鱼粉是肉食性鱼类饲料中不可或缺的蛋白质来源，2012年我国鱼粉年产量约为120万t，此后受渔业资源有限及环保趋紧影响，2018年降至40万t[1]。为应对鱼粉供不应求的市场局面和缓解鱼粉价格波动的冲击，降低饲料成本，寻找合适的鱼粉替代品，开发低鱼粉、无鱼粉饲料已成为国内外饲料界的一个重要课题。在植物蛋白质源中，大豆具有来源广泛、产量稳定、蛋白质含量高、氨基酸比例适宜等优点，被视为替代鱼粉的最有潜力的植物蛋白质源。豆粕是大豆提取油脂后的副产物，是水产饲料中利用最为广泛的植物蛋白质源[2]，但其热敏性的抗原蛋白和不良寡糖等抗营养因子成分含量高，饲喂后对动物健康造成一定损害。微生物发酵是克服豆粕替代鱼粉在水产养殖中局限性的一种高效、经济和环保的方法。豆粕经过微生物的发酵作用，难吸收的大分子蛋白质、糖类降解为易消化吸收的小分子物质，抗营养因子成分有效去除，并且益生菌增殖可以抑制有害菌生长，改善动物肠道菌群结构。大黄鱼(Pseudosciaena crocea)是我国重要的海水养殖鱼类，肉质鲜美，经济价值大，0.57 g的大黄鱼所需饲料蛋白质水平在47%以上[3]。因此，以发酵豆粕替代大黄鱼饲料中的部分鱼粉具有重要意义。鱼类饲料中发酵豆粕替代鱼粉的研究多有报道，研究结论却不尽相同。吴钊[4]研究发现，发酵豆粕替代20%的鱼粉饲喂大黄鱼时鱼体各项指标较佳；张艳秋[5]研究表明，相较于对照组的400 g/kg鱼粉饲料，发酵豆粕可将花鲈饲料中的鱼粉含量降至240 g/kg；Wang等[6]研究发现，植物乳杆菌P8发酵豆粕替代大菱鲆45%的鱼粉，其总抗氧化能力提高，生长性能与全鱼粉组相当；Rahimnejad等[7]研究显示，用发酵豆粕替代40%的鱼粉不会显著影响鱼体生长和过氧化氢酶活性，却会导致前肠蛋白酶活性降低；Catalan等[8]研究表明，30%发酵豆粕替代鱼粉对大西洋鲑生长及健康状况有积极影响；Dong等[9]报道，采用枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸杆菌混菌两步发酵的豆粕替代虹鳟饲料中40%的鱼粉不会对虹鳟的生长和饲料利用率产生不利影响。本试验采用枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌混菌两步发酵技术，制备营养丰富、适口性好、活菌数高的发酵豆粕，并将其分别替代基础饲料中30%和50%鱼粉，探究其对大黄鱼生长性能、消化性能和非特异性免疫功能的影响，为生物发酵饲料在大黄鱼养殖中的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料发酵菌种枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌均为本课题组保藏菌种；大黄鱼由宁德某水产有限公司提供；豆粕和大黄鱼配合饲料由福建某生物科技有限公司提供；试剂盒均购于南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 试验仪器BS224S分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]、PHS-3C pH计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]、YXQ-LS-50高压蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司)、SW-CJ-2FD超净工作台(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、GNP-9080恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、ZWY-2101C恒温摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)、CF16RX II高速冷冻离心机[日立(中国)有限公司]、MULTISKAN GO酶标仪[赛默飞世尔(上海)仪器有限公司]、DHG-9240A电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、AE-8150蛋白电泳仪(日本ATTO公司)、ZWY-110X50水浴摇床(上海智城分析仪器制造有限公司)、FD-1-50真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)、DS-11FX荧光分光光度计[美国丹诺尔(Denovix)公司]、TU-100C恒温金属浴(上海一恒科技有限公司)。
1.3 豆粕发酵工艺优化 1.3.1 发酵菌种的制备 1.3.1.1 植物乳杆菌种子液的制备发酵培养基组成：无水葡萄糖2%，大豆蛋白胨4%，柠檬酸氢二铵0.3%，MnSO4·H2O 0.01%；培养条件：培养基初始pH 7.0，装液量100 mL/250 mL，接种量3%(v/v)，温度37 ℃，转速50 r/min，培养14 h，活菌数达到109 CFU/mL。
1.3.1.2 枯草芽孢杆菌种子液的制备发酵培养基组成：麦芽糊精1.5%，大豆蛋白胨2%；培养条件：培养基初始pH 7.0，装液量40 mL/250 mL，接种量2%(v/v)，温度37 ℃，转速200 r/min，培养20 h，活菌数达到109 CFU/mL。
1.3.2 发酵参数设定以小肽、游离氨基酸和乳酸含量为考察指标，选择发酵温度(A)、枯草芽孢杆菌接种量(B)、枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌接种比例(C)和发酵时间(D)进行4因素3水平正交试验，试验设计如表 1所示。
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表 1 豆粕发酵正交试验设计 Table 1 Orthogonal experimental design of fermented soybean meal |
采用变性结合加热的方法提取发酵豆粕中的蛋白质。称取1.00 g试样，加入80 ℃预热5 min的50 mL变性提取液[10]，搅拌提取30 min，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清，进行SDS-PAGE分析。
1.4.2 小肽含量测定试样过80目筛，取1.00 g样品加入6 mL 10%三氯乙酸[11]，160 r/min振荡30 min，补加24 mL超纯水，而后12 000 r/min离心3 min，取上清1 μL于荧光分光光度计测定小肽含量。
1.4.3 游离氨基酸含量测定样品处理同小肽含量测定，游离氨基酸含量测定参照李善仁[12]的方法。亮氨酸含量(y)与OD570(x)的关系式为：y=16.59x-0.1764(R2=0.990 2)。
1.4.4 枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌活菌数计数活菌计数固体培养基：葡萄糖20 g/L，大豆蛋白胨40 g/L，柠檬酸氢二铵3 g/L，MnSO4·H2O 0.1 g/L，CaCO3 20 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0，115 ℃灭菌30 min。
称取试样1.00 g，加入10 mL无菌水，充分混匀，梯度稀释后取10-7稀释液100 μL涂布于固体培养基平板，设3个平行，37 ℃培养24 h后进行菌落计数。
1.4.5 乳酸含量测定取0.5 g试样，加入5 mL 80%乙醇超声提取1 h，10 000 r/min离心3 min，取上清液按照梁琼[13]的方法进行乳酸含量测定，乳酸含量(y)与OD565(x)的关系式为：y=70.971x(R2=0.999 1)。
1.4.6 不良寡糖定性分析在80%的乙醇溶液中分别加入0.01 g水苏糖和棉子糖，溶解后4 ℃保存备用。称取发酵豆粕冻干粉5.0 g放入烧杯中，加入50.0 mL 80%的乙醇溶液，70 ℃水浴1 h，浸提液1 000 r/min离心10 min，取上清液4 ℃保存备用。按照苏亮[14]的方法进行薄层色谱(TLC)分析。
1.5 大黄鱼养殖试验 1.5.1 发酵豆粕的制备基质含水量50%，以正交试验得到的最优工艺进行发酵豆粕的制备，将其部分替代鱼粉配制大黄鱼饲料。
1.5.2 饲料配制首先配制鱼粉含量为25%的基础饲料(FM，作为对照)，然后在基础饲料配方基础上配制试验饲料：以发酵豆粕分别替代30%(FSBM-30)和50%(FSBM-50)的鱼粉，考虑到所有饲料成品的粗蛋白质、粗脂肪等营养成分含量应保持一致，而采用发酵豆粕取代鱼粉后粗蛋白质、粗脂肪含量会降低，因此相应地减少了试验组豆粕用量，增加了豆油用量。所用饲粮均含45%的粗蛋白质和12%的粗脂肪，以保证大黄鱼的最佳生长。大黄鱼饲料组成见表 2。
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表 2 大黄鱼饲料组成 Table 2 Composition of diets for large yellow croaker |
大黄鱼从海中打捞上岸后快速随机分装到各桶，适应期6 d后，将大黄鱼共270尾投入正式试验。每种饲料投喂3桶，每桶30尾鱼。各桶均采用增氧泵加充气石24 h增氧，使水中溶解氧浓度保持在5.0 mg/L以上。试验初始测得大黄鱼平均体长(11.07±1.71) cm，平均全长(13.26±1.80) cm，平均体重(22.81±9.16) g。正式养殖期为46 d，期间日投饵2次(09:00和17:00)，日投饵量为体重的2%，并根据采食情况进行相应的调整，每天记录摄食量和鱼死亡情况。每天上午投饵前换水、清污，据鱼体状态不定期进行消毒处理。
1.5.4 样品采集养殖试验结束后，停喂24 h，从各桶分别随机取样，每桶取10尾，用丁香油水门汀麻醉剂对鱼体进行麻醉，称量体重，测量体长和全长；之后用无菌采血器尾静脉采血，置于1.5 mL离心管中4 ℃过夜，4 ℃、11 000 r/min离心10 min，取血清，用于生化指标测定；取血完毕后解剖鱼体，取肝脏和脾脏称重，用于计算肝脏指数和脾脏指数；取胃肠道组织，用于消化酶活性测定。
1.5.5 指标测定 1.5.5.1 生长性能
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将胃肠道组织解冻，剁碎，加入适量0.85%生理盐水，充分混匀，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清液测定蛋白酶和淀粉酶活性。
蛋白酶活性采用福林-酚试剂法[15]测定，酶活性单位定义为：1 mL酶液每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活性单位，以U/mL表示。酪氨酸含量(y)与OD680(x)的关系式为：y=162.24x-0.537 5(R2=0.998 7)。
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式中：A×K为将OD680代入标准曲线得到的值；4为4倍，即0.8 mL反应液取出0.2 mL；10为反应时间10 min；n为稀释倍数。
淀粉酶活性采用碘比色法[16]测定，酶活性单位定义为：在一定反应条件下1 h内将1 g可溶性淀粉转化为糊精的酶量为1个酶活性单位，以U/g表示。淀粉含量(y)与OD660(x)的关系式为：y=6.535 0x+0.294 7(R2=0.993 0)。
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式中：(△A-b)/K为将OD660代入标准曲线得到的值；T为反应时间(min)；n为稀释倍数；V为酶液体积(mL)。
1.5.5.3 血清生化指标将血清解冻，测定酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性和丙二醛(MDA)、总蛋白(TP)含量。ACP、AKP、CAT、ALT和AST活性和MDA含量的测定按照试剂盒说明书进行。TP含量采用考马斯亮蓝G250染色法[17]进行测定，牛血清白蛋白(BSA)含量(y)与OD595(x)的关系式为：y=22.874x+8.134 8(R2=0.999 4)。
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式中：A为由标准曲线换算得到的蛋白质含量(μg)；n为稀释倍数；V为样品体积(mL)。
1.5.6 数据统计与分析数据采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较，显著性水平设为P < 0.05，极显著性水平设为P < 0.01。
2 结果与分析 2.1 豆粕发酵工艺优化在单因素试验基础上设计正交试验，结果见表 3。综合小肽、游离氨基酸和乳酸含量，确定最优组合为：A1B3C3D3，即发酵温度37 ℃，枯草芽孢杆菌接种量4%(v/m)，枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌接种比例1 ∶ 5，接种方式为接种枯草芽孢杆菌2 d后接种植物乳杆菌，共发酵5 d。
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表 3 正交试验结果分析 Table 3 Analysis of orthogonal test results |
由图 1可以看出，相比于未发酵豆粕，发酵豆粕中的7S和11S抗原蛋白得到有效降解，且15 ku以下小分子蛋白质含量增加，营养价值提高。
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泳道1：未发酵豆粕；泳道2：发酵豆粕；M: Marker。 Lane 1: unfermented soybean meal; lane 2: fermented soybean meal; M: Marker. 图 1 发酵豆粕与未发酵豆粕SDS-PAGE分析 Fig. 1 SDS-PAGE analysis of fermented soybean meal and unfermented soybean meal |
由表 4可知，发酵豆粕小肽含量达751.440 mg/g，较未发酵豆粕提高161%；游离氨基酸含量达388.623 μg/g，较未发酵豆粕提高17.87倍；乳酸含量达390.165 μg/g；枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌活菌数均达1010 CFU/g。
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表 4 发酵豆粕与未发酵豆粕有益成分含量比较 Table 4 Comparison of beneficial component contents in fermented soybean meal and unfermented soybean meal |
发酵后豆粕中的不良寡糖水苏糖与棉子糖被完全分解(图 2)。此外，从TLC图还可以看出豆粕中还有一种未知寡糖经过发酵作用得到去除。
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1：水苏糖标准品；2：棉子糖标准品；3：未发酵豆粕；4：发酵豆粕。 1: stachyose standard; 2: raffinose standard; 3: unfermented soybean meal; 4: fermented soybean meal. 图 2 薄层色谱分析发酵豆粕中的不良寡糖 Fig. 2 TLC analysis of unhealthy oligosaccharides of fermented soybean meal |
由表 5可知，大黄鱼的成活率、增重率、体长增长率、全长增长率、特定生长率、肥满度、肝脏指数、脾脏指数和饲料系数在各组之间均没有显著差异(P>0.05)。
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表 5 发酵豆粕替代部分鱼粉对大黄鱼生长性能和形态学指标的影响 Table 5 Effects of partial replacement fish meal by fermented soybean meal on growth performance and morphological indexes of large yellow croaker |
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表 6 发酵豆粕替代部分鱼粉对大黄鱼胃肠道消化酶活性的影响 Table 6 Effects of partial replacement fish meal by fermented soybean meal on intestinal digestive enzyme activities of large yellow croaker |
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表 7 发酵豆粕替代部分鱼粉对大黄鱼血清生化指标的影响 Table 7 Effects of partial replacement fish meal by fermented soybean meal on serum biochemical indexes of large yellow croaker |
由表 6可知，大黄鱼的胃肠道蛋白酶和淀粉酶活性在各组之间均无显著差异(P>0.05)。
2.3.3 发酵豆粕替代部分鱼粉对大黄鱼血清生化指标的影响由表 7可知，大黄鱼血清ACP、AKP、CAT、ALT、AST活性与MDA含量各组之间均无显著差异(P>0.05)，但FM组和FSBM-50组的血清TP含量显著高于FSBM-30组(P < 0.05)。
3 讨论 3.1 发酵豆粕替代部分鱼粉对大黄鱼生长性能的影响豆粕中存在的抗营养因子会对鱼类生长性能造成一定影响。本研究发现发酵豆粕替代50%的鱼粉对大黄鱼的生长性能和形态学指标没有显著影响，这与张帆等[18]对大黄鱼的研究结论一致，即豆粕替代45%的鱼粉对大黄鱼的增重率、特定生长率、饲料系数和成活率未产生显著影响。Li等[19]研究表明，希瓦氏菌MR-7发酵豆粕后胰蛋白酶抑制剂、大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白、棉子糖和水苏糖等抗营养因子含量分别降低了(90.19±0.42)%、(77.36±0.14)%、(84.52±0.18)%、(29.25±1.28)%和(24.25±1.84)%，可以替代大菱鲆饲料中45%的鱼粉而不影响其生长性能和饲料利用率。豆粕经过微生物发酵后，抗营养因子得以消除，因而适宜替代水平下不会对大黄鱼的生长产生不良影响。本试验中，由于试验中期爆发海水温水鱼类养殖最常见、经济损失也最大的淀粉卵涡鞭虫病，病鱼鳃和体表肉眼可见许多小白点，因养殖经验不足对病鱼没有及早发现，及时治疗，这种以包囊繁殖的疾病造成鱼体在极短时间内大批量死亡和消瘦，加上后期药浴治疗期间停止投喂1周，造成试验鱼存活和增重效果普遍不佳。
3.2 发酵豆粕替代部分鱼粉对大黄鱼消化性能的影响消化酶活性高低直接反映机体的消化吸收能力和环境适应力[20]。抗原蛋白的存在会损伤大西洋鲑和虹鳟肠道结构，降低消化酶活性[21]；不良寡糖棉子糖和水苏糖的存在会降低牙鲆胃肠道中蛋白酶的活性，影响消化性能[22]。本研究发现，FSBM-30组和FSBM-50组大黄鱼的肠道蛋白酶活性略高于和FM组。这可能是因为试验组中添加的发酵豆粕经过酶解和微生物分解，使得能抑制养殖动物肠道消化酶活性的各种抗营养因子被去除，易于吸收的小肽和游离氨基酸含量提高，并且益生菌及其分泌的酶进入动物消化道的“酶池”，一定程度上有助于调节宿主肠道微生态平衡和提高动物的消化率，最终表现为FSBM-30和FSBM-50组饲料系数降低。
3.3 发酵豆粕替代部分鱼粉对大黄鱼非特异性免疫功能和抗氧化能力的影响鱼类血液指标可反映机体的营养、代谢及健康状况，血液指标会随生理或病理指标的改变而变[23]。对免疫指标的测定能反映出饲料蛋白质源对动物的适合程度[24]。ACP和AKP是动物新陈代谢过程中重要的调控酶，受营养状况、环境变化、疾病和生长阶段的影响，对动物生存具有重要意义[25]。抗氧化酶是动物机体健康和对外界刺激反应的重要指标，CAT活性、MDA含量已被较多研究者用于评估蛋白质替代源对鱼类抗氧化能力的影响[26]。CAT能催化过氧化氢(H2O2)分解为水(H2O)和氧气(O2)[27]，使细胞免于遭受H2O2的毒害，促进细胞呼吸，提高机体的免疫防御能力[28]。MDA是脂质过氧化作用的最终产物，可作为生物体内源性氧化损伤的重要标志物[7]。ALT和AST是水产动物体内重要的免疫酶和氨基酸代谢酶，其在血液中活性的升高是肝脏发病的病理指标之一，是肝脏受损的灵敏指标[29]。已有研究报道，饲料中的豆粕可能会引起鲈鱼[7]和金头鲷[30]等鱼类的氧化应激反应，并且豆粕中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白会破坏鱼类的抗氧化系统，引起氧化损伤[31-32]。FM组和FSBM-50组大黄鱼血清TP含量显著高于FSBM-30组，由于动物血清TP含量可以反映肝脏健康状况和饲料质量[33]，上述结果说明发酵豆粕替代比例达到50%时大黄鱼的营养和健康水平与全鱼粉对照组相当。这与王赛等[34]用发酵豆粕替代褐点石斑鱼饲料中20%鱼粉时的研究结论一致，发酵豆粕替代饲料中20%鱼粉时石斑鱼血清TP含量下降。从本研究结果看，尽管各组之间大黄鱼抗氧化能力和肝脏健康状况无显著差异，ALT和AST活性测定结果仍然显示FM组大黄鱼肝脏可能受到轻微损伤，因而免疫机能下降，成活率降低，而FSBM-30组和FSBM-50组虽然饲料原料含植物性蛋白质源，但经过植物乳杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵作用，豆粕中对鱼类的抗氧化系统具有损伤作用的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白被完全去除，同时富含益生菌和消化酶，因而在一定程度上提高了大黄鱼的抗病力和抗氧化能力。
4 结论① 发酵最优工艺条件为：基质含水量50%，发酵温度37 ℃，枯草芽孢杆菌接种量4%(v/m)，枯草芽孢杆菌与植物乳杆菌接种比例1 ∶ 5，接种方式为接种枯草芽孢杆菌2 d后接种植物乳杆菌，共发酵5 d；在此条件下，7S、11S抗原蛋白和棉子糖、水苏糖等抗营养因子成分有效去除，易于吸收的小肽和游离氨基酸含量显著提高，富含益生菌和乳酸，产品营养价值和适口性提高。
② 发酵豆粕可替代饲料中50%的鱼粉而不会对大黄鱼的生长性能、消化性能和非特异性免疫功能和抗氧化能力产生不良影响。
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