牦牛是牛属动物中的特有牛种,主要生活在高原寒冷气候的环境中[1]。我国牦牛存栏量占世界牦牛养殖总量的92%左右,主要分布于青海、西藏、四川等地,是当地的产业支柱[2-3]。但迄今为止,高原牦牛饲养模式大多为传统的放牧方式。高原地区冷季放牧期长达8个月,寒冷的气候致使牧草的产量和营养价值下降,而且适口性很差[4]。冷季期牦牛摄食不足使其遭受着冷季饥饿问题。本课题组前期研究发现,1个冷季枯草期牦牛体重下降达30%左右[5]。因此,冷季饥饿是目前牧区放牧牦牛面临的主要问题。饥饿时机体的补偿机制被激活,大量动员机体脂肪等体贮以维持生命,体脂动员是动物应对饥饿等逆境条件的生物适应机制[6],脂肪组织是机体主要的可逆的能量贮存器官[7],饥饿状态下,脂肪分解供能生成酮体[8-9],其中超过70%为β-羟基丁酸(BHBA),乙酰乙酸占比约30%,另有少量的丙酮。动物在饥饿胁迫下,BHBA是产生的最主要的酮体,不仅是脂肪降解的重要产物,还能够作为能源物质在肌肉和大脑等重要组织器官氧化供能,同时还能够参与乳脂的合成[10-13]。研究发现,BHBA可作为动物饥饿应激下的信号物质[14],影响胰岛素的分泌,并产生胰岛素抵抗,还可反馈调节机体脂肪代谢[15]。脂联素(ADPN)是调节机体“脂肪稳恒”的重要脂肪因子[16],近年来有研究表明,在人和鼠脂肪细胞的细胞膜上,BHBA的受体G蛋白偶联受体109A(GPR109A)活性与表达量同脂肪细胞分泌的ADPN具有很大联系,GPR109A基因被敲除的小鼠,其血液中ADPN浓度没有发生变化[17],此研究结果表明BHBA与GPR109A结合后可显著提高血液中ADPN的浓度。动物通过长期进化,形成了一种应对饥饿胁迫的适应机制,其脂肪细胞会分泌ADPN以应对饥饿胁迫[18]。因此,饥饿时酮体BHBA会开始调节机体ADPN的基因表达和分泌过程,从而进一步影响机体的脂肪代谢进程,同时,酮体BHBA在能量储存与消耗方面也具有十分重要且不可替代的巨大作用[19]。本课题组研究发现,对饥饿牦牛静脉灌注BHBA能够提高血清ADPN浓度及脂肪合成代谢相关核转录因子表达,抑制脂肪分解酶活性,抑制脂肪分解[20]。但因体内试验影响因素较多,且BHBA是否对ADPN分泌具有特殊的某种调控机制还尚待研究。鉴于此,本试验在从细胞水平研究饥饿处理下BHBA对牦牛脂肪代谢以及ADPN表达的调控作用,旨在从分子水平揭示牦牛应对饥饿的适应机制,丰富牦牛脂肪代谢营养调控理论。
1 材料与方法 1.1 试验试剂DMEM高糖培养基、无菌磷酸盐缓冲液(PBS)和胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司;3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、罗格列酮(RSG)购自Sigma公司;青/链霉素(双抗)、地塞米松(DEX)、谷氨酰胺(Gln)、胰岛素、Ⅰ型胶原酶购自索莱宝公司;油红O染色试剂盒购自博奥森公司;RNA提取试剂盒购自美基生物科技公司;反转录和定量试剂盒购自艾科瑞公司。
1.2 样品采集与处理选择4头1岁左右的体况相近且健康的雄性麦洼牦牛[体重(211.25±27.10) kg]进行屠宰。屠宰后迅速采集其腹股沟脂肪组织,用无菌PBS(2%双抗)冲洗至组织表面无异物后,装入盛有无菌PBS(2%双抗)的自封袋中,将自封袋放入冰盒内带回细胞间内准备分离细胞。
1.3 前体脂肪细胞分离、培养及分化按照郭红芳等[21]的前体脂肪细胞分离培养方法分离和培养牦牛前体脂肪细胞,并进行改进。具体操作如下:将脂肪组织剔除筋膜及血管后用0.2%的Ⅰ型胶原酶37 ℃水浴消化1 h,之后使用40 μm细胞筛过滤离心,将得到的细胞团用完全培养基(2% Gln,1%双抗,10% FBS)重悬细胞,接种在25 cm2培养瓶,放在37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中进行培养。采用半换液方式,每24 h更换1次完全培养基,观察细胞形态及生长状态。
诱导分化方法在前人鸡尾酒法[22-23]的基础上进行优化,具体为:当细胞生长融合时,继续培养2 d,随后使用无菌PBS清洗1遍细胞,换至成脂分化液(1 μmol/L RSG,2%医用乳清注射剂,1%双抗,1% Gln),3 d后更换维持培养基(10 μg/mL胰岛素,1 μmol/L RSG,1%双抗,1% Gln),之后每3 d更换1次维持培养基,直至脂肪细胞分化成熟。
1.4 试验设计将F3代前体脂肪细胞接种于6孔板中,每孔细胞接种量为1×104个,诱导分化为成熟脂肪细胞后分为正常组、饥饿组,其中正常组使用完全培养基继续培养48 h,而饥饿组换为饥饿培养基(1%双抗,2% Gln)培养48 h,之后分别使用0、4、8、16、32 mmol/L的BHBA再继续处理24 h[24],每个处理6个重复。
1.5 油红O染色及光密度(OD)值测定用油红O染色试剂盒按照说明书中方法对脂肪细胞内脂滴进行染色,具体为:每孔加入1.5 mL 4%多聚甲醛固定液,室温固定30 min。用60%异丙醇通透细胞后,每孔加入1.5 mL油红O工作液,室温避光孵育40 min,弃去染色液,用60%异丙醇漂洗10 s,最后晾干使用倒置显微镜进行镜检。镜检结束后,使用色谱级异丙醇萃取20 min,并用酶标仪检测510 nm波长的OD值。
1.6 脂肪代谢关键酶与ADPN浓度的测定收集细胞培养基样品于1.5 mL离心管中,-20 ℃保存备用。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(牛种属,南京建成生物工程研究所)按照说明书中方法测定脂肪代谢关键酶与ADPN浓度。
1.7 总RNA提取与目的基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测根据RNA提取试剂盒说明书,从每组脂肪细胞中提取总RNA,并使用逆转录试剂盒将mRNA反向转录为用于qRT-PCR的cDNA,对目的基因脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、激素敏感脂酶(HSL)、脂联素(ADPN)、二酰基甘油酰基转移酶1(DGAT1)、过氧化物酶增殖物激活受体α(PPARα)、过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)、CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP1c)、叉头框O蛋白1(FoxO1)、脂酰辅酶A氧化酶(ACOX)进行PCR扩增。qRT-PCR所用引物序列如表 1所示。本试验以泛表达转录子(UXT)为内参基因,采用384孔板,反应体系体积为10 μL,包含0.2 μL正向引物、0.2 μL反向引物、1.0 μL cDNA、5.0 μL SYBR Green染料、0.2 μL ROX(20 μmol/L)和3.4 μL RNase无酶水。反应过程如下:在95 ℃下预变性30 s,在95 ℃下变性5 s,在60 ℃下延伸30 s,40个循环。熔解曲线分析:95 ℃下5 s,65 ℃下1 min。采用2-△△Ct法计算各组脂肪细胞中目的基因的表达量。
用无菌PBS洗涤细胞后,用RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)[含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)]收集细胞,然后在冰水中对细胞进行超声波破碎,并在4 ℃下以13 000 r/min离心20 min,离心后收取上清液,使用BCA蛋白质测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)检测上清液的蛋白质浓度,蛋白质样品在98 ℃下变性10 min,然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),蛋白质上样量为20 μg;电泳完成后,甲醇浸泡0.22 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜5 min,随后用预冷转膜缓冲液浸泡转印滤纸和活化的PVDF膜2 min;组装三明治转膜夹,放入转膜槽,注入预冷转膜缓冲液,100 V进行转膜;转膜完成后,PVDF膜用1×TBST溶液快速漂洗1次,用5%脱脂奶粉室温下封闭1 h,用1×TBST溶液漂洗4次,每次5 min,用稀释后的一抗(稀释液为一抗稀释液,稀释比见表 2)在4 ℃杂交过夜,第2天用1×TBST溶液漂洗4次,每次5 min,用稀释二抗(稀释液为5%脱脂奶粉,稀释比见表 2)室温杂交1 h后,用1×TBST溶液漂洗4次,每次5 min。
用Excel 2016整理所有试验数据,并使用SPSS 22.0统计软件进行分析。数据先进行正态分布检验,若符合正态分布,使用one-way ANOVA程序进行单因素方差分析,并以Duncan氏法进行多重比较;若不符合正态分布,使用非参数检验,并进行两两比较;其他数据使用独立样本t检验。结果均以平均值±标准误表示,P<0.05表示差异显著。其中,ADPN和GPR109A相关数据另使用ANOVA程序进行线性、二次效应分析,利用曲线估计程序进行回归分析,回归结果以回归方程、y极大值及对应x值和R2表示,以P<0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 不同浓度BHBA对牦牛脂肪细胞油红O染色的影响油红O染色结果(图 1)表明,随着BHBA浓度的升高,细胞内脂滴数量逐渐减少。将脂肪细胞内脂滴油红O染色进行量化后(表 2)发现,正常组随着BHBA浓度的增加,OD值先升高后降低,BHBA浓度在8 mmol/L时OD值最高,显著高于其他浓度时(P<0.05);而饥饿组随着BHBA添加量的增加,OD值先降低后升高,且BHBA浓度为32 mmol/L时OD值最高,显著高于其他浓度时(P<0.05)。
如表 4所示,脂肪降解途径中,随BHBA浓度的升高,正常组ACOX的基因表达量先降低后升高再降低,而饥饿组则整体呈降低趋势,且BHBA浓度分别在4和32 mmol/L时ACOX的基因表达量最低,显著低于其他浓度时(P<0.05);随BHBA浓度的升高,正常组HSL的基因表达量无显著变化(P>0.05),而饥饿组则先升高后降低,且BHBA浓度在32 mmol/L时HSL的基因表达量最低,显著低于其他浓度时(P<0.05)。脂肪合成途径中,随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组ACACA的基因表达量先降低后升高再降低,且BHBA浓度分别在16和8 mmol/L时ACACA的基因表达量最高,显著高于其他浓度时(P<0.05);随BHBA浓度的升高,饥饿组DGAT1的基因表达量无显著变化,而正常组则整体呈先升高后降低趋势,且BHBA浓度在4 mmol/L时DGAT1的基因表达量最高,显著高于其他浓度时(P<0.05);随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组FASN的基因表达量先降低后升高再降低,且BHBA浓度分别在16和8 mmol/L时FASN的基因表达量最高,显著高于其他浓度时(P<0.05)。
如表 5所示,脂肪降解途径中,随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组ACOX和HSL的浓度均逐渐降低,且BHBA浓度在32 mmol/L时ACOX和HSL的浓度最低,显著低于其他浓度时(P<0.05)。脂肪合成途径中,随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组中ACACA和DGAT1的浓度均先降低后升高,且BHBA浓度在32 mmol/L时ACACA和DGAT1的浓度最高,显著高于其他浓度时(饥饿组BHBA浓度8和32 mmol/L时DGAT1的浓度除外)(P<0.05);随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组中FASN浓度先降低后升高,且BHBA浓度分别在32和16 mmol/L时FASN的浓度最高,显著高于其他浓度时(P<0.05)。
如表 6所示,脂肪降解途径中,随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组PPARα的基因表达量先降低后升高,且BHBA浓度分别在4和16 mmol/L时PPARα的基因表达量最低,在正常组中显著低于浓度在0、16和32 mmol/L时(P<0.05),在饥饿组中显著低于浓度在0和8 mmol/L时(P<0.05);随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组FoxO1的基因表达量呈降低趋势,且BHBA浓度在32 mmol/L时FoxO1的基因表达量最低,显著低于浓度在0、4和8 mmol/L时(P<0.05)。脂肪合成途径中,随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组CEBPα的基因表达量先升高后降低,且BHBA浓度均在4 mmol/L时CEBPα的基因表达量最高,在正常组中显著高于其他浓度时(P<0.05),在饥饿组中显著高于浓度在0、8和16 mmol/L时(P<0.05);随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组PPARγ的基因表达量先升高后降低再升高,且BHBA浓度分别在16和4 mmol/L时PPARγ的基因表达量最高,在正常组中显著高于浓度在4、8和32 mmol/L时(P<0.05),在饥饿组中显著高于浓度在0、16和32 mmol/L时(P<0.05);随BHBA浓度的升高,正常组SREBP1c的基因表达量先降低后升高,而饥饿组先升高后降低,且BHBA浓度分别在16和8 mmol/L时SREBP1c的基因表达量最高,在正常组中显著高于浓度在0、4和8 mmol/L时(P<0.05),在饥饿组中显著高于其他浓度时(P<0.05)。
如表 7所示,脂肪降解途径中,随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组PPARα的蛋白表达量先升高后降低,且BHBA浓度在32 mmol/L时PPARα的蛋白表达量最低,在正常组中显著低于浓度在4、8和16 mmol/L时(P<0.05),在饥饿组中显著低于其他浓度时(P<0.05);随BHBA浓度的升高,正常组FoxO1的蛋白表达量先升高后降低,而饥饿组则呈降低趋势,且BHBA浓度在32 mmol/L时FoxO1的蛋白表达量最低,显著低于其他浓度时(P<0.05)。脂肪合成途径中,随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组CEBPα的蛋白表达量先降低后升高,且BHBA浓度分别在16和32 mmol/L时CEBPα的蛋白表达量最高,在正常组中显著高于浓度在0、4和8 mmol/L时(P<0.05),在饥饿组中显著高于浓度在4 mmol/L时(P<0.05);随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组SREBP1c的蛋白表达量呈先升高后稳定趋势,且BHBA浓度分别在4和8 mmol/L时SREBP1c的蛋白表达量最高,在正常组中显著高于浓度在0 mmol/L时(P<0.05),在饥饿组中显著高于浓度在0和4 mmol/L时(P<0.05);随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组PPARγ的蛋白表达量整体上呈升高趋势,且BHBA浓度分别在32和8 mmol/L时PPARγ的蛋白表达量最高,在正常组中显著高于其他浓度时(P<0.05),在饥饿组中显著高于浓度在0和16 mmol/L时(P<0.05)。
如表 8和表 9所示,随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组ADPN的基因表达量和浓度均先升高后降低,正常组中,BHBA浓度在4、8和16 mmol/L时ADPN的基因表达量和浓度较高,显著高于其他浓度时(P<0.05),而饥饿组中,BHBA浓度在8和16 mmol/L时ADPN的基因表达量和浓度较高,显著高于其他浓度时(P<0.05)。
如表 8、表 10所示,随BHBA浓度的升高,正常组和饥饿组GPR109A的基因和蛋白表达量均先升高后降低,正常组中,BHBA浓度在4 mmol/L时GPR109A的基因和蛋白表达量最高,显著高于其他浓度时(P<0.05),而饥饿组中,BHBA浓度在4和8 mmol/L时GPR109A的基因和蛋白表达量较高,显著高于其他浓度时(P<0.05)。
如表 11所示,正常组GPR109A的基因表达量与BHBA浓度无相关关系(R2<0.6,P>0.05),而饥饿组GPR109A的基因表达量与BHBA浓度呈显著三次相关关系(R2>0.6,P<0.01)。且饥饿组中,BHBA浓度在7.03 mmol/L时,GPR109A的基因表达量达到最大值5.09。正常组和饥饿组的GPR109A蛋白表达量与BHBA浓度均呈显著三次相关关系(R2>0.6,P<0.01),且BHBA浓度分别在4.13和4.60 mmol/L时,GPR109A的蛋白表达量分别达到最大值1.05和1.02。
正常组和饥饿组ADPN的基因表达量与BHBA浓度均呈显著二次相关关系(R2>0.6,P<0.01),且BHBA浓度分别在14.38和7.88 mmol/L时,ADPN的基因表达量分别达到最大值1.80和4.58。正常组ADPN的浓度与BHBA浓度呈显著二次相关关系(R2>0.6,P<0.01),而饥饿组ADPN的浓度与BHBA浓度则呈显著三次相关关系(R2>0.6,P<0.01),且正常组和饥饿组中BHBA浓度分别在15.38和7.56 mmol/L时,ADPN的浓度分别达到最大值78.49和82.30 ng/mL。
3 讨论近年来研究显示,BHBA作为酮体的有效形式之一,同烟酸一样能够抑制脂肪细胞的脂解过程[25]。有研究发现,人脂肪细胞中添加BHBA能够显著抑制脂肪分解过程[26]。用0.2、2、20 mmol/L的BHBA刺激体外培养小鼠脂肪细胞,发现2和20 mmol/L的BHBA能够显著降低脂肪酸(FFA)和甘油的释放,显著抑制细胞内甘油三酯(TG)的释放[27]。给大鼠口服BHBA能够显著提高高密度脂蛋白胆固醇浓度,使脂肪细胞体积减小[28]。本试验结果与以上研究结果一致,检测发现,反应细胞内TG含量的脂滴油红O染色量化值(OD值)随着BHBA浓度的升高而升高。BHBA对脂肪分解代谢的抑制作用离不开其对脂肪代谢相关酶及转录因子的调控。研究表明,体外培养的脂肪组织在分别添加烟酸和BHBA处理后,其脂肪分解代谢过程受到显著抑制,同时HSL的活性及其磷酸化水平发生显著下降[29]。有研究发现,BHBA浓度超过1.2 mmol/L时,其能够激活AMP依赖的蛋白激酶(AMPK)信号通路,使PPARα的mRNA和蛋白相对表达量显著升高,而使SREBP1c和CEBPα的mRNA和蛋白相对表达量显著下降,同时高剂量的BHBA能够使ACACA和FASN的mRNA和蛋白相对表达量显著高于中剂量BHBA,也就是说,随着BHBA浓度的升高,ACACA和FASN的mRNA和蛋白相对表达量先降低后升高[30]。Zhang等[31]在奶牛乳腺上皮细胞中添加1.2 mmol/L的BHBA,发现BHBA能够显著提高DGAT1的表达,而敲除SREBP1c基因后再添加BHBA,ACACA、FASN和DGAT1的表达量均显著下降,且脂肪酸合成及TG含量也受到显著抑制。另外,PPARγ的活性也受到SREBP1c的调控[32]。本研究结果也表明,随着BHBA浓度升高,PPARα和FoxO1以及ACOX和HSL的基因表达量下降,而PPARγ、SREBP1c和CEBPα以及ACACA、FASN和DGAT1的基因表达量升高。BHBA对脂肪代谢的调控作用,不仅依赖于其作为中间产物负反馈抑制脂肪分解,还依赖于其作为信号分子激活AMPK等信号通路,调节脂肪代谢调控相关的转录因子表达,间接的调节TG合成与分解过程中关键酶的表达,以实现其对机体内脂肪存储及动员的调控,以维持机体脂肪代谢平衡。
ADPN是脂肪组织特异性分泌的脂肪因子,它能够通过其受体脂联素受体1(AdipoR1)、脂联素受体2(AdipoR2)和T-钙黏蛋白发挥其对脂肪代谢的调控作用[33]。研究发现,烟酸在促进ADPN的分泌同时提高GPR109A的表达,而GPR109A基因敲除小鼠ADPN浓度无显著变化,也就是说,烟酸通过GPR109A介导促进ADPN的分泌[34]。近年来研究发现,BHBA是GPR109A的内源性配体,能够同烟酸一样刺激GPR109A以促进ADPN分泌[35]。而本试验结果显示,BHBA浓度同GPR109A以及ADPN的基因表达量均呈现出显著的二次方曲线增加,换句话说,随着BHBA浓度的升高,GPR109A以及ADPN的基因表达量先升高后降低,在BHBA浓度为8 mmol/L的时达到最高点。也就是说,低浓度BHBA刺激脂肪细胞时,在其分解代谢并未完全得到抑制时,脂肪细胞将持续分泌ADPN,而高浓度BHBA(>8 mmol/L)将脂肪分解代谢显著抑制后,ADPN的分泌量也出现显著的下降,这种解释同本试验中BHBA对脂肪代谢调控的结果相一致。至此,脂肪细胞分泌ADPN的多少是受到BHBA对脂肪细胞脂肪代谢过程的间接调控的,而BHBA是否对脂肪细胞分泌ADPN存在信号通路机制的调控还尚未有相关报道,还需进一步探索。
4 结论在本试验条件下,32 mmol/L BHBA能够抑制脂肪细胞的脂肪分解代谢,增加TG的积累,加强脂肪合成代谢,且低浓度的BHBA能够促进脂肪细胞对ADPN的分泌,而高浓度的BHBA则会抑制ADPN的分泌。
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