2. 青岛康大食品有限公司, 青岛 266555
2. Qingdao Kangda Food Co., Ltd., Qingdao 266555, China
仔兔断奶后并行换料(由断奶前吃母兔料改为仔兔料)，双重应激造成仔兔胃肠道功能紊乱，导致腹泻率增长，严重影响家兔养殖的经济效益。抗生素的大量使用、药物残留及耐药菌株的产生等问题严重影响畜产品质量，食品安全问题越来越受到消费者的关注。因此，绿色、安全的饲料添加剂得到了畜牧养殖者的认可。抗菌肽是宿主先天性免疫防御系统产生的一类具有多种生物学活性的小分子多肽，多为阳离子多肽，具有广谱抗菌性、热稳定性强、不易产生耐药性、无残留等特点[1]。牛至精油是一种植物提取物，具有天然香辛味，具有刺激动物消化酶分泌、增强畜禽机体免疫力、减少肠道疾病等作用[2]。饲粮中添加牛至精油能提高家兔的抗氧化性能[3]，本实验室前期试验研究了不同剂量的牛至精油对肉兔腹泻的影响，发现饲粮中添加0.08%的牛至精油对肉兔的腹泻有很好的改善效果[4]。抗菌肽饲料添加剂应用较为广泛，饲粮中添加0.15%以上的抗菌肽能显著提高肉兔的平均日增重，改善饲料转化效率[5]。先前研究主要集中在对牛至精油和抗菌肽在肉兔饲粮中的单一应用，但对于牛至精油和抗菌肽联合使用的研究较少。因此，本试验在肉兔饲粮中联合添加0.08%牛至精油和0.15%抗菌肽，研究其对断奶后肉兔腹泻率及肠道屏障的影响，为牛至精油和抗菌肽在生长肉兔生产中的联合应用提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计与饲养管理324只体重相近的健康断奶肉兔(38日龄)免疫后(兔瘟)随机分为2组(每组9个重复，每个重复18只兔)：对照组饲喂基础饲粮(基础饲粮组成及营养水平见表 1)，试验组在基础饲粮中联合添加0.08%的牛至精油(纯度5%)和0.15%的抗菌肽(纯度0.4%，主要成分是植物乳杆菌及其代谢产物，核心代谢产物为肠杆菌肽)。试验过程中每天早上进行消毒，兔舍自然采光和通风，自由采食和饮水，统计整个试验期内的采食量、体增重和腹泻情况，并计算料重比(平均日采食量/平均日增重)和腹泻率(发生腹泻的只数/总只数×100)。试验结束后，每个组选取8只兔(公母各占1/2)进行屠宰，分离小肠各肠道用多聚甲醛固定用于制作切片，另分离空肠和回肠黏膜组织于液氮中，用于RNA提取和免疫指标测定。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
将采集小肠各段的样品进行常规石蜡包埋，切片，用苏木精-伊红(HE)染色法进行染色，待组织切片干燥后，置于显微镜观察。测定绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度(VH/CD)。
1.3 总RNA的提取与基因表达RNA采用Trizol法提取，用琼脂糖凝胶电泳和生物分光光度计分别检测RNA的质量和浓度。按照宝生物工程(大连)有限公司的逆转录和荧光定量试剂盒操作说明，将RNA反转录成cDNA，荧光定量PCR反应体系为20 μL：10 μL SYBR，PCR正向、反向引物各0.4 μL(10 μmol/L)，0.4 μL ROX燃料(50×)，2 μL cDNA模板和6.8 μL双蒸水。PCR循环参数为：95.0 ℃预变性10 s；95.0 ℃变性5 s，60 ℃延伸和退火34 s，共40个循环。目的基因相对表达量使用2-△△Ct方法计算。内参基因为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。引物序列及参数见表 2。
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表 2 引物序列及参数 Table 2 Primer sequences and parameters |
测定肉兔的空肠和回肠组织中白细胞介素-10(IL-10)、分泌型免疫球蛋白G(SIgG)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量，采用上海恒源生物有限公司酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒进行测定。
1.5 数据处理与统计分析本试验使用Excel 2000进行数据处理，使用SAS 8.2统计软件进行t检验分析，P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽对生长肉兔生长性能的影响由表 3可知，与对照组相比，抗菌肽和牛至精油联合饲喂显著增加了肉兔平均日增重(P < 0.05)，而对平均日采食量无显著影响(P>0.05)；与对照组相比，联合添加抗菌肽和牛至精油显著降低了肉兔料重比和腹泻率(P>0.05)。
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表 3 饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽对肉兔生长性能的影响 Table 3 Effects of combined dietary oregano essential oil and antibacterial peptides on growth performance in meat rabbits |
由表 4可知，饲粮联合添加牛至精油和抗菌肽对肉兔空肠的隐窝深度、VH/CD影响均不显著(P>0.05)，但显著增加了空肠的绒毛高度(P < 0.05)；对肉兔回肠隐窝深度影响不显著(P>0.05)，但显著增加了回肠的VH/CD(P < 0.05)。
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表 4 饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽对肉兔肠道黏膜发育的影响 Table 4 Effects of combined dietary oregano essential oil and antibacterial peptides on intestinal mucosal development in meat rabbits |
由表 5可知，饲粮联合添加牛至精油和抗菌肽对肉兔空肠闭锁蛋白(Occludin)、闭合小环蛋白1(ZO1)和闭合小环蛋白2(ZO2)基因相对表达量影响不显著(P>0.05)，却显著增加闭合蛋白1(Claudin1) 和连接黏附分子3(JAM3)基因相对表达量(P < 0.05)；在回肠中，饲粮联合添加牛至精油和抗菌肽显著降低了回肠中Claudin1基因表达相对表达量(P < 0.05)，而对肉兔回肠Occludin、ZO1、ZO2和JAM3基因相对表达量无显著影响(P>0.05)。
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表 5 饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽对肉兔空肠和回肠机械屏障基因相对表达量的影响 Table 5 Effects of combined dietary oregano essential oil and antibacterial peptides on relative expression level of intestinal gene related mechanical barrier in meat rabbits |
由表 6可知，饲粮联合添加牛至精油和抗菌肽显著降升高了空肠中IL-10的含量(P < 0.05)，却显著降低了空肠中TNF-α的含量(P < 0.05)，而对空肠中SIgG的含量无显著影响(P>0.05)；在回肠中，饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽显著升高了SIgG的含量(P < 0.05)，而对IL-10和TNF-α的含量无显著影响(P>0.05)。
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表 6 饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽对生长肉兔肠道免疫屏障指标的影响 Table 6 Effects of combined dietary oregano essential oil and antibacterial peptides on intestinal immune barrier indexes in meat rabbits |
牛至精油是一种较为典型的植物提取物，能够改善机体免疫力，提高生产性能。有研究结果表明，在母猪饲粮中添加牛至精油，能够提高仔猪生长速度[6]。抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的多肽类物质，在饲粮中添加抗菌肽可显著提高仔猪和肉仔鸡的平均日增重和采食量，从而提高了生产性能[7-8]。本试验研究结果显示，联合添加0.15%抗菌肽与0.08%牛至精油虽然对平均日采食量无显著影响，但显著提高了肉兔的平均日增重，提高了饲料转化效率，这可能与试验组肉兔对饲粮的吸收效率有关，植物精油能增加胆盐的分泌，提高肠黏膜和胰腺的酶活性[9]。
腹泻是兔场的常见疾病，严重影响肉兔的生长性能，先前的众多研究发现牛至精油和抗菌肽在畜禽肠道健康中有一定的调节作用。先前研究表明，饲粮中添加单一牛至精油，能显著降低仔猪和蛋鸡的腹泻率[10-11]。饲粮中添加抗菌肽也可显著降低仔猪的腹泻率[12]。先前试验研究发现，饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽能显著减低肉兔的死亡率[4]。本试验中，饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽后，肉兔的腹泻率由原来的25.93%降为12.35%，效果较为明显，其主要原因可能与牛至精油和抗菌肽添加后肠道免疫机能增强有关。
3.2 饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽复合对生长肉兔肠道机械屏障的影响绒毛高度和隐窝深度是衡量小肠吸收能力的重要指标，绒毛高度越高，小肠的吸收面积越大，VH/CD越大，肉兔对营养物质的吸收能力越强[13]。有研究发现，牛至精油可以提高肉鸡回肠绒毛高度以及VH/CD[14]。Tekce等[15]研究发现，在热应激的条件下使用牛至精油，仍然可以改善肉鸡的小肠绒毛高度和隐窝深度。有研究发现，使用抗菌肽与玉屏风散联合应用没有显著影响肠道绒毛发育，对肉鸡营养消化没有影响[16]。本试验研究结果显示，饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽可以显著增加空肠及回肠的绒毛高度，显著提高VH/CD，联合添加牛至精油和抗菌肽在一定程度上改善了肉兔的肠道形态发育，提高了肉兔的消化吸收能力。
肠道黏膜通透性也是肠道机械屏障的一个重要组成部分，紧密连接蛋白是构成肠道物理屏障和细胞旁通透性的关键决定因素[17]。大约有50种蛋白质参与紧密连接的形成，主要为Occludin、Claudins和JAM 3种完整的跨膜蛋白和ZO。这些跨膜蛋白(Occludin、Claudins和JAM)的胞外域与相邻细胞构成选择性屏障，参与调节细胞间黏附、移动及细胞的通透性，而胞内域则与细胞质内的ZO相连。本试验结果显示，使用牛至精油以及抗菌肽显著提高了肉兔空肠Claudin1和JAM3基因相对表达量，提示联合添加牛至精油以及抗菌肽能够改善空肠的通透性，增加了机械屏障功能。在回肠中，饲粮中添加牛至精油和抗菌肽对Claudin1基因相对表达量的影响与空肠中相反，表明牛至精油和抗菌肽对肠道Claudin1基因相对表达量具有位置特异性，具体机制尚未清楚。此外，本试验还发现，联合添加牛至精油和抗菌肽对回肠中所测机械屏障相关基因相对表达量无显著影响，说明联合添加牛至精油以及抗菌肽对小肠后端机械屏障的影响不显著。
3.3 饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽对生长肉兔肠道免疫屏障的影响肠道具有大量的微生物以及众多的免疫细胞，被称为动物的“天然屏障”，是动物体最大的免疫器官。肠道免疫屏障主要由肠黏膜固有层、淋巴细胞以及肠道上皮内的免疫因子构成。SIgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，具有调理、凝集以及沉淀抗原等重要作用[18]。IL-10是一种细胞因子抑制合成抑制因子，主要由Th2细胞产生，同时也是一种抗炎性细胞因子[19]。TNF-α是由单核-巨噬细胞产生的一种细胞验证因子，具有激活上皮细胞，诱导趋化因子，促使中性粒细胞聚集，增强其纤溶酶活性和吞噬作用，加速肠黏膜损伤[20]。郭明[21]研究发现，合生素和天蚕素抗菌肽两者联合使用可以显著提高血液中免疫球蛋白A含量。同样在本试验结果中发现，在饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽可显著提高回肠IgG含量，提示机体免疫力增强。饲粮中联合添加牛至精油和抗菌肽也显著提高肉兔空肠IL-10含量，对回肠IL-10含量影响不显著，表明提高了肉兔机体的抗炎能力。对TNF-α进行分析发现，联合添加牛至精油及抗菌肽降低空肠中炎症因子TNF-α的含量，减轻了其对肠黏膜的损伤。综合来看，在饲粮中联合添加0.08%牛至精油和0.15%抗菌肽对生长肉兔肠道免疫具有促进作用，提高了肉兔机体免疫力。
4 结论在饲粮中联合添加0.08%牛至精油和0.15%抗菌肽提高了肉兔的平均日增重，降低了肉兔的料重比和腹泻率，提高了肠道的机械屏障和免疫屏障，提高了机体免疫力。
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