动物的肠道菌群是保证其肠道消化功能的重要组成部分，与宿主的健康状态十分密切[1]。肠道菌群在宿主体内的进化过程中，会参与宿主食物的消化吸收、能量代谢等多种生理功能，具有十分重大的意义[2-3]。张子敬等[4]研究了腹泻与健康夏南牛犊牛粪便菌群的多样性、结构和组成，分析了肠道内的优势菌群，筛选出10个生物标志物(biomarker)作为犊牛腹泻参考的指标。牦牛作为青藏高原上特有的优势反刍家畜，主要以放牧饲养为主，利用该地区天然草地牧草为藏族群众提供重要的生产和生活资料来源。犊牛是牦牛产业可持续发展的后备军，其培育质量直接关系到成年牦牛的生产性能发挥。然而，在牦牛犊牛早期培育过程中，传统的随母哺乳放牧培育方式下犊牛腹泻易发多发，发病后致死率较高，严重影响了牦牛犊牛的培育质量，不利于牦牛生产的可持续发展。近年来，研究者开展了犊牛早期或适时断奶后舍饲代乳饲养来培育牦牛犊牛，能有效预防犊牛腹泻的发生[5]。杨俊仁等[6]发现在饲粮中添加益生菌可有效提高犊牛的生产性能，增加经济收益。因此，系统地开展不同培育方式(放牧和舍饲)下健康与腹泻牦牛犊牛肠道菌群组成特征分析，能为牦牛犊牛培育关键期的营养调控与优良益生菌的筛选提供重要依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及饲养管理2020年8月，在青海省海北州海晏县青海湖牦牛繁育养殖专业合作社选取3月龄、体重[(45.00±5.00) kg]相近的放牧牦牛犊牛(公)12头，其中6头为健康犊牛，6头为腹泻犊牛，在天然草场进行放牧饲养，犊牛自由饮水，每日注意观察犊牛的排粪情况，放牧条件下的犊牛所采食牧草根据犊牛的行动轨迹来获得，由高山嵩草、垂穗披碱草、草地早熟禾、多裂委陵菜、翠雀花等组成；同时，在海晏县西海镇海北高原现代生态畜牧业科技试验示范园选取3月龄、体重[(42.00±5.00) kg]相近的舍饲牦牛犊牛(公)12头，其中6头为健康犊牛，6头为腹泻犊牛，采用单栏饲养，代乳粉每日早、晚各饲喂1次，在饲喂代乳粉的基础上补喂开食料和苜蓿干草(开食料∶苜蓿干草=1 ∶ 1)。代乳粉主要由全脂奶粉、乳清粉、浓缩蛋白、生物素、烟酸、微量元素、赖氨酸、蛋氨酸、维生素A、维生素D、维生素E等组成；开食料主要由玉米、豆粕、膨化大豆、麸皮、乳清粉、细石粉、预混料、脂肪粉、磷酸氢钙、食盐等组成。代乳粉、开食料和苜蓿干草营养成分含量见表 1，放牧犊牛牧草营养水平与舍饲犊牛饲粮组成及营养水平见表 2。
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表 1 代乳粉、开食料和苜蓿干草营养成分含量(干物质基础) Table 1 Nutrient component contents of milk replacer, starter feed and alfalfa hay (DM basis) |
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表 2 放牧犊牛牧草营养水平与舍饲犊牛饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Nutrient levels of forage grass for grazing calves, and composition and nutrient levels of the diet for stall-feeding calves (air-dry basis) |
健康和腹泻犊牛粪便的采集均采用直肠取粪法。分别采集放牧条件下健康犊牛粪便样品(FZ01、FZ02、FZ03、FZ04、FZ05、FZ06)和腹泻犊牛粪便样品(FX01、FX02、FX03、FX04、FX05、FX06)各6份；同时，采集舍饲条件下健康犊牛粪便样品(SZ01、SZ02、SZ03、SZ04、SZ05、SZ06)和腹泻犊牛粪便样品(SX01、SX02、SX03、SX04、SX05、SX06)各6份。粪便样品采集后立即放入液氮罐中保存，带回实验室后转入-80 ℃冰箱中保存待测。
犊牛腹泻参照郭文杰[5]提到的粪便评分来评定，具体评分标准为：形态正常，外观较硬，评分1分；形态成形，外观较软，评分2分；形态不成形，外观呈水样，评分3分；形态不成形，外观呈水样，黏液附着少量血丝，评分4分；形态不成形，外观呈水样，黏液附着大量血丝，评分5分。每天记录每头牛的评分，连续记录5 d，当粪便被评为3分及以上时则判定为腹泻。
1.3 样品处理与指标测定采用磁珠法和基因组DNA提取试剂盒提取牦牛犊牛粪便样品的细菌总DNA。具体操作为：在2 mL离心管加入样本0.3 g，再加入10 μL RNase A涡旋振荡混匀后70 ℃加热裂解15 min提高裂解效率，12 000 r/min离心1 min，移上清液(约500 μL)至新的2 mL离心管，后续步骤严格按试剂盒操作流程进行。将提取的高质量DNA样品送至北京诺和致源有限公司进行测序与分析。
1.4 数据处理与统计分析利用Uparse软件(v7.0.1001)对所有样本的全部有效片段进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单元(OTUs)。用Mothur方法与SILVA132的SSUrRNA数据库进行物种注释分析。使用MUSCLE软件进行快速多序列比对，Alpha多样性和Beta多样性分析均基于均一化处理化后的数据。使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Chao1、Shannon、Simpson和ACE指数，Alpha多样性指数使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，以P < 0.05作为显著性差异的标准，使用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释曲线；使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Unifrac距离，使用R软件(Version 2.15.3)绘制主成分分析(PCoA)图；门水平和属水平的菌群组成组间差异性通过t-检验(t-test)分析得出。
2 结果与分析 2.1 放牧和舍饲条件下健康与腹泻牦牛犊牛肠道菌群Alpha多样性的比较由图 1可知，放牧条件下，健康和腹泻牦牛犊牛肠道菌群共有2 089个OTUs，健康牦牛犊牛独有380个OTUs，腹泻牦牛犊牛独有1 302个OTUs；舍饲条件下，健康和腹泻牦牛犊牛肠道菌群共有2 077个OTUs，健康牦牛犊牛独有532个OTUs，腹泻牦牛犊牛独有1 023个OTUs。由图 2可知，2种培育方式下健康与腹泻牦牛犊牛肠道菌群组成测序的稀释曲线到后期均趋于平缓，说明此次测序数据是合理的。
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FZ：放牧条件下的健康牦牛犊牛；FX：放牧条件下的腹泻牦牛犊牛；SZ：舍饲条件下的健康牦牛犊牛；SX：舍饲条件下的腹泻牦牛犊牛。下图同。 FZ: healthy yak calves under grazing condition; FX: diarrhea yak calves under grazing condition; SZ: healthy yak calves under stall-feeding condition; SX: diarrhea yak calves under stall-feeding condition. The same as below. 图 1 韦恩图 Fig. 1 Venn diagram |
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图 2 稀释曲线 Fig. 2 Dilution curv |
由表 3可知，在2种培育方式下，除ACE指数腹泻牦牛犊牛显著高于健康牦牛犊牛(P < 0.05)外，Shannon、Simpson和Chao1指数在健康与腹泻牦牛犊牛之间均无显著差异(P>0.05)，表明与健康牦牛犊牛相比，腹泻牦牛犊牛肠道菌群组成的物种丰富度更高；同时，Shannon和Simpson指数均表现为放牧牦牛犊牛显著高于舍饲牦牛犊牛(P < 0.05)，表明与舍饲牦牛犊牛相比，放牧牦牛犊牛肠道菌群组成的物种多样性更高。
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表 3 牦牛犊牛肠道菌群Alpha多样性比较 Table 3 Comparison of Alpha diversity of intestinal bacterial flora in yak calves |
由图 3所示，4组牦牛犊牛肠道菌群组成多样性存在一定差异，4组牦牛犊牛的肠道的主成分1(PC1)占总变异的24.17%，主成分2(PC2)占总变异的14.88%；2种培育方式下健康牦牛犊牛间、腹泻牦牛犊牛间都相对独立分开，表明肠道菌群组成的物种多样性差异较大；但同一种培育方式下的健康与腹泻牦牛犊牛间都有交叉，表明肠道菌群组成的物种多样性差异较小。
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图 3 PCoA图 Fig. 3 PCoA diagram |
对丰度排名前十的菌门进行分析，由图 4得知，牦牛犊牛肠道菌群中优势菌门有拟杆菌门(Bacteroidetes)(健康放牧犊牛为43.04%、腹泻放牧犊牛为38.87%、健康舍饲犊牛为55.87%、腹泻舍饲犊牛为54.68%)、厚壁菌门(Firmicutes)(健康放牧犊牛为48.79%、腹泻放牧犊牛为46.83%、健康舍饲犊牛为37.52%、腹泻舍饲犊牛为38.44%)、螺旋菌门(Spirochaetes)(健康放牧犊牛为0.37%、腹泻放牧犊牛为2.26%、健康舍饲犊牛为0.04%、腹泻舍饲犊牛为0.06%)、变形菌门(Proteobacteria)(健康放牧犊牛为0.74%、腹泻放牧犊牛为2.60%、健康舍饲犊牛为1.22%、腹泻舍饲犊牛为1.85%)、放线菌门(Actinobacteria)(健康放牧犊牛为0.22%、腹泻放牧犊牛为0.85%、健康舍饲犊牛为2.00%、腹泻舍饲犊牛为1.36%)、疣微菌门(Verrucomicrobia)(健康放牧犊牛为1.02%、腹泻放牧犊牛为1.23%、健康舍饲犊牛为0.09%、腹泻舍饲犊牛为0.06%)。根据图 5的t-test分析得知，放牧条件下腹泻牦牛犊牛肠道菌群组成中脱硫杆菌门(Desulfobacterota)的相对丰度显著高于健康牦牛犊牛(P < 0.05)。
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Bacteroidetes：拟杆菌门；Firmicutes：厚壁菌门；Spirochaetes：螺旋菌门；Proteobacteria：变形菌门；unidentified_Bacteria：未明确细菌；Actinobacteria：放线菌门；Verrucomicrobia：疣微菌门；Cyanobacteria：蓝藻菌门；Acidobacteriota：酸杆菌门；Euryarcheaota：广古菌门。 图 4 放牧与舍饲条件下健康与腹泻牦牛犊牛肠道菌群门水平相对丰度比较 Fig. 4 Comparison of relative abundances of intestinal bacterial flora at phylum level in healthy and diarrhea yak calves under grazing and stall-feeding conditions |
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图 5 脱硫杆菌门t-检验差异分析图 Fig. 5 Desulfobacterota t-test difference analysis diagram |
对丰度排名前30的菌属进行分析，由表 4和图 6可以看出，4组牦牛犊牛共有的优势菌属主要是拟杆菌属(Bacteroides)、UCG-005、理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、另枝菌属(Alistipes)、拟普氏菌属(Alloprevotella)、罗姆布茨菌属(Romboutsia)；在此基础上，放牧条件下克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)是优势菌属，且腹泻牦牛犊牛肠道菌群中巴氏杆菌属(Papillibacter)和Mailhella的相对丰度显著高于健康牦牛犊牛(P < 0.05)；舍饲条件下粪杆菌属是优势菌属，且腹泻牦牛犊牛肠道菌群中巴氏杆菌属和萨特氏菌属(Sutterella)的相对丰度显著高于健康牦牛犊牛(P < 0.05)。
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表 4 放牧与舍饲条件下健康与腹泻牦牛犊牛肠道菌群属水平相对丰度比较 Table 4 Comparison of relative abundances of intestinal bacterial flora at genus level in healthy and diarrhea yak calves under grazing and house feeding conditions |
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图 6 巴氏杆菌属、Mailhella和萨特氏菌属t-检验差异分析图 Fig. 6 Papillibacter, Mailhella and Sutterella t-test difference analysis diagram |
牦牛作为青藏高原上特有的优势反刍家畜，主要以放牧饲养为主，利用该地区天然草地牧草为藏族群众提供重要的生产和生活资料来源。牦牛肠道中有较多的纤维需要消化吸收，而肠道中本身不能产生分解纤维的相关酶，需要肠道中的细菌来产生，因此研究牦牛肠道中的菌群十分重要[7]。肠道是一个消化吸收营养物质的场所，关键在于其中的微生物，并且肠道中的微生物可以调控宿主的健康[8]。粪便菌群经常被用来代表肠道菌群[9]。目前对于牦牛犊牛肠道菌群的研究较少，本研究从放牧和舍饲2种培育方式下来分析牦牛犊牛的肠道菌群组成。郭仕辉[10]研究发现，与健康犊牛相比，腹泻犊牛粪便菌群的Shannon和Simpson指数均显著降低，但Chao1指数显著增加。在本试验中，从Alpha多样性分析可以看出，腹泻会导致牦牛犊牛肠道菌群组成发生变化，腹泻牦牛犊牛肠道菌群ACE指数显著高于健康牦牛犊牛，说明腹泻牦牛犊牛的肠道菌群物种丰富度更高；放牧牦牛犊牛肠道菌群Shannon和Simpson指数显著高于舍饲牦牛犊牛，说明放牧牦牛犊牛肠道菌群物种多样性更高。
3.2 放牧与舍饲条件下健康与腹泻牦牛犊牛肠道菌群门水平相对丰度比较分析有研究报道，肠道中的六大优势菌门分别是厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、梭杆菌门、疣微菌门，其中厚壁菌门和拟杆菌门数量最多最常见，占肠道菌群的90%[11]。厚壁菌门/拟杆菌门比值与维持体内平衡有关，厚壁菌门/拟杆菌门比值变化可导致肥胖或者炎症性肠病(IBD)，厚壁菌门/拟杆菌门比值上升，导致肥胖，厚壁菌门/拟杆菌门比值下降，导致IBD；大多数研究发现厚壁菌门能够更好的发酵和代谢碳水化合物[12]。本研究发现，放牧条件下牦牛犊牛肠道菌群中厚壁菌门/拟杆菌门比值≥1，说明放牧条件下的犊牛更容易发生肥胖，可能与夏天草场资源较丰富有关，也有可能是因为放牧条件下犊牛的营养来源均是牧草，导致厚壁菌门的数量增多，从而导致厚壁菌门/拟杆菌门比值上升；舍饲条件下牦牛犊牛肠道菌群中厚壁菌门/拟杆菌门比值≤1，说明舍饲条件下的犊牛容易发生IBD，可能是因为本次试验的舍饲犊牛是出生1月龄时从放牧条件下转为舍饲条件的，犊牛应激状态较为持久。拟杆菌门是降解饲料中非纤维性碳水化合物最重要的一种细菌[13]。本研究发现，对于拟杆菌门相对丰度，舍饲条件下健康牦牛犊牛比腹泻牦牛犊牛高出1.19%，放牧条件下健康牦牛犊牛比腹泻牦牛犊牛高出4.17%，说明无论哪种培育条件，腹泻均会使牦牛犊牛肠道菌群中拟杆菌门的数量下降，使得肠道菌群组成发生改变。有研究发现，当发生疾病时，肠道菌群逐渐由厚壁菌门转变为变形菌门[14]。在本试验中，对于变形菌门相对丰度，放牧条件下腹泻牦牛犊牛比健康牦牛犊牛高出1.86%，舍饲条件下腹泻牦牛犊牛比健康牦牛犊牛高出0.53%，说明腹泻让犊牛肠道中的优势菌群发生了改变。放线菌门可以分解多种有机物，可以利用不同的碳水化合物作为能源[15]。在本研究中，舍饲条件下的牦牛犊牛肠道菌群中放线菌门占总菌的比例大于放牧条件下，说明舍饲条件下的摄入的碳水化合物比放牧条件的高。有研究报道，疣微菌门在健康体重组儿童肠道内的数量显著高于肥胖组儿童[16]。本试验中，放牧条件下牦牛犊牛肠道菌群中疣微菌门的相对丰度大于舍饲条件下，且厚壁菌门/拟杆菌门比值也较高，可能说明放牧条件下牦牛犊牛生长发育较好，这可能是由于舍饲条件下的犊牛从放牧状态转到舍饲状态，应激状态较为持久，导致犊牛发育较为缓慢。
3.3 放牧与舍饲条件下健康与腹泻牦牛犊牛肠道菌群属水平相对丰度比较分析普雷沃氏菌和碳水化合物的发酵有一定的联系，普雷沃氏菌比例越高，底物发酵程度越高[17]。而在本试验中，放牧条件下健康牦牛犊牛肠道菌群中普雷沃氏菌科UCG-003和普雷沃氏菌科UCG-004的相对丰度高于腹泻牦牛犊牛，说明腹泻使得犊牛的肠道菌群组成发生了改变，影响了犊牛对营养物质的消化吸收。普雷沃氏菌属于拟杆菌门，可以高效降解半纤维素，水解蛋白质、淀粉、发酵糖和氨基酸[18-19]。陈熙[20]研究显示，患有肠道疾病、代谢紊乱的人群，艾克曼菌属丰度比正常人群低；当肥胖人群进行限制高热量饮食治疗时，艾克曼菌属丰度提高。本试验中，放牧条件下腹泻牦牛犊牛肠道菌群中艾克曼菌属相对丰度比健康牦牛犊牛高出0.99%。有研究报道，克里斯滕森菌科与健康参数的关联部分可能是由于它与高蛋白质和纤维饮食有关[21]。放牧条件下，克里斯滕森菌科R-7群是牦牛犊牛肠道菌群中的优势菌属，可能与放牧条件下牦牛犊牛的采食习性有关，放牧牦牛多以牧草为食，而牧草纤维含量较高。另枝菌属在肠道或免疫系统的成熟等方面有巨大的潜力，但是还需要更多的研究来确定另枝菌属的细菌脂质的生化和功能作用[22]。普氏菌属促进蛋白质分解并且协同一些分解纤维素的菌种发挥作用，以此提高机体对纤维素的分解能力[23]。在舍饲条件下，瘤胃中普氏菌属相对丰度显著升高，而这主要是由于拟杆菌门相对丰度的提高[24]，从门水平来看，本次试验中舍饲条件下牦牛犊牛肠道菌群中拟杆菌门的相对丰度高于放牧条件下，也就导致了舍饲条件下的普氏菌属相对丰度高于放牧条件下；在刘佳星的报道中发现，四神丸组会让腹泻型肠易激综合征大鼠的肠道菌群中的罗姆布茨菌属和苏黎世杆菌属丰度显著增加[25]；而在本试验中发现，舍饲条件下的牦牛犊牛肠道中罗姆布茨菌属和苏黎世杆菌属相对丰度都较高，说明舍饲条件下的牦牛犊牛可能存在一些潜在的炎症。拟普氏菌属属于拟杆菌门，是琥珀酸和醋酸的高产菌[26-27]，并且高水平的琥珀酸会引起炎症、组织损伤和癌变[28-29]，而高浓度的醋酸会诱导结肠炎[30]。本试验结果显示，放牧条件下牦牛犊牛拟普氏菌属的相对丰度较高，说明放牧条件下的腹泻情况较为严重，需要及时治疗。研究发现，萨特氏菌属的丰度和炎症细胞因子水平呈负相关，萨特氏菌属是变形菌门中最丰富的菌属之一。本试验中，舍饲条件下腹泻牦牛犊牛的变形菌门相对丰度比健康牦牛犊牛高0.63%，而萨特氏菌属则显著高于健康牦牛犊牛，说明萨特氏菌属是舍饲条件下引起牦牛犊牛腹泻的另一个重要原因。
引起巴氏杆菌病的病原体是多杀性巴氏杆菌[31]，多杀性巴氏杆菌会引起出血性败血症，感染动物的呼吸道[32]，临床表现为高热，排出流状粪便，粪便中带有黏液和血液，气味难闻等症状[33]。在本试验中发现，无论是在放牧条件下还是舍饲条件下，腹泻牦牛犊牛的巴氏杆菌属相对丰度均显著高于健康牦牛犊牛，说明在这2种培育方式下巴氏杆菌属是引起牦牛犊牛腹泻的原因。
4 结论本试验结果表明，随母哺乳放牧与舍饲代乳2种培育方式下牦牛犊牛肠道菌群的多样性和丰富度差异较大，且2种培育方式下健康与腹泻牦牛犊牛肠道菌群组成在属水平存在一定差异，但无论是在放牧还是舍饲条件下，腹泻牦牛犊牛肠道菌群中的巴氏杆菌属的相对丰度均显著高于健康牦牛犊牛，说明巴氏杆菌属是2种培育方式下引起牦牛犊牛发生腹泻的共有特征。
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