当代肉鸡产业规模化与集约化生产中，由于其饲养周期短、密度大，肉鸡新陈代谢旺盛，很容易发生氧化应激和免疫应激，引发一系列疾病致使经济效益下降。现如今，畜禽生产中饲料端全面禁抗，人们更多地关注通过营养调控手段增强机体免疫功能，即通过在饲粮中添加无毒无害的营养物质进而控制疾病感染。维生素A是保证动物正常生长发育所必需的一种脂溶性维生素，它不仅对动物维持正常的骨骼生长发育、促进生长与生殖、维持视觉功能和抗肿瘤等方面发挥着重要的生理作用，而且可以提高机体抗氧化和清除自由基能力，防御细胞炎症和氧化应激的发生，对动物机体抗氧化和免疫功能有着重要的调节作用[1-3]。因此，肉鸡生产中常使用维生素A来提高其抗氧化和免疫功能。
一氧化氮(NO)是迄今为止生物体内发现的第1个气体信号分子，是一种结构简单、脂溶性且易通过细胞膜扩散的生物自由基，是机体重要的生物介质。体内的NO主要是由诱导型一氧化氮合酶(iNOS)催化左旋-精氨酸(L-Arg)与氧气分子经多步氧化还原反应生成[4]。NO作为信使参与机体内多种生物学反应，对血管通透性、炎症反应和免疫功能等具有重要的调节作用，并能影响机体的某些免疫细胞的生成和活力，例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和T淋巴细胞等[5]。研究表明，动物机体内的NO含量在一定范围内与其抗氧化和免疫功能呈正相关关系，但过量的NO对细胞具有毒性，容易引起细胞损伤[6]。维生素A可有效调控NO合成，提高机体抗氧化水平并清除自由基，预防细胞炎症及氧化应激的发生[7]。其可能的机制是维生素A及其代谢产物视黄酸抑制了淋巴细胞中某些细胞因子的合成，抑制由此类细胞因子介导的iNOS的合成，从而抑制NO的生成[8]。体外试验也表明，添加维生素A抑制了奶牛乳腺上皮细胞中受白细胞介素-1(IL-1)介导的iNOS的合成，减少NO的大量生成从而缓解细胞损伤[9]。这提示维生素A可能是通过影响NO的生成从而调节机体的抗氧化与免疫功能。本课题组前期的研究表明，饲粮添加6 000 IU/kg的维生素A能够提高肉鸡的生长性能，添加15 000 IU/kg的维生素A能够提高肉鸡抗氧化功能，饲粮维生素A水平达到30 000~45 000 IU/kg时，肉鸡生长性能和抗氧化功能均呈现下降趋势[2]，但不同的维生素A添加水平对肉鸡的免疫功能的影响及具体作用机制有待进一步探索。鉴于此，本试验拟研究饲粮添加不同水平的维生素A对肉鸡免疫功能以及肝脏和十二指肠中NO含量、iNOS、总一氧化氮合酶(tNOS)的活性与其基因相对表达量的影响，为阐明维生素A通过调控NO途径影响肉鸡免疫功能的分子机理提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计与饲粮试验设计、饲养管理与基础饲粮配方等同本课题前期郭晓宇等[2]的试验，简介如下：采用单因子完全随机试验设计，选取240只1日龄健康的爱拔益加(AA)肉鸡(公母各占1/2)，随机分为5组，每组6个重复，每个重复8只。5组分别饲喂在基础饲粮中添加3 000、6 000、15 000、30 000和45 000 IU/kg维生素A的饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表 1。试验期42 d，分为前期(1~3周龄)和后期(4~6周龄)，各21 d。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
在21和42日龄，晨饲前在每个重复中随机抽取2只鸡，即每组12只鸡，称重、翅下静脉采血后口腔内放血屠宰。血液于4 ℃下3 000 r/min离心10 min制备血清，-20 ℃保存，用于血清免疫因子含量的测定。在冰浴上剖开肉鸡腹腔，采集肝脏和十二指肠组织，-80 ℃保存，用于后续指标的分析测定。迅速分离胸腺、脾脏和法氏囊等组织，用滤纸吸去血液，剥离脂肪和结缔组织后分别称重。
1.3 测定指标及方法 1.3.1 免疫器官指数免疫器官(胸腺、脾脏和法氏囊)指数=免疫器官重/宰前活体重。
1.3.2 血清免疫细胞因子含量血清中免疫细胞因子IL-1、白细胞介素-2 (IL-2)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)含量以及肝脏和十二指肠组织中NO含量、iNOS和tNOS活性的测定均采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，按照试剂盒说明书上步骤进行操作。主要使用的仪器设备：全自动酶标仪(SYNERGY H1，美国伯腾仪器有限公司)、组织匀浆仪(Retsch MM400，德国莱驰仪器有限公司)、隔水式恒温培养箱(GHP-9270，上海一恒科学仪器有限公司)。
1.3.3 肝脏、十二指肠组织中iNOS基因相对表达量肝脏和十二指肠组织中总RNA的提取、反转录以及实时荧光定量(RT-PCR)的测定方法和程序同郭世伟[10]的方法，PCR引物由上海生工合成，引物序列详见表 2。iNOS基因在组织中的相对表达量用2-△△Ct方法进行计算。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
试验数据采用SAS 9.0软件的统计程序进行单因素方差分析，并进行回归统计分析，P≤0.05表示组间差异或回归关系显著，0.05 < P≤0.10表示组间差异或回归关系趋于显著，P＞0.10表示组间差异或回归关系不显著。
2 结果 2.1 饲粮添加不同水平维生素A对肉鸡免疫器指数的影响由表 3可知，在21和42日龄，饲粮维生素A水平对肉鸡法氏囊指数均有趋于显著的影响(P=0.078，P=0.06)，21日龄以6 000 IU/kg组最高，45 000 IU/kg组最低；42日龄以15 000 IU/kg组最高，45 000 IU/kg组最低。回归关系表明，随饲粮维生素A水平的升高，21日龄肉鸡脾脏指数呈显著的一次线性增加的剂量关系(P=0.02，R2=0.186)，以30 000 IU/kg组最高。各组肉鸡胸腺指数之间的差异不显著(P＞0.05)。
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表 3 饲粮添加不同水平维生素A对肉鸡免疫器指数的影响 Table 3 Effects of dietary supplementation with different levels of vitamin A on immune organ indexes in broilers |
由表 4可知，饲粮维生素A水平对21和42日龄肉鸡血清中IL-1(P=0.020，P＜0.001)、42日龄血清IL-6(P=0.023)和TNF-α含量(P=0.049)有显著影响，且随维生素A水平的提高，21和42日龄肉鸡血清IL-1(P=0.009，R2=0.41；P < 0.001，R2=0.47)、42日龄血清IL-6(P=0.011，R2=0.17)和TNF-α含量(P=0.050，R2=0.13)均呈显著的二次曲线降低的剂量依赖关系，均以15 000 IU/kg组含量较高，45 000 IU/kg组含量较低；饲粮维生素A水平对42日龄肉鸡血清中IL-2含量有趋于显著的影响(P=0.075)，且随饲粮维生素A水平的提高呈显著的一次线性升高的剂量依赖关系(P=0.044，R2=0.79)，15 000~45 000 IU/kg组含量高于3 000~6 000 IU/kg组。
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表 4 饲粮添加不同水平维生素A对肉鸡血清免疫因子含量的影响 Table 4 Effects of dietary supplementation with different levels of vitamin A on serum immune factor contents in broilers |
由表 5可知，饲粮维生素A水平对42日龄肉鸡肝脏中NO(P=0.001)含量及iNOS(P=0.002)和tNOS活性(P=0.001)存在显著影响，且随饲粮维生素A添加水平的升高均呈显著的二次曲线下降(P < 0.001，R2=0.62；P < 0.001，R2=0.47；P < 0.001，R2=0.49)，以3 000和6 000 IU/kg组较高，30 000和45 000 IU/kg组较低。21日龄肉鸡肝脏组织中NO含量随饲粮中维生素A水平的增加呈趋于显著的一次线性降低(P=0.073，R2=0.13)。饲粮维生素A水平对21日龄肉鸡肝脏中iNOS活性有趋于显著的影响(P=0.082)，6 000和15 000 IU/kg组活性高于30 000和45 000 IU/kg组。
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表 5 饲粮添加不同水平的维生素A对肉鸡肝脏中NO含量及相关代谢酶活性的影响 Table 5 Effects of dietary supplementation with different levels of vitamin A on NO content and related metabolic enzyme activities in liver of broilers |
由表 6可知，除21日龄肉鸡十二指肠组织中tNOS活性在各组间无显著差异(P=0.332)外，饲粮维生素A水平对肉鸡十二指肠NO含量以及相关酶活性均有显著影响(P＜0.05)。随维生素A添加水平的增加，21和42日龄肉鸡十二指肠NO含量(P=0.001，R2=0.34；P < 0.001，R2=0.70)及iNOS(P=0.009，R2=0.22；P=0.002，R2=0.29)和42日龄tNOS活性(P < 0.001，R2=0.67)均呈显著的一次线性降低，30 000和45 000 IU/kg组NO含量和相关酶活性显著低于3 000和6 000 IU/kg组(P < 0.05)。
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表 6 饲粮添加不同水平的维生素A对肉鸡十二指肠组织NO含量及相关代谢酶活性的影响 Table 6 Effects of dietary supplementation with different levels of vitamin A on NO content and related metabolic enzyme activities in duodenum of broilers |
由表 7可知，在整个试验期，饲粮维生素A添加水平对肉鸡肝脏和十二指肠组织中iNOS基因相对表达量均存在显著影响(P＜0.05)。21日龄肉鸡肝脏(P=0.003，R2=0.27)、21和42日龄肉鸡十二指肠组织(P=0.001，R2=0.32；P=0.002，R2=0.30)中iNOS基因相对表达量随着维生素A添加水平的增加均呈显著的一次线性降低(P < 0.05)，30 000和45 000 IU/kg组iNOS基因相对表达量显著低于3 000、6 000和15 000 IU/kg组(P < 0.05)。42日龄的肉鸡肝脏中iNOS基因相对表达量与饲粮维生素A添加水平呈显著的二次曲线下降的剂量依赖关系(P=0.007，R2=0.41)，以15 000 IU/kg组相对表达量最高，30 000和45 000 IU/kg组最低。
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表 7 饲粮维生素A水平对肉鸡肝脏和十二指肠中iNOS基因相对表达量的影响 Table 7 Effects of dietary supplementation with different levels of vitamin A on related expression level of iNOS gene in liver and duodenum of broilers |
胸腺、脾脏和法氏囊是肉鸡的三大免疫器官，胸腺位于颈静脉附近，是T淋巴细胞发育、成熟的场所；脾脏与体液免疫关系密切，是B淋巴细胞与巨噬细胞生成的重要场所[11]。法氏囊又称腔上囊，是禽类独有的免疫器官，是B淋巴细胞生成、发育和分化的主要场所。通常认为免疫器官重量与其所含免疫细胞数目成正比关系，免疫器官指数反映淋巴细胞的增殖状况，免疫器官指数增加提示机体免疫机能增强[12]。研究指出，维生素A可能通过调节淋巴细胞的分化进而调控机体免疫器官的发育[13]。Yang等[14]研究表明，与对照组相比，饲粮添加9 000~12 000 IU/kg维生素A可以提高雏鹅法氏囊指数。梁静茹等[15]研究表明，饲粮添加16 000 IU/kg的维生素A对种公鹅的脾脏生长存在抑制作用。本试验结果与上述研究结果基本一致，饲粮维生素A添加水平超过15 000 IU/kg时肉鸡法氏囊指数降低，30 000 IU/kg以上的维生素A添加水平使肉鸡脾脏指数趋于显著的下降，表明高水平的维生素A抑制了肉鸡免疫器官的发育，从而抑制其免疫功能。
3.2 饲粮添加不同水平维生素A对肉鸡血清免疫因子含量的影响细胞免疫因子是由免疫细胞(如单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激诱导而合成、分泌的一类高活性、多功能多肽或蛋白质，可以作为细胞间的信号传递分子并调节炎症反应，如IL-1、IL-6和TNF-α等释放在局部作用于免疫细胞，可增强免疫反应[16]。有研究表明，缺乏维生素A的大鼠体内淋巴细胞数量明显减少，易出现肠道感染[17]，但维生素A过量也会使辅助T细胞活化途径受损，进而影响IL-2的分泌释放[18]。Wang等[12]研究表明，肉鸡饲粮添加5 400~10 800 IU/kg的维生素A可上调IL-1β、IL-2和TNF-α的基因表达，而当维生素A水平达到21 600 IU/kg时，以上细胞因子的基因表达量呈现下调趋势。本试验结果显示，饲粮添加超过15 000 IU/kg的维生素A时，肉鸡21和42日龄血清中IL-1含量及42日龄血清中IL-6和TNF-α含量下降，提示饲粮维生素A水平超过15 000 IU/kg时，肉鸡机体免疫功能开始受到抑制，饲粮添加30 000和45 0000 IU/kg的维生素A显著降低了血清中IL-1、IL-2、IL-6和TNF-α等细胞免疫因子的含量，对机体免疫功能造成不利影响，可能的原因是高剂量的维生素A降低了淋巴细胞的数量从而对肉鸡免疫功能产生负面作用。Yuan等[19]研究表明，饲粮添加20 000 IU/kg以上的维生素A会损伤肉鸡T-淋巴细胞从而使其免疫功能下降，与本试验结果一致。另一方面，肉鸡的胸腺、脾脏和法氏囊均是IL-1和IL-2等免疫因子合成和分泌的重要器官[20]，本研究中，30 000~45 000 IU/kg的维生素A水平降低了血清免疫因子含量，可能与高水平的维生素A抑制了肉鸡法氏囊发育从而抑制了血清免疫因子的释放有关。
3.3 饲粮添加不同水平维生素A对肉鸡肝脏、十二指肠组织中NO含量、iNOS和tNOS活性以及肝脏、十二指肠iNOS基因相对表达量的影响NO是一种高活性的气体分子，由巨噬细胞分泌，在肝脏细胞、十二指肠细胞和血管内皮细胞中均可生成，参与机体细胞和组织的多种生理功能，如作为机体免疫功能和神经传递中的信号分子、调节骨细胞的生成与分解、调节血管通透性维持内环境稳态等[4, 21]。本试验结果显示，饲粮添加30 000和45 0000 IU/kg维生素A显著降低了肉鸡肝脏和十二指肠中NO含量、iNOS和tNOS的活性，且十二指肠中iNOS基因相对表达量显著下降，血清免疫细胞因子含量也呈相似的变化规律，这表明高添加水平的维生素A会抑制免疫器官的生长，抑制免疫细胞因子的分泌和释放，同时抑制了组织中iNOS基因相对表达量，使组织中NO的生成分泌受限，从而抑制机体免疫功能。目前，有关维生素A对NO的生成与调节作用的研究主要集中在人类和小鼠等领域。研究表明，维生素A可以通过提高视黄酸受体的蛋白表达量抑制核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的磷酸化程度，降低iNOS基因与蛋白的表达，从而降低NO含量[1, 22]。Okada等[23]在体外研究中利用脂多糖(LPS)刺激奶牛乳腺上皮细胞，结果显示细胞中IL-1、IL-2以及iNOS大量生成。同样，Dheen等[24]利用LPS刺激小鼠小胶质神经细胞，使细胞中iNOS和TNF-α基因的表达量上升，同时生产大量的NO。以上结果提示，细胞免疫因子通常从多条途径介导NO生成，维生素A通过调节免疫细胞因子的释放从而调节NO的产生。最近的一项体外试验表明，维生素A可以影响小鼠皮肤成纤维细胞NO的生成，并呈现低水平促进而高水平抑制的剂量效应[25]，这与本研究的结果一致，但关于维生素A调节肉鸡NO生成的报道鲜见，具体机理还需进一步研究。
4 结论本试验条件下，饲粮添加6 000~15 000 IU/kg的维生素A促进了肉鸡法氏囊的发育。肉鸡肝脏和十二指肠组织中NO含量和iNOS、tNOS活性及iNOS基因相对表达量与饲粮维生素A添加水平呈剂量依赖关系，低剂量提高各组织NO含量，上调iNOS基因的表达，而高剂量则出现抑制作用。
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