动物营养学报    2022, Vol. 34 Issue (7): 4704-4715    PDF    
21日龄仔猪断奶过程不同肠段细胞外基质重要蛋白表达规律的研究
唐青松1,2 , 王丽1 , 徐娥2 , 刘春艳1 , 肖明飞1,2 , 肖昊1 , 吴绮雯1 , 蒋宗勇1 , 易宏波1     
1. 广东省农业科学院动物科学研究所, 畜禽育种国家重点实验室, 农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室, 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心, 广东省畜禽育种与营养研究重点实验室, 广州 510640;
2. 贵州大学动物科学学院, 动物营养与饲料研究所, 贵阳 550025
摘要: 本试验旨在研究21日龄仔猪断奶过程不同肠段细胞外基质(ECM)重要蛋白的表达规律。选用24头21日龄的断奶仔猪随机分配到6个栏中,分别于断奶后0、7、14和28 d每栏随机选择1头仔猪进行麻醉后处死,采集十二指肠、空肠和回肠样品,测定ECM相关基因和蛋白的表达量。结果表明:1)与0 d相比,7、14和28 d十二指肠Ⅰ型胶原蛋白α2链(COL1A2)、Ⅲ型胶原蛋白α1链(COL3A1)、Ⅳ型胶原蛋白α2链(COL4A2)、Ⅴ型胶原蛋白α1链(COL5A1)、Ⅵ型胶原蛋白α1链(COL6A1)、纤维黏连蛋白1(FN1)、肌腱蛋白C(TNC)和整合素α1(ITGA1)的mRNA相对表达量显著降低(P < 0.05),且14 d十二指肠COL1A2和FN1的mRNA相对表达量显著低于28 d(P < 0.05),14 d十二指肠COL3A1的mRNA相对表达量显著低于7和28 d(P < 0.05),7 d十二指肠整合素β2(ITGB2)的mRNA相对表达量显著低于14和28 d(P < 0.05)。2)与0 d相比,7、14和28 d空肠COL1A2、COL3A1、COL4A2和ITGA1的mRNA相对表达量显著降低(P < 0.05),且7 d空肠COL5A1和COL6A1的mRNA相对表达量显著低于0和28 d(P < 0.05),7 d空肠TNCITGB2的mRNA相对表达量显著低于28 d(P < 0.05)。3)7 d回肠FN1的mRNA相对表达量显著低于0、14和28 d(P < 0.05)。4)与0 d相比,7、14和28 d空肠COL1A2和Ⅵ型胶原蛋白的蛋白相对表达量显著降低(P < 0.05),14和28 d空肠COL4A2、层黏连蛋白和FN1的蛋白相对表达量显著降低(P < 0.05)。综上所述,仔猪断奶后十二指肠和空肠的胶原蛋白(COL1A2、COL3A1、COL4A2、COL5A1、COL6A1和Ⅵ型胶原蛋白)、FN1、层黏连蛋白、TNCITGA1和ITGB2的表达和分泌降低;十二指肠COL1A2、COL3A1和FN1的mRNA相对表达量在断奶后14 d降到最低,空肠COL5A1和COL6A1的mRNA相对表达量在断奶后7 d降到最低;仔猪断奶后7 d回肠FN1的mRNA相对表达量显著降低,但断奶对其他ECM相关基因表达无显著影响。
关键词: 断奶仔猪    细胞外基质    胶原蛋白    表达规律    
Study on Expression Regularity of Important Proteins in Extracellular Matrix of Different Intestinal Segments during Weaning of 21-Day-Old Piglets
TANG Qingsong1,2 , WANG Li1 , XU E2 , LIU Chunyan1 , XIAO Mingfei1,2 , XIAO Hao1 , WU Qiwen1 , JIANG Zongyong1 , YI Hongbo1     
1. Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Maoming Branch of Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture Science and Technology, Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding, Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China;
2. Institute of Animal Nutrition and Feed Science, College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China
Abstract: The purpose of this experiment was to study the expression regularity of important proteins in the extracellular matrix (ECM) of different intestinal segments during weaning of 21-day-old piglets. Twenty-four piglets weaned at 21 days of age were randomly assigned into six pens. One pig was randomly selected from each pen at 0, 7, 14 and 28 days after weaned and executed after anesthesia, and then the samples of duodenum, jejunum and ileum were collected to determine the expression levels of ECM related genes and proteins. The results showed as follows: 1) compared with 0 d, the mRNA relative expression levels of type Ⅰ collagen α2 chain (COL1A2), type Ⅲ collagen α1 chain (COL3A1), type Ⅳ collagen α2 chain (COL4A2), type Ⅴ collagen α1 chain (COL5A1), type Ⅵ collagen α1 chain (COL6A1), fibronectin 1 (FN1), tenascin C (TNC) and integrin α1 (ITGA1) in duodenum at 7, 14 and 28 d were significantly decreased (P < 0.05). Moreover, the mRNA relative expression levels of COL1A2 and FN1 in duodenum were significantly decreased at 14 d compared with 28 d (P < 0.05), and the COL3A1 mRNA relative expression level in duodenum was significantly lower at 14 d than that at 7 and 28 d (P < 0.05), and the integrin β2 (ITGB2) mRNA relative expression level in duodenum at 7 d was lower than that at 14 and 28 d (P < 0.05). 2) Compared with 0 d, the mRNA relative expression levels of COL1A2, COL3A1, COL4A2, and ITGA1 in jejunum at 7, 14 and 28 d were significantly decreased (P < 0.05). Additionally, the mRNA relative expression levels of COL5A1 and COL6A1 in jejunum were significantly lower at 7 d than those at 0 and 28 d (P < 0.05), and the mRNA relative expression levels of TNC and ITGB2 in jejunum at 7 d were significantly lower than that at 28 d (P < 0.05). 3) The FN1 mRNA relative expression level in ileum at 7 d was significantly lower than that at 0, 14 and 28 d (P < 0.05). 4) Compared with 0 d, the protein relative expression levels of COL1A2 and type Ⅵ collagen in jejunum at 7, 14 and 28 d were significantly decreased (P < 0.05), and the protein relative expression levels of COL4A2, laminin and FN1 in jejunum at 14 and 28 d were significantly decreased (P < 0.05). In conclusion, the expression and secretion of collagen (COL1A2, COL3A1, COL4A2, COL5A1, COL6A1 and type Ⅵ collagen), FN1, laminin, TNC, ITGA1 and ITGB2 are decreased in duodenum and jejunum of piglets after weaning; the mRNA relative expression levels of COL1A2, COL3A1 and FN1 in duodenum are the lowest at 14 d after weaning, and the mRNA relative expression levels of COL5A1 and COL6A1 in jejunum are the lowest at 7 d after weaning; the FN1 mRNA relative expression in ileum at 7 d after weaning is significantly decreased, but weaning has no significant effect on the expression of other ECM-related genes.
Key words: weaned piglets    extracellular matrix    collagen    expression regularity    

仔猪早期断奶易引起肠道功能受损和生长迟缓,肠道健康问题导致的断奶后仔猪死亡率为6%~10%,有时甚至高达20%[1]。过去数十年,科学研究者们对肠道功能的研究主要聚焦于肠黏膜上层(上皮细胞、紧密连接蛋白、黏液素、分泌型免疫球蛋白和抗菌肽等),然而对肠道黏膜下层细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的变化知之甚少。ECM主要由胶原蛋白(collagen)、纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)、层黏连蛋白(laminin)、肌腱蛋白(tenascin,TN)以及蛋白聚糖/氨基聚糖等组成[2]。其中,胶原蛋白分子通过1/4的错位排布构成纤维状结构,与ECM分子相互连接构成复杂的三维矩阵网络[3],构成黏膜下层重要的物理屏障。整合素(integrin)是一种普遍存在于动物细胞表面的跨膜异质二聚体,由α和β亚基组成,是ECM之间、细胞与ECM之间的相互识别和黏附的关键分子[4]。ECM为组织形态提供重要的结构支撑,且参与细胞黏附、趋化、组织修复和维持动物机体正常稳态等生理过程[5]。此外,ECM是宿主细胞和病原体之间的重要屏障,且大多数免疫调节反应均在ECM网络构成的宿主细胞微环境中进行[6-7]。研究报道,破坏秀丽隐杆线虫基底膜ECM会加剧上皮细胞自噬[8]。果蝇肠道基底层Ⅳ型胶原蛋白突变会引起肠上皮细胞变性和肠功能异常[9]。此外,小鼠肠道整合素基因的敲除会引发肠道炎症[10-11]。由此可见,ECM对动物肠道功能及健康有着重要的调控作用。然而,ECM在仔猪肠道上的研究还未被引起重视,尤其是仔猪断奶的关键阶段的变化规律至今还未见相关报道。因此,本试验旨在研究不同日龄断奶仔猪肠道ECM的表达规律,为断奶仔猪肠道ECM的调控研究提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验设计和样品采集

试验选用24头健康和体况相近的21日龄“杜洛克×长白×大白”三元杂交断奶仔猪,随机分配到6个栏中,每栏4头。试验期间所有仔猪自由采食商品饲粮和自由饮水,免疫程序与保健等程序均保持一致。分别于试验开始时(断奶后0 d)、断奶后7 d、断奶后14 d、断奶后28 d从每个重复栏中随机选择1头仔猪进行麻醉后处死。剖开仔猪腹腔后仔细收集近端十二指肠、中段空肠和远端回肠约1.5 cm的组织样品,完全浸泡于4%的多聚甲醛中,用于制作Masson染色切片。取近端十二指肠、中段空肠和远端回肠肠段剪开,用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗内容物后保存于2 mL冻存管,液氮速冻,转移至-80 ℃冰箱保存待测。

1.2 Masson染色

保存于固定液(4%多聚甲醛)的肠道组织样品经脱水、石蜡包埋、切片和脱蜡后,切片经Masson染液套装(Servicebio,中国)进行染色,然后脱水和中性树胶封片成片。使用Axio Scope A1显微镜(Zeiss,德国)观察切片图像,采用Image-Pro软件(Media Cybernetics,美国)采集40倍和200倍放大的图像。

1.3 免疫荧光

Masson染色中制作的蜡块经切片、脱水、抗原修复和画圈后,用牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)孵育30 min,弃掉封闭液后滴加已稀释的一抗[Ⅰ型胶原蛋白α2链(COL1A2)、Ⅳ型胶原蛋白α2链(COL4A2)、Ⅵ型胶原蛋白(collagen Ⅵ)]4 ℃孵育过夜,玻片置于PBS中在脱色摇床上洗涤3次,每次5 min。稍甩干后滴加已稀释的二抗,室温孵育50 min,滴加4’, 6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)染液后避光孵育10 min,滴加自发荧光淬灭剂后冲洗10 min,洗涤3次后的切片用抗荧光淬灭封片剂封片。使用Zeiss LSM710激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss,德国)获取图像。

1.4 RNA提取和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

按照Trizol试剂盒(Invitrogen,美国)说明提取十二指肠、空肠和回肠组织样品总RNA,用超微量紫外分光光度计NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific,美国)评估总RNA的浓度和纯度。将1 μg的总RNA使用反转录试剂盒(TaKaRa,日本)逆转录得到20 μL的第1链cDNA,加入180 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水10倍稀释用于qRT-PCR。qRT-PCR(CFX System,Bio-Rad,美国)体系为10.0 μL:5.0 μL的iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad,美国),10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL,4.0 μL的cDNA。扩增程序为:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,39个循环。引物序列根据NCBI中猪的基因序列,使用Primer Premier 5.0(Premier,加拿大)进行设计,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。本研究检测的靶基因和管家基因——β-肌动蛋白(β-actin)的引物序列见表 1。采用2-ΔΔCt法计算靶基因的mRNA相对表达量,0 d表达量设为1.0。

表 1 qRT-PCR引物序列 Table 1 Primer sequences for qRT-PCR
1.5 Western blot分析

将大约100 mg的空肠组织样加入1 mL的放射免疫沉淀法缓冲液(RIPA)裂解液,裂解液中提前加入100×的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。冰上放置30 min,10 000×g离心5 min,转移上清液。稀释10倍的上清液使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白试剂盒(Thermo Fisher Scientific,美国)检测蛋白浓度。等量的蛋白中加入5×上样缓冲液(Biosharp,中国),100 ℃变性8 min。取大约30 μg的蛋白质使用7%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,然后转移到聚偏二氟乙烯(PDVF)膜上,使用5%BSA封闭1 h。一抗4 ℃孵育过夜,二抗常温孵育1 h。一抗COL1A2(ab96723)、COL4A2(ab125208)、Ⅵ型胶原蛋白(ab6588)、层黏连蛋白(ab11575)、纤维黏连蛋白1(fibronectin 1,FN1)(ab6328)和β-肌动蛋白(ab8226)购至Abcam公司。使用Clarity Western ECL Substrate(Bio-Rad,美国)检测蛋白条带,采用ImageJ软件(National Institutes of Health,美国)分析条带蛋白灰度值。

1.6 数据统计分析

使用Excel 2019对数据进行初步整理,采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),并用最小显著性(LSD)法进行多重比较,结果以“平均值和标准误”表示,P < 0.05为差异显著,P < 0.01为差异极显著。

2 结果与分析 2.1 不同日龄断奶仔猪肠道胶原蛋白的分布

本试验使用Masson染色分析了断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠的胶原蛋白纤维分布情况。结果表明,十二指肠中胶原蛋白纤维主要存在于肠黏膜下层,呈纤维状穿插于弥散淋巴组织之间,黏膜上层胶原蛋白纤维含量较少(图 1);空肠胶原蛋白纤维主要分布于肠黏膜下层,肠黏膜上层有少量胶原蛋白纤维存在(图 2);回肠具有比十二指肠和空肠更加丰富的胶原蛋白纤维,整体呈树状且主要分布于集合淋巴结之间(图 3)。

0 d:断奶后0 d;7 d:断奶后7 d;14 d:断奶后14 d;28 d:断奶后28 d。下图同。 0 d: 0 day after weaned; 7 d: 7 days after weaned; 14 d: 14 days after weaned; 28 d: 28 days after weaned. The same as below. 图 1 断奶仔猪十二指肠胶原纤维的Masson染色 Fig. 1 Masson staining of collagen fibers in duodenum of weaned piglets
图 2 断奶仔猪空肠胶原纤维Masson染色 Fig. 2 Masson staining of collagen fibers in jejunum of weaned piglets
图 3 断奶仔猪回肠胶原纤维Masson染色 Fig. 3 Masson staining of collagen fibers in ileum of weaned piglets
2.2 不同日龄断奶仔猪十二指肠ECM相关基因的表达规律

图 4所示,与0 d相比,7、14和28 d断奶仔猪十二指肠COL1A2、Ⅲ型胶原蛋白α1链(COL3A1)、COL4A2、Ⅴ型胶原蛋白α1链(COL5A1)、Ⅵ型胶原蛋白α1链(COL6A1)和肌腱蛋白C(TNC)的mRNA相对表达量极显著降低(P < 0.01);28 d十二指肠COL1A2和COL3A1的mRNA相对表达量极显著高于14 d(P < 0.01);14 d十二指肠COL3A1的mRNA相对表达量显著低于7 d(P < 0.05)。与0 d相比,7和14 d断奶仔猪十二指肠FN1和整合素α1(ITGA1)的mRNA相对表达量极显著降低(P < 0.01),28 d十二指肠FN1和ITGA1的mRNA相对表达量显著降低(P < 0.05);28 d十二指肠FN1的mRNA相对表达量显著高于14 d(P < 0.05)。与0 d相比,14 d断奶仔猪十二指肠整合素β2(ITGB2)的mRNA相对表达量显著提高(P < 0.05);14和28 d十二指肠ITGB2的mRNA相对表达量分别极显著(P < 0.01)和显著(P < 0.05)高于7 d。

与0 d相比,数据柱标记*表示差异显著(P < 0.05),数据柱标记* *表示差异极显著(P < 0.01);#表示7、14和28 d之间差异显著(P < 0.05),##表示7、14和28 d之间差异极显著(P < 0.01)。下图同。 Compared with 0 d, data columns marked with * indicated significant difference (P < 0.05), and marked with * * indicated extremely significant difference (P < 0.01). # represented significant difference among 7, 14 and 28 d (P < 0.05), and ## represented extremely significant difference among 7, 14 and 28 d (P < 0.01). The same as blow. 图 4 断奶仔猪十二指肠ECM相关基因的表达规律 Fig. 4 Expression regularity of ECM-related genes in duodenum of weaned piglets
2.3 不同日龄断奶仔猪空肠ECM相关基因的表达规律

图 5所示,与0 d相比,7 d断奶仔猪空肠COL1A2的mRNA相对表达量显著降低(P < 0.05),14和28 d空肠COL1A2的mRNA相对表达量极显著降低(P < 0.01);7、14和28 d空肠COL3A1的mRNA相对表达量极显著降低(P < 0.01),且28 d空肠COL3A1的mRNA相对表达量显著低于7 d(P < 0.05);7和14 d空肠COL4A2的mRNA相对表达量显著降低(P < 0.05),且28 d空肠COL4A2的mRNA相对表达量极显著降低(P < 0.01);7 d空肠COL5A1和COL6A1的mRNA相对表达量分别显著(P < 0.05)和极显著(P < 0.01)降低,28 d空肠COL5A1和COL6A1的mRNA相对表达量显著高于7 d(P < 0.05);14和28 d空肠FN1的mRNA相对表达量分别显著(P < 0.05)和极显著(P < 0.01)降低,且28 d空肠FN1的mRNA相对表达量显著低于7 d(P < 0.05);28 d空肠TNCITGB2的mRNA相对表达量极显著高于7 d(P < 0.01),且28 d空肠ITGB2的mRNA相对表达量极显著高于14 d(P < 0.01);7和14 d空肠ITGA1的mRNA相对表达量显著降低(P < 0.05),28 d空肠ITGA1的mRNA相对表达量极显著降低(P < 0.01),且显著低于7和14 d(P < 0.05)。

图 5 断奶仔猪空肠ECM相关基因的表达规律 Fig. 5 Expression regularity of ECM-related genes in jejunum of weaned piglets
2.4 不同日龄断奶仔猪回肠ECM相关基因的表达规律

图 6所示,与0 d相比,7 d断奶仔猪回肠FN1的mRNA相对表达量极显著降低(P < 0.01),且14 d和28 d回肠FN1的mRNA相对表达量分别显著(P < 0.05)和极显著(P < 0.01)高于7 d。断奶仔猪回肠COL1A2、COL3A1、COL4A2、COL5A1、COL6A1、TNCITGA1和ITGB2的mRNA相对表达量在各个时间点之间均无显著性差异(P>0.05)。

图 6 断奶仔猪回肠ECM相关基因的表达规律 Fig. 6 Expression regularity of ECM-related genes in ileum of weaned piglets
2.5 不同日龄断奶仔猪空肠ECM相关蛋白的表达规律与免疫荧光分析

不同肠段中,断奶对仔猪十二指肠ECM相关蛋白的影响最大,其次是空肠,对回肠影响最小。本试验采用空肠组织测定ECM相关蛋白的表达规律,如图 7所示,与0 d相比,14和28 d断奶仔猪空肠COL1A2、COL4A2和Ⅵ型胶原蛋白的蛋白相对表达量显著降低(P < 0.05),7 d空肠COL1A2和Ⅵ型胶原蛋白的蛋白相对表达量分别极显著(P < 0.01)和显著(P < 0.05)降低;14和28 d空肠层黏连蛋白的蛋白相对表达量分别显著(P < 0.05)和极显著(P < 0.01)降低,且28 d空肠层黏连蛋白的蛋白相对表达量显著低于7 d(P < 0.05);14和28 d空肠FN1的蛋白相对表达量极显著降低(P < 0.01),且14 d空肠FN1的蛋白相对表达量显著低于7 d(P < 0.05)。

A为空肠蛋白条带;B、C、D、E和F依次分别为COL1A2、COL4A2、Ⅵ型胶原蛋白、层黏连蛋白和FN1的蛋白条带灰度值分析;G为空肠免疫荧光,图片放大倍数为200。 A was protein bands in jejunum; B, C, D, E and F were protein gray value analysis of COL1A2, COL4A2, collagen Ⅵ, laminin and FN1, respectively; G was immunofluorescence image of jejunum, and the image magnification was 200. 图 7 断奶仔猪空肠ECM相关蛋白的表达规律 Fig. 7 Expression regularity of ECM-related proteins in jejunum of weaned piglets
3 讨论

ECM为组织形态提供重要的结构支撑,且参与细胞黏附、趋化、组织修复和维持机体正常稳态等生理过程。研究报道,ECM的过度沉积会导致肠道纤维化、炎症以及癌细胞转移增加等病理现象[5, 12-14]。然而,最近研究发现,适当的ECM有助于动物的肿瘤免疫[15-16]。因此,ECM是断奶仔猪肠道功能的重要评价指标。本试验结果显示,断奶会降低仔猪十二指肠和空肠胶原蛋白(COL1A2、COL3A1、COL4A2、COL5A1、COL6A1和Ⅵ型胶原蛋白)、FN1、层黏连蛋白、TNCITGA1和ITGB2的表达和分泌,并且降低了断奶后7 d回肠FN1的表达。

胶原蛋白是ECM的主要组成成分,占哺乳动物体内总蛋白的25%~35%[17]。迄今为止,脊椎动物已发现28种不同类型的胶原蛋白,Ⅰ型胶原蛋白是动物最丰富的胶原蛋白,约占总胶原蛋白的90%[17-18]。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ型和Ⅵ型胶原蛋白是典型的纤维形成胶原蛋白,能够组装形成具有特征性的1/4交错排列的纤维矩阵网络[3]。Ⅳ型胶原蛋白是网状结构胶原蛋白,负责稳定整体ECM网络结构[3]。本试验利用Masson染色分析了断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠的胶原蛋白纤维分布情况,结果发现十二指肠、空肠和回肠中胶原蛋白纤维主要分布于肠黏膜下层,肠黏膜上层胶原蛋白纤维分布较少,且回肠具有比十二指肠和空肠更加丰富的胶原蛋白纤维,整体呈树状且主要分布于集合淋巴结之间。本试验空肠的免疫荧光显示,COL1A2主要呈小点状分布于肠道黏膜上层,COL4A2呈纤维状分布于肠黏膜下层,而Ⅵ型胶原蛋白在肠黏膜上层和下层均有较多分布,我们猜测Ⅵ型胶原蛋白可能是仔猪肠道中存在的主要胶原蛋白类型。Ⅵ型胶原蛋白是由3条不同的α链组成的三聚体,具有独特的微纤维网络结构[3];Ⅵ型胶原蛋白中还存在参与蛋白质互作的von Willebrand结构域[19],但其具体的生物学功能至今仍然还未见报道。

胶原蛋白能够调节动物肠道形态和肠道屏障功能,并在肠道组织免疫微环境中发挥重要作用[20]。近年研究发现,Ⅳ型胶原蛋白突变会引起果蝇肠上皮细胞变性、肠功能肠道障碍和形态异常[9]。本试验结果发现,仔猪断奶后7、14和28 d十二指肠COL4A2、COL5A1和COL6A1的mRNA相对表达量均极显著降低,且COL1A2和COL3A1的mRNA相对表达量均在断奶后14 d最低,呈现出随着时间的推移先降低后升高的趋势。在空肠中,COL1A2、COL3A1和COL4A2的mRNA相对表达量均随着断奶后时间的推移而更为显著降低,但COL5A1和COL6A1的mRNA相对表达量在断奶后7 d最低,呈现先降低后升高的趋势。研究报道,对160个猪场的12 034头仔猪进行28 d的统计调查发现,断奶后3~4 d仔猪开始腹泻,断奶后7~9 d腹泻最为严重,断奶后21 d仍然有很高的腹泻率[21]。这与本试验肠道胶原蛋白的变化较为一致,尤其是十二指肠中的COL1A2和COL3A1和空肠中的COL5A1和COL6A1的mRNA表达变化,这可能是导致ECM变化的一个重要原因。然而,仔猪断奶对回肠胶原蛋白mRNA表达没有显著性影响,这可能与回肠末端组织较为钝化有关。此外,空肠COL1A2、COL4A2和Ⅵ型胶原蛋白的蛋白表达结果显示,仔猪断奶后7~28 d空肠COL1A2和Ⅵ型胶原蛋白的蛋白相对表达量均显著降低,而空肠COL4A2的蛋白相对表达量仅在断奶后14和28 d显著降低,这与基因表达结果基本相似。以上结果表明,断奶应激可能会降低断奶仔猪空肠胶原蛋白的表达和分泌。

FN和层黏连蛋白是ECM的重要组成部分,属于非胶原糖蛋白,它们具有既可与细胞结合,又可与ECM其他大分子结合的共同特点[3]。TNC是一种六聚体大分子ECM糖蛋白,是动物组织炎症、机械应变、损伤和形成之间的汇聚节点[22-23]。本试验结果发现,仔猪断奶后十二指肠FN1和TNC的mRNA相对表达量显著降低,断奶后14和28 d空肠FN1的mRNA相对表达量显著降低,回肠FN1的mRNA相对表达量在断奶后4 d降到最低后在14和28 d恢复到未断奶时的水平。空肠FN1蛋白表达与mRNA表达结果趋势相似。另外,本研究还检测了层黏连蛋白的蛋白表达,其相对表达量同样是在断奶后14和28 d显著降低。以往研究表明,FN1的表达上调会通过增加甲基化而降低蛋白酪氨酸磷酸酶受体M型,进而导致转录蛋白信号转导器和激活子3磷酸化增加,促进恶性胶质肿瘤细胞增殖[24]。此外,TNC被成纤维细胞和免疫细胞广泛分泌会引起动物炎症疾病[25],且通过激活细胞因子参与组织损伤[26]。即使目前大多研究表明,FN1、层黏连蛋白和TNC的表达增多会导致组织损伤和肿瘤等疾病,但本试验中胶原蛋白、FN1、层黏连蛋白和TNC的表达在断奶后却降低了,这提示断奶仔猪肠道ECM的降低另有其因,这仍需未来加以深入研究。

整合素是ECM分子之间和ECM与细胞之间的重要连接分子。整合素是具有二聚体的跨膜蛋白,一端连接胞内的微丝,另一端跨膜连接胞外已固定在胶原蛋白纤维上的FN[27]。ITGA1和ITGB2是整合素的2个重要配体。本试验结果发现,断奶后7~28 d十二指肠ITGA1的mRNA相对表达量均显著降低,但断奶后14 d十二指肠ITGB2的mRNA相对表达量却显著提高。此外,断奶后7~28 d空肠ITGA1的mRNA相对表达量均显著降低,断奶没有引起空肠ITGB2的mRNA表达的变化,但相比断奶后28 d与7 d和14 d相比极显著提高。以往研究表明,敲除小鼠整合素基因会引起肠道炎症和肠通透性增加[11]。此外,整合素与FN、层黏连蛋白等ECM相关蛋白在限制和促进猪流行性腹泻病毒感染中具有重要调控作用[28]。由此可见,整合素与ECM分子相互依存并发挥屏障和免疫调控作用,这与本试验胶原蛋白和FN、层黏连蛋白和TNC的表达较为一致。

4 结论

① 不同日龄断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠中胶原蛋白纤维主要分布于肠黏膜下层,肠黏膜上层胶原蛋白纤维分布较少,且回肠具有比十二指肠和空肠更加丰富的胶原蛋白纤维。

② 仔猪断奶后十二指肠和空肠的胶原蛋白(COL1A2、COL3A1、COL4A2、COL5A1、COL6A1和Ⅵ型胶原蛋白)、FN1、层黏连蛋白、TNCITGA1和ITGB2的表达和分泌降低;十二指肠COL1A2、COL3A1和FN1的mRNA相对表达量在断奶后14 d降到最低,空肠COL5A1和COL6A1的mRNA相对表达量在断奶后7 d降到最低;仔猪断奶后7 d回肠FN1的mRNA相对表达量显著降低,但断奶对其他ECM相关基因表达无显著影响。

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