
2 结果与分析 2.1 HMBi对围产期奶牛瘤胃发酵参数的影响由表 3可知，试验组奶牛产后瘤胃液NH3-N浓度显著低于对照奶牛(P≤0.05)，试验组与对照组产前瘤胃液NH3-N浓度差异不显著(P＞0.05)；试验组与对照组奶牛在分娩前后瘤胃液pH，MCP含量，TVFA、乙酸、丙酸、丁酸浓度及乙酸/丙酸没有显著差异(P＞0.05)。
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表 3 添加HMBi对围产期奶牛瘤胃发酵参数的影响 Table 3 Effects of adding HMBi on rumen fermentation parameters of peripartum dairy cows |
由表 4可知，在围产期，试验组Sobs指数、Chao1指数均高于对照组(P＞0.05)，产前试验组Sobs指数、Chao1指数较对照组分别提高了3.65%和2.86%，产后试验组Sobs指数、Chao1指数较对照组分别提高了14.96%和13.08%，试验组奶牛产前ACE指数显著高于对照组(P＜0.05)，产后试验组ACE指数较对照组提高了9.13%；产后试验组Shannon指数、Simpson指数均显著高于对照组(P＜0.05)，产前试验组Shannon指数较对照组提高了0.80%，但无显著差异(P＞0.05)。
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表 4 添加HMBi对围产期奶牛瘤胃细菌Alpha多样性的影响 Table 4 Effects of adding HMBi on rumen bacterial Alpha diversity of peripartum dairy cows |
由表 5可知，产前对照组(CK-1组)与产前试验组(T-1组)瘤胃细菌菌群结构组间差异不显著(R＜0.30，且P＞0.05)，产后对照组(CK-2组)与产后试验组(T-2组)瘤胃细菌菌群结构存在差异趋势(0.30＜R＜0.50，且P＜0.05)，试验组与对照组奶牛在分娩前后瘤胃细菌菌群结构存在极显著差异(R＞0.75，且P＜0.05)。由此可知，在产前试验组与对照组奶牛瘤胃细菌菌群结构相似性较高，产后试验组与对照组奶牛瘤胃细菌菌群结构存在差异趋势，并且产后试验组与对照组奶牛瘤胃细菌菌群结构较产前发生了极显著变化。
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表 5 基于OTU水平围产期奶牛瘤胃细菌组间相似性分析 Table 5 Similarity analysis between groups of rumen bacteria of peripartum dairy cows based on OTU level1) |
在主坐标分析(PCoA)中，主成分的贡献值分别为22.87%、27.49%。由图 1可见，CK-1组与T-1组样本间距离较近，且分布聚焦，说明在围产前期试验组与对照组样本组间和组内差异较小，CK-2组内样本间距离较远且分布较为离散，说明产后对照组样本组内个体差异较大，T-2组样本间距离比较接近，提示添加HMBi对于维持围产期奶牛瘤胃细菌菌群平衡具有积极作用。
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图 1 围产期奶牛瘤胃液样品的主坐标分析 Fig. 1 PCoA of rumen fluid samples of peripartum dairy cows |
本试验共鉴定出16个菌门，其中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)4个主要细菌门类相对丰度总和占到总菌的93%以上，是围产期奶牛瘤胃优势菌门(图 2)。围产期奶牛瘤胃液样品细菌门水平的菌群组成如表 6所示。对瘤胃细菌门水平组成差异进行分析，结果表明，产前对照组奶牛瘤胃厚壁菌门相对丰度极显著高于试验组(P＜0.01)，但在产后2组间差异不显著(P＞0.05)；与对照组相比，产后试验组奶牛瘤胃纤维杆菌门(Fibrobacteres)相对丰度显著高于对照组(P＜0.05)，产前试验组奶牛瘤胃Kiritimatiellaeota相对丰度显著高于对照组(P＜0.05)；产后试验组奶牛瘤胃变形菌门相对丰度极显著低于对照组(P＜0.01)，产后试验组奶牛瘤胃Patescibacteria、Kiritimatiellaeota、浮霉菌门及螺旋体门相对丰度有线性增加的趋势(0.05＜P＜0.10)。
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Firmicutes：厚壁菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Proteobacteria：变形菌门；Actinobacteria：放线菌门；Euryarchaeota：广古菌门；Tenericutes：软壁菌门；Cyanobacteria：蓝藻门；Planctomycetes：浮霉菌门；Other：其他；Unclassified：未分类。 图 2 不同样品瘤胃细菌门水平相对丰度图 Fig. 2 Relative abundance map of rumen bacteria of different samples at phylum level |
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表 6 添加HMBi对围产期奶牛瘤胃细菌门水平组成的影响 Table 6 Effects of adding HMBi on rumen bacteria composition at phylum level of peripartum dairy cows |
本试验共鉴定出119个属水平的菌群，普雷沃氏菌属1(Prevotella_1)、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、普雷沃氏菌属7(Prevotella_7)、瘤胃球菌科NK4A214群(Ruminococcaceae_NK4A214_group)等是组成围产期奶牛瘤胃细菌群落的主要菌属类(图 3)。奶牛瘤胃液样品细菌属水平的菌群组成如表 7所示。对瘤胃细菌属水平组成差异进行分析，结果表明，产前试验组奶牛瘤胃解琥珀酸弧菌科UCG-001(Succinivibrionaceae_UCG-001)、互营球菌属(Syntrophococcus)的相对丰度显著高于对照组(P＜0.05)；产后试验组奶牛瘤胃瘤胃球菌科_UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005)、瘤胃球菌属1(Ruminococcus_1)、厌氧弧菌属(Anaerovorax)的相对丰度显著高于对照组(P＜0.05)，欧氏菌属(Olsenella)的相对丰度显著低于对照组(P＜0.05)。
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Prevotella_1：普雷沃氏菌属1；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9肠道群；Christensenellaceae_R-7_group：克里斯滕森菌科R-7群；Prevotella_7：普雷沃氏菌属7；Ruminococcaceae_NK4A214_group：瘤胃球菌科NK4A214群；Saccharofermentans：产乙酸糖发酵菌；Ruminococcus_2：瘤胃球菌属2；Ruminococcus_1：瘤胃球菌属1；Succiniclasticum：解琥珀酸弧菌属；Prevotellaceae_UCG-001：普雷沃氏菌科UCG-001；Other：其他；Unclassified：未分类。 图 3 不同样品瘤胃细菌在属水上相对丰度图 Fig. 3 Relative abundance map of rumen bacteria of different samples at genus level |
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表 7 添加HMBi对围产期奶牛瘤胃细菌属水平组成的影响(相对丰度在1%以上) Table 7 Effects of adding HMBi on rumen bacteria composition at genus level of peripartum dairy cows (relative abundance above 1%) |
瘤胃液VFA是反刍动物瘤胃微生物降解碳水化合物过程中产生的主要产物，是瘤胃微生物及动物本身主要的能量来源，其浓度和组成是反映瘤胃消化代谢活动是否正常的重要指标之一。VFA主要包括乙酸、丙酸和丁酸，其总浓度的高低及其相对比例受饲粮结构、干物质采食量水平等因素影响，瘤胃液VFA的浓度高低可以反映瘤胃的发酵类型和VFA的吸收利用情况，瘤胃液TVFA浓度的增加表明瘤胃微生物对碳水化合物的降解能力有所增强。本研究中，添加HMBi对瘤胃液TVFA、乙酸、丙酸、丁酸的浓度及乙酸/丙酸没有表现出显著影响。此外，随着产后奶牛饲粮中非结构性碳水化合物水平的升高，产后奶牛瘤胃液TVFA、乙酸、丙酸和丁酸浓度也明显升高。刘宏波[15]和周帅等[16]的体外试验研究发现，添加HMB可以提高瘤胃TVFA的浓度。Noftsger等[17]的体外试验研究发现，添加HMB对奶牛瘤胃液TVFA浓度没有显著影响，与本试验研究结果一致，由此可见，添加HMB对奶牛瘤胃发酵的影响不一致，这可能与试验方法、HMB的类型及其添加剂量和作用时间有关。Koenig等[18]研究发现，HMB能够增加瘤胃乙酸的比例，与本试验的研究结果一致。
相对稳定的瘤胃内环境是瘤胃微生物定植与功能发挥的重要条件。瘤胃pH是评价瘤胃发酵状况的重要指标，与饲粮组成、采食水平、反刍时间、瘤胃中VFA及其他有机酸的浓度有关。本试验中，添加HMBi对瘤胃液pH无显著影响，但随着产后奶牛饲粮能量水平的提高，各组瘤胃液pH都有明显的下降趋势，产后试验组与对照组奶牛瘤胃pH较产前分别降低17.06%和22.28%。与对照组相比，试验组奶牛瘤胃液pH在产前和产后更趋近于瘤胃微生物最适生长的pH范围(pH=6~7)[19]。NH3-N是瘤胃微生物降解饲粮中肽类、氨基酸、氨、非蛋白氮及内源蛋白质的主要产物，同时也是合成MCP的重要氮源。通常情况下，瘤胃内NH3-N浓度可以反映瘤胃可代谢蛋白质的降解和瘤胃微生物对NH3-N的吸收和利用情况，如果瘤胃NH3-N浓度过低则MCP合成受阻，过高则影响NH3-N吸收和利用的速度，造成氮源的浪费。有学者研究表明，在奶牛饲粮中添加过瘤胃蛋氨酸可显著降低瘤胃NH3-N浓度，提高瘤胃微生物对NH3-N的利用率，进而提高瘤胃MCP的产量[20-21]，本试验中，添加HMBi降低了产前和产后奶牛瘤胃NH3-N浓度，增加了MCP产量，与上述研究结果一致。结果提示饲粮中添加HMBi可以提高瘤胃微生物对NH3-N的利用率，促进MCP的合成。
3.2 HMBi对围产期奶牛瘤胃细菌菌群结构的影响目前，已有大量的研究证明饲粮结构、品种、年龄、饲喂方式和机体健康状况等与反刍动物瘤胃微生物的丰度和多样性密切相关[22-23]。围产期奶牛由于生理代谢和饲粮结构发生剧烈变化，在分娩前后奶牛瘤胃微生物丰富度、多样性及菌群结构等都发生了显著变化。本试验研究结果显示，产后试验组与对照组奶牛瘤胃细菌的丰富度和多样性均低于产前，产后奶牛瘤胃细菌的菌群结构与产前奶牛存在差异，与Lima等[24]的研究结果一致。在奶牛分娩前后，试验组Sobs指数、Chao1指数、ACE指数和Shannon指数均高于对照组，表明添加HMBi提高了围产期奶牛瘤胃细菌丰富度和多样性，推测可能是因为添加HMBi平衡了产前奶牛饲粮中Lys和Met的比例，降低了奶牛分娩前后瘤胃NH3-N浓度，提高了可代谢蛋白质的利用率，而导致奶牛瘤胃细菌丰富度和多样性出现差异。通过对围产期奶牛瘤胃细菌Beta多样性分析，结果表明，在产前试验组与对照组样本间距离较近且分布聚焦，在产后试验组与对照组样本距离较远且分布离散，提示添加HMBi未对围产期奶牛瘤胃菌群结构造成明显的影响。
本试验中，试验组与对照组奶牛瘤胃微生物的优势菌门均为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门，与前人在奶牛瘤胃微生物区系上的研究结果[25]一致。通过对不同组奶牛产前和产后瘤胃细菌进行分析，在门水平上，产前试验组奶牛瘤胃厚壁菌门相对丰度极显著降低，Kiritimatiellaeota相对丰度显著升高；产后试验组奶牛瘤胃变形菌门相对丰度极显著降低，纤维杆菌门相对丰度显著升高，Patescibacteria、浮霉菌门、螺旋体门相对丰度有提高的趋势。在属水平上，产前试验组奶牛瘤胃解琥珀酸弧菌科UCG_001、互营球菌属相对丰度显著升高，普雷沃氏菌属7相对丰度有提高的趋势；产后试验组奶牛瘤胃球菌科UCG_005、瘤胃球菌属1、厌氧弧菌属相对丰度显著提高，欧氏菌属相对丰度显著降低，与其他学者[26-27]报道的关于围产期奶牛瘤胃菌群变化规律相似。在分娩前后，产后试验组与对照组瘤胃纤维杆菌门相对丰度均低于产前，但在产后试验组纤维菌门相对丰度显著高于对照组，表明从产前到产后这一过程导致瘤胃细菌对饲料纤维的降解能力降低，这可能与奶牛饲粮结构从产前低淀粉饲粮转换为产后高精料饲粮，饲粮中精粗比的变化导致纤维素分解菌和淀粉分解菌的丰度变化关[28-29]，同时说明添加HMBi提高了奶牛产后纤维杆菌门相对丰度，进而提高了瘤胃细菌对饲料纤维素的降解能力，与前人的研究结果[30]相似。相关研究表明，当奶牛饲粮结构由低能饲粮转变为高能饲粮时，瘤胃菌群中的拟杆菌门相对丰度会显著降低，而厚壁菌门的相对丰度会显著升高[31]，与本试验研究结果不一致，可能是由于奶牛在产后饲粮的泌乳净能尽管已由产前的5.98 MJ/kg提升至产后7.24 MJ/kg，但由于奶牛产后干物质采食量尚未恢复，加之奶牛分娩与采样时间间隔过短，导致瘤胃细菌的适应能力降低。变形菌门是动物胃肠道菌群平衡的关键指示物，如果变形菌门的相对丰度显著增加，可以间接表明动物胃肠道菌群失调[32]。本试验中，产后对照组奶牛瘤胃变形菌门相对丰度极显著高于试验组，与徐晓峰等[33]的研究结果相似，而试验组奶牛变形菌门相对丰度在分娩前后差异较小，可以推断，添加HMBi在维持奶牛产后瘤胃菌群结构的平衡和瘤胃内环境稳态的平衡等方面具有积极作用。
4 结论① 添加HMBi显著降低了产后奶牛瘤胃液NH3-N浓度，对围产期奶牛瘤胃MCP合成及瘤胃液pH，TVFA、乙酸、丙酸、丁酸浓度及乙酸/丙酸没有表现出显著影响。
② 添加HMBi提高了围产期奶牛瘤胃细菌丰富度和多样性，并对围产期奶牛瘤胃微生物区系结构有一定影响。
③ 在本试验条件下，饲粮中添加30 g/d HMBi，提高了产后奶牛瘤胃纤维杆菌门、瘤胃球菌科UCG-005、厌氧弧菌属的相对丰度，降低了变形菌门的相对丰度，在一定程度上提高了瘤胃细菌对饲粮纤维、淀粉等物质的消化能力，提升了瘤胃细菌对产后高淀粉饲粮结构的适应能力，改善了产后奶牛瘤胃内环境稳态失衡等问题。
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