2. 上海奶牛育种中心有限公司, 上海 200436
2. Shanghai Dairy Cattle Breeding Center Co., Ltd., Shanghai 200436, China
目前许多种公牛站存在着种公牛繁殖性能减弱、精液质量差的问题,这直接关系到种公牛站的生存与发展。研究表明,影响种公牛繁殖性能和精液质量的因素有很多,包括环境因素,如温度和光照[1];公牛的生理状态,如品种和年龄[2]以及公牛的饲养管理[3]。然而现在规模化、集约化程度的大幅提高,环境条件和生理状态相对一致,所以种公牛营养的供给将直接影响其繁殖潜力和精液质量。
维生素D3本身不具有活性,它可以先被细胞色素酶(CYP2R1)转化为25羟基维生素D3(25VD3),然后被CYP27B1转化为活性形式的1, 25二羟基维生素D3[4-5]。维生素D的作用机制是1, 25二羟基维生素D3激活靶组织内的维生素D受体,从而发挥维生素D3的大部分生理作用。睾丸、生殖细胞和雄性生殖道上皮细胞也存在维生素D受体和CYP27B1,这表明维生素D在精子形成和成熟以及性激素分泌的过程中发挥重要作用,可能有助于提高种公牛繁殖功能[6]。研究表明,饲喂高剂量维生素D3可提高血清25VD3含量,改善精子质量、激素合成、精浆成分[7]。25VD3是维生素D3转化为最终活性形式1, 25二羟基维生素D3的中间代谢物产物,它的半衰期比1, 25二羟基维生素D3长,并且有研究表明,牛[8]、禽[9]和猪[10]对25VD3的吸收效率和体内代谢活性均高于维生素D3,因而成为研究热点。
维生素D3被认为与种公牛的繁殖能力有关,但有关25VD3对不同生理阶段荷斯坦种公牛冻精品质和健康影响的研究却鲜有报道。因此,本研究目的是评价25VD3替代维生素D3对不同阶段种公牛的冻精品质、精浆抗氧化能力、营养物质表观消化率以及钙、磷、镁代谢的影响,旨在为高效利用25VD3提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计所有动物试验操作均按照东北农业大学动物保护委员会的原则和操作指南进行(编号:NEAU-[2011]-9)。本试验在上海奶牛育种中心进行。试验选取32头荷斯坦种公牛(16头为平均30月龄和16头为平均12月龄),根据体重、年龄和精子活力随机分组。试验预试期14 d,正试期60 d。公牛被拴系在单独的围栏里,围栏上配有自动饮水器。每天07:00和13:30饲喂2次,自由采食。每天调整给料量,以达到至少5%的剩料量。荷斯坦种公牛试验饲粮,参照中国《奶牛饲养标准》(NY/T 34—2004)[11]中种公牛营养需要配制而成,基础饲粮组成及营养水平如表 1所示,精料由光明牧业有限公司配制。
本试验为完全随机区组2×2双因素(不同形式维生素D3和不同阶段种公牛)试验设计,不同形式维生素D3分别为25VD3和维生素D3,不同阶段种公牛分别为16头平均30月龄成年荷斯坦种公牛和16头平均12月龄青年荷斯坦种公牛,共分为4个组:成年牛维生素D3组(300 IU/kg)、成年牛25VD3组(300 IU/kg)、青年牛维生素D3组(300 IU/kg)、青年牛25VD3组(300 IU/kg)。25VD3由某生物工程有限公司提供(产品含量为20 000 IU/g)
1.2 采食量和营养物质表观消化率的测定记录正试期的上料量及剩料量并算出采食量,每周收集饲料样品,并在研究结束时将其集合成每月1批进行营养成分分析。于试验期第58、59和60天进行代谢试验,连续3 d每隔6 h收集1次新鲜粪样,收集的粪样缩合至500 g 2份,其中每100 g添加5 mL 10%稀硫酸固氮后冷冻保存,另一份直接冷冻保存直至分析。饲料和粪样55 ℃烘干48 h,回潮24 h,粉碎过40目筛。样品的干物质、粗蛋白质和粗脂肪含量按AOAC(2000)[12]方法进行分析。根据Van Soest等[13]方法测定中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。根据AOAC(2000)[12]方法,采用电感耦合等离子质谱法测定样品的钙、磷和镁含量。营养物质表观消化率以盐酸不溶灰分(AIA)为指示剂,参照GB/T 23742—2009《饲料中盐酸不溶灰分的测定》[14]方法测定AIA含量。采用内源指示剂法测定营养物表观质消化率,计算公式如下:
于试验期第58、59和60天进行尿液样品的采集,连续3 d每隔6 h用收集容器收集1次尿液,尿样中会有杂质,用粗纱布过滤后放入干燥洁净的50 mL试管中。
按照Martinez等[15]采用原子吸收方法测定尿样中总钙和总镁含量。尿样总磷含量采用钼蓝法[16]测定。
于试验期第1、30和60天08:30用预热过的人工阴道采集精液。在37 ℃使用三羟甲基氨基甲烷稀释液将精液逐渐稀释,稀释后的精液样品在5 ℃冷柜冷藏2 h。使用自动装填机将精液自动装填至0.25 mL吸管中。然后将吸管在7 min内程序冷冻至-140 ℃,在液氮蒸汽中悬浮10 min,然后浸入-196 ℃液氮中保存。冷冻保存的精液在37 ℃水浴中解冻30 s。然后将解冻的精液转移到预热过的试管中,在37 ℃的水浴中孵育2 h,并且用伊红-黑素染色法观察精子的活力和异常情况[17]。玻片用精液、伊红和黑精混合染色法涂片,对载玻片中200个精子进行计数,分为未染色的活精子和完全或部分染色的死精子。载玻片进一步检查精子异常:头部异常、尾部异常、中段异常、头部脱落、尾部盘绕、存在细胞质液滴。按照Chinoy等[18]用硝酸银染色法评价精子顶体完整性。按照Revell等[19]采用低渗透肿胀试验评估精子质膜完整性。收集解冻后的精液,1 500 r/min分离15 min,然后收集精浆,精浆总抗氧化能力、丙二醛含量及过氧化氢酶和还原型谷胱甘肽活性使用商业试剂盒(南京建成生物工程研究所)按说明书检测。
1.5 数据处理与分析本试验数据采用SAS 9.4双因素混合模型程序进行分析。结果以平均值和均值标准误(SEM)表示。当P≤0.05时为差异显著,当0.05 < P≤0.10时为存在显著趋势,P < 0.01时为差异极显著。当维生素D3形式×种公牛阶段之间的交互作用显著时,使用LSMEANS语句中的SLICE选项来确定因素之间的差异。当维生素D3形式和剂量之间的相互作用显著时,使用Tukey进行多重均数比较。
2 结果 2.1 不同形式维生素D3对不同阶段荷斯坦种公牛冻精品质的影响由表 2可知,饲喂25VD3比饲喂维生素D3显著提高了种公牛精子活力和膜完整性(P < 0.05),有增加精子存活率的趋势(P=0.08)。成年种公牛解冻后精子活力(P < 0.05)和存活率(P < 0.01)均高于青年种公牛。
由表 3可知,添加25VD3有降低种公牛解冻精液中丙二醛含量的趋势(P=0.07)。成年种公牛解冻后精子过氧化氢酶活性显著高于青年种公牛(P < 0.05)。
由表 4可知,饲喂不同形式维生素D3的种公牛干物质采食量无显著差异(P>0.05)。不同生长阶段种公牛添加25VD3和维生素D3组的干物质、粗脂肪、中性洗涤纤维、磷和镁的表观消化率无显著差异(P>0.05)。但25VD3组种公牛钙表观消化率显著提高(P < 0.05),粗蛋白质表观消化率存在升高的趋势(P=0.09)。
由表 5可知,饲喂25VD3的种公牛尿磷和尿镁排出量显著低于饲喂维生素D3的公牛(P < 0.05)。成年种公牛钙、磷、镁的摄入量、沉积量和粪排出量以及尿磷排出量极显著高于青年种公牛(P < 0.01)。
1, 25二羟基维生素D3是维生素D3的主要代谢产物,是一种具有生物活性的类固醇激素,是维生素D的最高活性状态,主要是与细胞内的维生素D受体(VDR)结合,引起精子细胞内钙含量的升高,从而提高精子活力和介导精子的顶体反应,进而发挥生物学效应[20]。25VD3组有更高的精子活力,这是由于1, 25二羟基维生素D3与VDR结合后,通过三磷酸腺苷结合盒转运体A1编码基因(ABCA1)介导胆固醇从细胞内转运到细胞外,使蛋白磷酸化,从而提高细胞内钙离子含量,增加了脂肪酶活性,消耗了甘油三酯,加快精子运动,从而增加精子活力[21];也可能是补充25VD3增加了精子颈部和头部的钙含量,有助于提高精子活力[22]。精子膜完整性对脂质过氧化反应高度敏感,氧化自由基积累和抗氧化能力受损导致膜完整性降低以及精子DNA受损,因此精子膜完整率的升高归因于精浆抗氧化能力的增强。这与Lin等[23]研究相似,添加维生素D3有可能改善种公猪的精子质量和膜完整性。Blomberg Jensen等[24]和Mahmoudi等[25]研究表明,所有调节维生素D活性的成分,如VDR、24-羟基化酶(CYP24A1)和1α羟化酶(CYP27B1),在睾丸、附睾、精囊、前列腺和精子中都有表达,这表明维生素D对精子的发生和成熟非常重要。董洪俊[26]研究表明,饲粮添加25VD3显著增加了CYP24A1基因的表达,而在公猪上CYP24A1的高表达与精液品质呈正相关性,能够提高精子活力、正常精子百分比和精子膜的完整性。成年种公牛解冻精液的精子活力和精子存活率均高于青年种公牛,这是由于精液品质与种公牛达到体成熟时间有关,体成熟以前虽然可以进行采精,但生殖系统的功能还不是很完善,产精量较少、活力和存活率较低,而且性欲和交配能力较差[27]。
3.2 不同形式维生素D3对不同阶段荷斯坦种公牛冻精抗氧化能力的影响丙二醛是脂质过氧化过程中产生脂质氧化终产物,可以引起黏膜损伤并激活补体系统,促使巨噬细胞释放出大量炎症介质,而精子内丙二醛的含量可反映膜脂过氧化损伤的程度。丙二醛含量过高会增加膜脂过氧化损伤,健康精液的丙二醛含量显著低于不孕症精液。本研究中饲喂25VD3有降低解冻精浆中丙二醛含量的趋势,与Yang等[28]研究结果相似,饲粮中添加25VD3可提高断奶仔猪谷胱甘肽过氧化物酶活性并且降低丙二醛含量。成年种公牛冻精中过氧化氢酶活性高于青年种公牛,过氧化氢酶是一种抗氧化酶,它能够将过氧化氢转换成水和氧气,阻止氧化反应从而保护精子[29]。饲喂25VD3对超氧化物歧化酶活性、总抗氧化能力、还原型谷胱甘肽含量无显著影响,这与彭巍等[30]试验结果不同,这可能由于精液冷冻保存过程中产生了活性氧自由基造成了精子氧化损伤。
3.3 不同形式维生素D3对不同阶段荷斯坦种公牛干物质采食量和营养物质表观消化率的影响李晓彤等[31]试验报道,反刍动物血钙含量直接影响瘤胃平滑肌收缩程度。围产期低血钙症严重影响奶牛胃肠道平滑肌收缩从而降低干物质采食量。尽管本试验补充25VD3的青年种公牛干物质采食量稍有增加,但未发现不同形式维生素D3对干物质采食量的显著影响。可能是由于血钙含量降低到一定阈值以下才会显著影响干物质采食量。饲喂25VD3可改善蛋白质和钙表观消化率。这与张帆等[32]研究结果相似,维生素D3在奶牛钙、磷代谢的过程中起着重要的作用,能够促进钙盐在骨中的沉积和钙化。冯冠智等[8]也报道了,饲粮中添加25VD3可显著提高种公牛血清中钙、磷含量。维生素D缺乏症常见的影响是肠道对钙和磷的吸收不良,饲粮中补充25VD3可提高血液循环中的钙离子含量,从而增加细胞内钙离子含量,从而促进了钙的吸收与利用。
3.4 不同形式维生素D3对不同阶段荷斯坦种公牛钙、磷、镁代谢的影响饲喂25VD3可增强肾小管对磷和镁的重吸收作用。这是由于25VD3的增加转化为更多的1, 25二羟基维生素D3,它在肾小管中可抑制1α羟化酶活性,激活24羟化酶,协同甲状旁腺素对钙的重吸收作用,促进钙结合蛋白、钙泵等介导的跨上皮钙转运[33]。由于镁离子和钙离子同为2价阳离子,可推测影响镁的重吸收作用的机制可能与钙的作用方式相近。饲喂25VD3可增加对饲粮中磷和镁的重吸收从而降低生产成本、减少环境污染。因此饲粮中添加25VD3是提高钙、磷吸收效率维持机体矿物质平衡的有效方式。成年种公牛的钙、磷、镁的摄入量、沉积量和粪排出量以及尿磷排出量高于青年种公牛,这与初汉平[34]研究结果相反,软组织和骨骼发育活跃期的青年奶牛的生长会导致钙、磷的需要量增加,而随着动物软组织和骨骼的成熟,钙、磷的需要量会减少。本试验可能是由于种公牛的钙、磷、镁需要量与个体体重有关,而成年种公牛由于高体重所以需要摄入更多的钙、磷、镁才能维持自身机体的正常,这也间接导致了尿液和粪便的钙、磷、镁排放量增加。
4 结论与同等水平维生素D3相比,饲粮中添加25VD3能增加成年种公牛解冻精液的精子活力、膜的完整性,从而改善了精液质量,提高钙表观消化率以及增加对饲粮中磷、镁的重吸收作用,降低尿液磷、镁的排放量,从而降低生产成本、减少环境污染。
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