动物营养学报    2022, Vol. 34 Issue (9): 5984-5994    PDF    
枯草芽孢杆菌对湖羊胃肠道发育、瘤胃发酵参数及微生物区系的影响
刘俊斌1,2 , 张利平2 , 宋淑珍1     
1. 甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所, 兰州 730070;
2. 甘肃农业大学动物科学技术学院, 兰州 730070
摘要: 本试验旨在研究饲粮中添加枯草芽孢杆菌对育肥期湖羊胃肠道发育、瘤胃发酵参数、消化酶活性及微生物区系的影响。试验选择(60±10)日龄、体重为(19.51±2.07) kg的健康湖羊断奶公羔45只, 随机分为3个组, 每组15只羊。对照组(C组)饲喂基础饲粮, 枯草芽孢杆菌Ⅰ组(T1组)饲喂基础饲粮+100 mg/kg枯草芽孢杆菌制剂(活菌数≥1×1011 CFU/g), 枯草芽孢杆菌Ⅱ组(T2组)饲喂基础饲粮+200 mg/kg枯草芽孢杆菌制剂。试验期70 d, 其中预试期10 d, 正试期60 d。结果表明: 1)与C组相比, 饲粮中添加枯草芽孢杆菌对湖羊胃肠道发育指标无显著影响(P>0.05)。2)与C组相比, T2组瘤胃液总挥发性脂肪酸和丙酸含量显著提高(P < 0.05), 瘤胃液乙酸/丙酸值显著降低(P < 0.05)。3)与C组相比, T1组和T2组瘤胃内容物内切纤维素酶和脂肪酶活性极显著提高(P < 0.01), 且T2组瘤胃内容物内切纤维素酶活性极显著高于T1组(P < 0.01)。4)与C组相比, T1组和T2组瘤胃内容物白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜淀粉瘤胃杆菌以及乳酸菌相对丰度极显著提高(P < 0.01)。综上所述, 饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以促进湖羊瘤胃发酵, 改善瘤胃发酵环境, 提高瘤胃消化酶活性, 提高瘤胃有益菌相对丰度, 其适宜的添加量为200 mg/kg。
关键词: 枯草芽孢杆菌    湖羊    胃肠道发育    发酵参数    瘤胃微生物    
Effects of Bacillus subtilis on Gastrointestinal Development, Rumen Fermentation Parameters and Microflora of Hu Sheep
LIU Junbin1,2 , ZHANG Liping2 , SONG Shuzhen1     
1. Institute of Livestock, Grass and Green Agriculture, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070, China;
2. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
Abstract: This experiment was conducted to investigate the effects of Bacillus subtilis supplementation on gastrointestinal development, rumen fermentation parameters, digestive enzyme activities and microflora of Hu sheep during fattening period. Forty-five healthy male weaned lambs from Hu sheep of (60±10) days of age with a body weight of (19.51±2.07) kg were randomly divided into 3 groups with 15 lambs in each group. Sheep in the control group (C group) were fed a basal diet, and those in Bacillus subtilis groups Ⅰ (T1 group) and Ⅱ (T2 group) were fed the basal diet supplemented with 100 and 200 mg/kg Bacillus subtilis preparation (live count≥1×1011 CFU/g), respectively. The experiment lasted for 70 days, including a pre-trial period of 10 days and a formal trial period of 60 days. The results showed as follows: 1) compared with C group, dietary Bacillus subtilis had no significant effects on gastrointestinal development indices of Hu sheep (P>0.05). 2) Compared with C group, the contents of total volatile fatty acids and propionic acid in rumen fluid in T2 group were significantly increased (P < 0.05), and the acetic acid to propionic acid ratio in rumen fluid was significantly decreased (P < 0.05). 3) Compared with C group, the activities of endo-cellulase and lipase in rumen contents in T1 group and T2 group were extremely significantly increased (P < 0.01), and the endo-cellulase activity in rumen contents in T2 group was extremely significantly higher than that in T1 group (P < 0.01). 4) Compared with C group, the relative abundances of Ruminococcus albus, Fibrobacter succinogenes, Ruminobacter amylophilus and Lactobacillus in rumen contents in T1 group and T2 group were extremely significantly increased (P < 0.01). In conclusion, dietary Bacillus subtilis can promote rumen fermentation, improve rumen fermentation environment, improve rumen digestive enzyme activities, and increase the relative abundance of beneficial bacteria in the rumen of Hu sheep, and the appropriate supplemental level is 200 mg/kg.
Key words: Bacillus subtilis    Hu sheep    gastrointestinal development    fermentation parameters    rumen microflora    

胃肠道不仅是营养物质消化吸收的主要场所,还是参与免疫调节的主要器官。我国“饲料禁抗”后,为了消除或减轻禁用抗生素对畜牧业发展带来的影响,研究寻找安全有效的抗生素替代品成为当前畜牧业研究热点[1-4],而替抗产品研发的核心是对动物肠道健康的维护。益生素是一种通过改善动物肠道菌群平衡对动物产生有益作用的微生态制剂,在畜牧业生产中具有提高饲料转化效率、改善新陈代谢和调节免疫水平的作用,因此益生素已成为当前替代抗生素的理想产品。枯草芽孢杆菌是一种好氧革兰氏阳性菌,能产生抗逆性内生孢子,消耗肠道中的游离氧,促进有益厌氧菌生长,间接抑制其他致病菌生长,具有提高机体免疫性能、维护胃肠道健康等多种功能[5-6]。韩林等[7]研究发现,饲粮中添加枯草芽孢杆菌能够促进瘤胃纤维分解菌的生长,提高纤维分解酶的活性。李月明等[8]研究发现,饲粮中添加枯草芽孢杆菌能提高体外发酵瘤胃液总挥发性脂肪酸含量。邓露芳[9]研究发现,饲粮中添加纳豆枯草芽孢杆菌能够显著增加黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌的数量。目前,尽管枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂的研究报道较多,但关于枯草芽孢杆菌对反刍动物胃肠道发育和瘤胃微生物的影响的系统性研究不多。因此,本试验旨在研究枯草芽孢杆菌对育肥期湖羊胃肠道发育、瘤胃发酵参数、消化酶活性及瘤胃微生物的影响,为枯草芽孢杆菌类产酶益生素在反刍动物健康养殖中的应用提供基础数据依据。

1 材料与方法 1.1 试验时间和地点

本试验于2021年3月至2021年5月在甘肃省张掖市甘州区平山湖蒙古族乡异地育肥基地进行。

1.2 试验动物和试验设计

选择(60±10)日龄、体重为(19.51±2.07) kg的健康湖羊断奶公羔45只,随机分为3个组,每组15只羊。对照组(C组)饲喂基础饲粮,枯草芽孢杆菌Ⅰ组(T1组)饲喂基础饲粮+100 mg/kg枯草芽孢杆菌制剂,枯草芽孢杆菌Ⅱ组(T2组)饲喂基础饲粮+200 mg/kg枯草芽孢杆菌制剂。试验所用枯草芽孢杆菌制剂购自山东某生物工程有限公司,其中活菌数≥1×1011 CFU/g。基础饲粮组成及营养水平见表 1。试验期70 d,其中预试期10 d,正试期60 d。

表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) 
1.3 饲养管理

试验开始前对所有试验羊舍进行清扫、消毒,试验羊全部打耳标、然后称重并分栏,单栏饲养,每只羊占地面积为2.5 m2。每天08:00和17:00各饲喂1次,枯草芽孢杆菌制剂每天早上在饲粮中按比例添加,并混合均匀后饲养,自由饮水,自由采食。试验羊舍为彩钢半开放式羊舍,温度、通风、光照等饲养环境条件基本一致。

1.4 样品采集及指标测定

正试期结束后,每组随机选取6只羊(禁食12 h,自由饮水),采用颈静脉放血处死。屠宰后立即分离出瘤胃,采集瘤胃内容物分装于2个2 mL离心管中,立即投入液氮冷冻保存,用于测定瘤胃微生物区系及消化酶活性;另取瘤胃内容物通过4层纱布过滤后,取15 mL滤液当场测定pH,其余滤液分装至2个10 mL离心管中,-20 ℃保存,用于测定瘤胃发酵参数。

1.4.1 胃肠道发育

试验羊只经屠宰后迅速分离瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃及小肠,将内容物清洗干净,并用滤纸吸干后进行称重,计算全胃指数、瘤胃指数和小肠指数,公式如下:

1.4.2 瘤胃发酵参数

pH测定:用便携式pH计当场测定瘤胃液pH。

氨氮含量测定:取10 mL瘤胃液于3 500 r/min下离心10 min,量取2 mL上清液,置于15 mL试管内,再加入8 mL 0.2 mol/L盐酸至10 mL摇匀,参考冯宗慈等[10]的方法,利用比色法测定氨态氮含量。

挥发性脂肪酸含量测定:采用气相色谱内标法测定瘤胃液挥发性脂肪酸含量,内标物为2-乙基丁酸(2EB),将瘤胃液于5 400 r/min下离心10 min,吸取1 mL上清液加入到1.5 mL离心管中,然后加入0.2 mL的25%偏磷酸溶液(含有内标物2EB),混匀、冰浴30 min,在10 000 r/min下离心10 min,用一次性针管吸取上清液,用0.22 μm的有机相过滤到2 mL棕色样品瓶,-20 ℃保存,待上机测定。色谱柱为AT-FFAP(30 m×0.32 mm×0.50 μm)毛细管柱;气相色谱仪为安捷伦(Agilent 7890B);色谱条件为检测器温度250 ℃,进样口温度250 ℃;升温程序为起始温度60 ℃保持1 min,以5 ℃/min升至120 ℃,保持3 min,再以10 ℃/min升至180 ℃。

1.4.3 瘤胃消化酶活性

参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)提供的方法测定内切纤维素酶、α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等消化酶活性,用全自动酶标仪进行测定。

1.4.4 瘤胃微生物区系

利用天根粪便基因组DNA提取试剂盒(DP328)提取瘤胃微生物基因组DNA,用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性和纯度,用超微量分光光度计(Thermo Nano Drop-2000)检测吸光度(OD)260/280。采用实时荧光定量PCR仪(Light Cycler® 480 Ⅱ)测定真菌、原虫、黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜淀粉瘤胃杆菌、乳酸菌及产甲烷菌等的相对丰度。瘤胃微生物特异性引物序列见表 2[11-15],所有引物均由生工生物工程上海(股份)有限公司合成。

表 2 瘤胃微生物特异性引物序列 Table 2 Rumen microbial specific primer sequences

反应体系及参数设置参照天根SuperReal荧光定量预混试剂增强版(SYBR Green-FP205)说明书进行。反应体系见表 3,反应参数为95 ℃预变性15 min,95 ℃变性10 s,60 ℃退火32 s,共计40个循环。采用2-ΔΔCt[16]计算目的微生物的相对丰度,以总细菌为内参基因。

表 3 实时荧光定量PCR反应体系 Table 3 Real-time fluorescence quantitative PCR reaction system 
1.5 数据统计及分析

试验数据先使用Excel 2010进行整理,然后采用SPSS 21.0统计软件中的ANOVA程序进行单因素方差分析,并采用Duncan氏法进行多重比较,结果用“平均值±标准差”表示。以P < 0.05表示差异显著,以P < 0.01表示差异极显著。

2 结果与分析 2.1 枯草芽孢杆菌对湖羊生长性能的影响

表 4可知,与C组相比,T1组、T2组湖羊的平均日增重在数值上有所提高,但3组之间无显著差异(P>0.05),这表明饲粮中添加枯草芽孢杆菌对育肥期湖羊的生长性能无显著影响(P>0.05)。

表 4 枯草芽孢杆菌对湖羊生长性能的影响 Table 4 Effects of Bacillus subtilis on growth performance of Hu sheep (n=15)
2.2 枯草芽孢杆菌对湖羊胃肠道发育的影响

表 5可知,与C组相比,饲粮中添加枯草芽孢杆菌对湖羊全胃、瘤胃和小肠等消化道重量及其指数均无显著影响(P>0.05),这表明饲粮中添加枯草芽孢杆菌对育肥期湖羊消化道的发育没有显著影响。

表 5 枯草芽孢杆菌对湖羊胃肠道发育的影响 Table 5 Effects of Bacillus subtilis on gastrointestinal development of Hu sheep (n=6)
2.3 枯草芽孢杆菌对湖羊瘤胃发酵参数的影响

表 6可知,T1组和T2组湖羊瘤胃液pH在数值上低于C组,但3组之间无显著差异(P>0.05);T1组和T2组瘤胃液氨态氮含量在数值上低于C组,但3组之间无显著差异(P>0.05);T1组和T2组瘤胃液总挥发性脂肪酸含量显著高于C组(P < 0.05),T1组与T2组之间无显著差异(P>0.05);T1组和T2组瘤胃液乙酸含量在数值上高于C组,但3组之间无显著差异(P>0.05);T2组瘤胃液丙酸含量显著高于C组(P < 0.05),T1组与C组和T2组之间无显著差异(P>0.05);C组瘤胃液异丁酸和异戊酸含量极显著高于T1组和T2组(P < 0.01),T1组与T2组之间无显著差异(P>0.05);T2组瘤胃液乙酸/丙酸值显著低于C组(P < 0.05),T1组与C组和T2组之间无显著差异(P>0.05);3组瘤胃液丁酸和戊酸含量之间均无显著差异(P>0.05)。以上结果表明饲粮中添加枯草芽孢杆菌有促进湖羊瘤胃发酵的作用,有利于改善瘤胃发酵环境。

表 6 枯草芽孢杆菌对湖羊瘤胃发酵参数的影响 Table 6 Effects of Bacillus subtilis on rumen fermentation parameters of Hu sheep (n=6)
2.4 枯草芽孢杆菌对湖羊瘤胃消化酶活性的影响

表 7可知,湖羊瘤胃内容物内切纤维素酶和脂肪酶活性随枯草芽孢杆菌添加量的增加呈上升趋势,且T2组内切纤维素酶活性极显著高于T1组和C组(P < 0.01),T1组内切纤维素酶活性极显著高于C组(P < 0.01),T1组和T2组脂肪酶活性极显著高于C组(P < 0.01),T1组和T2组α-淀粉酶和蛋白酶活性与C组相比无显著差异(P>0.05)。

表 7 枯草芽孢杆菌对湖羊瘤胃消化酶活性的影响 Table 7 Effects of Bacillus subtilis on rumen digestive enzyme activities of Hu sheep (n=6)
2.5 枯草芽孢杆菌对湖羊瘤胃微生物区系的影响

表 8可知,T1组和T2组湖羊瘤胃内容物黄色瘤胃球菌相对丰度在数值上高于C组, 但3组之间无显著差异(P>0.05);3组瘤胃内容物白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌和乳酸菌相对丰度之间差异极显著(P < 0.01),其中T2组瘤胃内容物白色瘤胃球菌相对丰度比C组和T1组分别提高了107.94%和18.02%,瘤胃内容物产琥珀酸丝状杆菌相对丰度比C组和T1组分别提高了136.54%和46.43%,瘤胃内容物乳酸菌相对丰度比C组和T1组分别提高了76.32%和23.31%;T2组瘤胃内容物嗜淀粉瘤胃杆菌相对丰度极显著高于C组(P < 0.01),T1组与T2组之间无显著差异(P>0.05);3组瘤胃内容物真菌、原虫和产甲烷菌相对丰度之间无显著差异(P>0.05),其中T1组和T2组瘤胃内容物产甲烷菌相对丰度在数值上小于C组,且与C组相比,分别降低了8.96%和14.93%。以上结果表明饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以提高湖羊瘤胃内容物中主要有益细菌的相对丰度。

表 8 枯草芽孢杆菌对湖羊瘤胃微生物区系的影响 Table 8 Effects of Bacillus subtilis on rumen microflora of Hu sheep (n=6)
3 讨论 3.1 枯草芽孢杆菌对湖羊胃肠道发育的影响

胃肠道的健康与功能是对动物健康状态的直观反映,小肠是重要的消化吸收器官,同时也是重要的免疫器官,饲粮进入瘤胃经过充分的发酵和微生物消化后,被送入小肠吸收,良好的胃肠道发育对促进饲粮消化吸收、提高饲粮转化利用率、充分发挥畜牧生产潜力具有重要意义[18]。本试验中,饲粮添加枯草芽孢杆菌对育肥期湖羊的全胃、瘤胃和小肠的重量及其指数均无显著影响,这与郑琛等[19]的试验结果一致。有研究表明,在乳鼠生长早期饲粮添加枯草芽孢杆菌可促进乳鼠生长,改善肠道形态,促进肠道屏障功能成熟,从而促进早期肠道发育[20]。农斯伟等[21]研究发现,在肉鸡饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以促进动物的肠道健康,提高免疫力。王汉星等[22]研究发现,饲粮中添加枯草芽孢杆菌可改善断奶仔猪空肠菌群,促进肠道发育。目前,关于枯草芽孢杆菌对反刍动物胃肠道发育常规指标的影响研究较少,其影响机理有待进一步的研究。

3.2 枯草芽孢杆菌对湖羊瘤胃发酵参数的影响

反刍动物的瘤胃是一个相对稳定的厌氧发酵罐,瘤胃内的pH、氨态氮和挥发性脂肪酸含量是目前研究瘤胃发酵的主要内环境指标,其中pH是直接反映瘤胃发酵情况的重要参数指标,瘤胃正常发酵的pH为5.5~7.5[23]。本试验中,瘤胃的pH在5.87~6.34,均在正常范围内,且T2组与C相比降低了7.41%,其原因可能是枯草芽孢杆菌促进了碳水化合物的消化代谢,增加了瘤胃中总挥发性脂肪酸的含量[24]。也有研究发现,全混合颗粒饲粮中加入枯草芽孢杆菌对瘤胃pH没有显著影响,但有助于幼畜快速建立自己的微生物区系并提高其抵抗力[25]。瘤胃液氨态氮含量是反映反刍动物瘤胃氮降解的表观指标,既是饲粮中含氮物质降解的终产物,又是微生物合成菌体蛋白的原料,瘤胃液中氨态氮含量与饲粮中氮的降解速度和微生物合成氨的能力有关[26]。氨态氮含量过低不利于微生物蛋白质的合成及纤维类物质的降解利用,含量过高又会造成氮源浪费[27]。研究表明,瘤胃微生物所需氨态氮的最佳含量为5.0~30.0 mg/dL[18]。本试验中,瘤胃液氨态氮含量为6.73~6.91 mg/dL,在正常范围内。挥发性脂肪酸是反刍动物的主要能源来源,它提供了反刍动物总能量需求的70%以上,同时也是瘤胃微生物的主要碳水化合物来源;瘤胃碳水化合物发酵产生挥发性脂肪酸,其中包含乙酸、丙酸和丁酸等,它们是反刍动物获得能量、合成乳脂以及维持体脂肪的重要原料[28]。有研究报道,饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以增加瘤胃液总挥发性脂肪酸含量[29],本研究结果与上述报道一致。本试验中,枯草芽孢杆菌添加组与C组相比,总挥发性脂肪酸含量显著提高,但也有报道称,枯草芽孢杆菌能够显著降低总挥发性脂肪酸的含量[30],不同的研究结果可能与使用的菌种、发酵底物或是试验条件差异有关[8]

3.3 枯草芽孢杆菌对湖羊瘤胃消化酶活性的影响

瘤胃中酶的活性与瘤胃微生物的数量和代谢密切相关,瘤胃液纤维素酶的活性与瘤胃中纤维分解菌的数量和活力有关[31],蛋白酶和淀粉酶活性可以直观表现出瘤胃中蛋白质分解菌和淀粉分解菌的数量及活力[32]。枯草芽孢杆菌可在消化道内产生大量的消化酶,弥补机体内源酶的不足,降低饲粮中抗营养因子水平,增强机体对营养物质的吸收,提高饲料利用率。有研究表明,枯草芽孢杆菌可以显著提高肉鹅空肠脂肪酶活性[33]。程连平[34]研究发现,饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以显著提高湖羊羔羊胰腺脂肪酶活性。本试验结果表明,饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以极显著提高湖羊瘤胃中内切纤维素酶和脂肪酶的活性,说明饲粮中添加枯草芽孢杆菌对断奶湖羊瘤胃的消化有促进作用。

3.4 枯草芽孢杆菌对湖羊瘤胃微生物区系的影响

瘤胃是反刍动物重要的消化器官,内部含有丰富的瘤胃微生物。瘤胃微生物群落的结构和相对丰度处于相对稳定的动态平衡,该平衡对于维持瘤胃内环境稳定以及在反刍动物的消化和吸收营养物质过程中起着重要的作用[35-36]。瘤胃中的细菌、真菌和原虫通过相互作用和相互协调共同完成对饲粮的降解和发酵,调节机体的免疫反应,其中细菌发挥着主要作用;真菌可以穿透细胞壁,通过降解木质素增强纤维素降解率。此外,黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌属于瘤胃中纤维分解菌中的优势菌群,3种菌的快速生长有利于纤维降解酶的分泌,促进饲粮纤维在瘤胃中的消化;嗜淀粉瘤胃杆菌能利用α-葡萄糖作为能量来源,这对瘤胃内淀粉的降解至关重要。有研究表明,饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以增加绵羊瘤胃黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的数量[37]。Sun等[38]研究表明,饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以降低瘤胃原虫的数量。Kridtayopas等[39]研究表明,饲粮中添加枯草芽孢杆菌可以缓解高密度肉鸡肠道菌群失调的程度,增加肠道内芽孢杆菌属和乳酸菌属等有益微生物的数量,同时抑制大肠杆菌的生长。本试验结果与上述报道结果相一致,本试验结果表明,与C组相比,枯草芽孢杆菌添加组湖羊瘤胃嗜淀粉瘤胃杆菌、乳酸菌及纤维降解菌中的白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的相对丰度显著提高,说明饲粮中添加枯草芽孢杆菌可提高湖羊瘤胃内容物中主要有益细菌的相对丰度。

4 结论

① 饲粮中添加200 mg/kg枯草芽孢杆菌时,湖羊瘤胃液异丁酸和异戊酸含量以及乙酸/丙酸值显著降低,而瘤胃液总挥发性脂肪酸和丙酸含量显著提高。

② 饲粮中添加100和200 mg/kg枯草芽孢杆菌对湖羊胃肠道发育常规指标无显著影响,但可以显著提高瘤胃内容物中的内切纤维素酶和脂肪酶活性。

③ 饲粮中添加200 mg/kg枯草芽孢杆菌可以显著提高湖羊瘤胃内容物中的白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、嗜淀粉瘤胃杆菌和乳酸菌的相对丰度。

④ 本试验中,育肥期湖羊饲粮中适宜的枯草芽孢杆菌(活菌数≥1×1011 CFU/g)添加量为200 mg/kg。

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