2. 浙江农林大学动物科技学院·动物医学院, 杭州 311300;
3. 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室, 杭州 311300
2. College of Animal Science and Technology·College of Veterinary Medicine, Zhejiang A&F University, Hangzhou 311300, China;
3. Key Laboratory of Applied Technology on Green-Eco-Healthy Animal Husbandry of Zhejiang Province, Hangzhou 311300, China
外界环境的不良刺激如运输、免疫治疗、化学药品和饲养密度过大等，都会导致畜禽产生氧化应激，从而引起畜禽应激综合征这一常见问题[1]。氧化应激会引起机体细胞内大分子物质及生物膜系统发生损伤，并在一定程度上降低动物产品品质，如影响机体内脂肪沉积等。因此，在全面“禁抗”的前提下，适当地利用植物提取物提高畜禽的抗氧化能力，减少氧化应激造成的损失，是我国畜牧业实现产业转型升级的关键[2]。Zuk等[3]成功从人体脂肪组织分离纯化得到一种在体外培养条件下能够连续贴壁生长，并且可以向成骨、成脂、成肌等细胞分化的干细胞，由于其来源于脂肪组织，作为脂肪细胞的前体细胞故得名“脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)”。ADSCs是一类间充质干细胞，具有自我更新和多向分化潜能。Abdik等[4]研究表明，机体内脂肪的形成主要是ADSCs的分化过程，ADSCs在脂肪沉积中发挥着关键作用。而ADSCs发生氧化应激及凋亡会严重影响肌内脂肪含量[5]，进而影响肉质和风味，所以寻找一种有效抵抗机体氧化应激的物质变得尤为重要。
羟自由基是一种毒性极强的物质，可以参与机体内电子转移、脱氢等多种反应，对体内脂质、蛋白质以及核酸等物质造成不可逆的氧化损伤。过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)作为一种强氧化剂[6]可以自由穿过细胞膜，与细胞内Fe3+反应生成羟自由基，从而引起机体发生氧化应激，并且H2O2性质较稳定，在机体内不易分解，来源广泛易于获得，在诱导动物组织或细胞氧化损伤模型中已成为一种常用试剂[7-8]。根皮素(phloretin，PT)是法国化学家于19世纪30年代在苹果树皮中提取的一种具有二氢查尔酮结构的黄酮类植物多酚[9-10]，化学简式为C5H14O5[11]，化学名为2, 4, 6-三羟基-3-(4-羟基苯基)苯丙酮。多项研究发现，PT在桑树皮、荔枝果皮、海棠等多种植物中广泛存在[12]，并且在抗氧化、抗凋亡、抗炎、抗肿瘤、抗癌等方面均有较强的生理功能[13]。已有研究表明，PT可以清除机体内多余的活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)，增强抗氧化酶系中如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性[14-16]。在抗凋亡方面，PT使促凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(B-cell lymphoma/leukaemia-2-associated X protein，Bax)和抗凋亡相关基因B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukaemia-2，Bcl-2)在线粒体内重新分布，改变线粒体膜电位及膜通透性，进而影响线粒体功能，促进线粒体下游基因细胞凋亡蛋白酶半胱天冬酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)激活[17]。多项研究表明，PT可以有效逆转动物机体细胞或组织发生氧化应激或凋亡[18-19]，但是有关PT对牛ADSCs氧化应激影响的研究相对较少。因此，本研究用H2O2诱导牛ADSCs，模拟细胞发生氧化应激及凋亡时的状态，用PT对细胞进行预处理，然后进一步探究PT对牛ADSCs氧化损伤是否具有减缓作用，以期为改善牛脂肪沉积提供一定的理论依据，进而为改善牛肉肉质，促进养牛业发展奠定一定的基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 主要试剂胎牛血清(FBS)(货号：ST30-3302)购自PAN-Biotech公司；DMEM/F12基础培养基(货号：SH30023.01B)购自Hyclone公司；Ⅳ型胶原酶(货号：C8160-100 mg)购自杭州诺扬生物技术有限公司；双抗(货号：15140-122)、0.25%-乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶(货号：25200-56)购自Gibco公司；磷酸盐缓冲液(PBS)(货号：CBS101.05)购自CellMax公司；4%多聚甲醛(货号：P1110)、SOD检测试剂盒(货号：BC0175)、MDA检测试剂盒(货号：BC0025)和ROS检测试剂盒(货号：CA1410)均购自北京索莱宝科技有限公司；CD29抗体(货号：bs-20630R)、CD44抗体(货号：BH0185)、CD73抗体(货号：bs-4834R)、山羊抗兔二抗(货号：bs-0295G)、山羊抗鼠二抗(货号：bs-0295M)和增强型CCK-8试剂盒(货号：BA00208)均购自武汉博士德生物工程有限公司；Vimentin抗体(货号：ab8978)购自Abcam公司；曲拉通X-100(Triton X-100)(货号：T109026)购自Aladdin公司；牛血清白蛋白(BSA)(货号：A8806)和PT(货号：60-82-2)均购自Sigma公司；30% H2O2(货号：10011218)购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2 主要设备CO2细胞培养箱、超低温冰箱、高速低温离心机均购自Thermo Fisher公司；实时荧光定量PCR仪、酶标仪均购自Bio-Rad公司；激光共聚焦荧光显微镜购自Nikon公司；超净工作台购自青岛海尔特种电器有限公司；倒置相差显微镜购自重庆奥特光学仪器有限责任公司。
1.2 试验方法 1.2.1 牛ADSCs的分离培养参考前人的方法进行牛ADSCs的分离[20-21]：选用1月龄西门塔尔牛犊牛作为脂肪组织的供体，取其腹股沟脂肪组织，利用75%酒精进行消毒；剪成肉糜后加入Ⅳ型胶原酶，放置于CO2细胞培养箱30 min，期间每隔5 min进行吹打，使其充分消化。然后加入DMEM/F12完全培养基(DMEM/F12+10%FBS+1%青-链霉素双抗)终止消化，细胞筛过滤后200×g离心15 min，重悬细胞并接种至培养皿内培养，细胞贴壁后，将其标记为P0。待培养皿内细胞密度达90%左右时，进行细胞传代，用0.25%-EDTA胰蛋白酶消化细胞，DMEM/F12完全培养基终止消化，200×g离心5 min，剩余步骤同上并标记为P1，以此类推，每传1次代，细胞代数增加1代。选用P1~P10代细胞用于形态学观察，选用P3~P5代细胞用于后续试验。
1.2.2 牛ADSCs形态学观察选取牛ADSCs P1~P10代细胞，当细胞汇合度达到60%~90%时，通过倒置显微镜观察细胞形态。
1.2.3 牛ADSCs表面标记蛋白鉴定通过免疫荧光鉴定牛ADSCs表面标记蛋白[22]。待牛ADSCs细胞汇合度达到60%左右时，4%多聚甲醛室温固定30 min；PBS清洗后加入10%甲醇在-20 ℃冰箱中孵育10 min；PBS清洗后加入免疫荧光封闭液(PBS+10%FBS+3%BSA+0.3%Triton X-100)封闭2 h；加入一抗稀释液(PBS+3%BSA+0.3%Triton X-100+相应一抗)在-20 ℃冰箱中孵育过夜；PBS清洗后加入二抗稀释液(稀释比例为1 ∶ 1 000)室温避光孵育2 h；PBS清洗后加入4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色剂室温避光孵育30 min；吸去DAPI，加入抗荧光淬灭剂，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
1.2.4 H2O2构建牛ADSCs氧化应激模型待P4代牛ADSCs在96孔板内培养密度至80%左右时，用不同浓度[0(空白组)、100、200、500、1 000 μmol/L]H2O2处理牛ADSCs 24 h(参考前人氧化应激造模时间，选用24 h作为H2O2处理细胞时间[23])。处理24 h后换液，然后每孔加入10 μL CCK-8试剂后放入CO2细胞培养箱内孵育2 h；使用酶标仪检测450 nm下的吸光度值，计算细胞存活率。根据结果选择适宜浓度的H2O2用于构建氧化应激模型。
1.2.5 CCK-8法检测PT对牛ADSCs存活率的影响待牛ADSCs在96孔板内培养密度至80%左右时，用不同浓度[0(空白组)、1、10、50、100 μmol/L]PT处理牛ADSCs 4 h。处理后换液，每孔加入10 μL CCK-8试剂后放入CO2细胞培养箱内孵育2 h；使用酶标仪检测450 nm下的吸光度值，计算细胞存活率[16, 23]。根据结果选择适宜浓度的PT用于后续试验。
1.2.6 氧化应激相关指标的测定待牛ADSCs在6孔板内培养密度至80%左右时，先用不同浓度PT(0、10、50 μmol/L)预处理牛ADSCs 4 h，对牛ADSCs进行预保护；再利用500 μmol/L H2O2处理牛ADSCs 24 h。在此过程中，按照不同处理将细胞分为4组：空白组(0 μmol/L PT预保护，0 μmol/L H2O2处理)、氧化应激组(0 μmol/L PT预保护，500 μmol/L H2O2处理)、10 μmol/L PT预保护组(10 μmol/L PT预保护，500 μmol/L H2O2处理)、50 μmol/L PT预保护组(50 μmol/L PT预保护，500 μmol/L H2O2处理)。收集细胞后重悬；利用超声波破碎仪破碎细胞(冰浴，功率20%，超声3 s，间隔10 s，重复30次)；4 ℃，8 000×g离心10 min后取上清。参照MDA和SOD检测试剂盒操作步骤逐步进行后续试验，计算细胞中MDA含量和SOD活性[16]。
1.2.7 牛ADSCs内ROS含量的测定待P4代牛ADSCs在12孔板内培养密度至80%左右时，按照1.2.6的方法分组处理细胞。随后加入10 μL 2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)后放入CO2细胞培养箱内孵育20 min，DMEM/F12基础培养基清洗残留的DCFH-DA，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。利用Imagin J软件将荧光强弱量化，荧光强弱可反映活细胞内ROS含量[16]。
1.2.8 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测凋亡相关基因mRNA相对表达量待牛ADSCs在6孔板内培养密度至80%左右时，按照1.2.6的方法分组处理细胞。随后提取细胞RNA并反转录得到cDNA，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，利用qRT-PCR检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA相对表达量。qRT-PCR所需引物信息如表 1所示。
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表 1 引物信息 Table 1 Primer information |
使用SPSS 25.0软件单因素方差(one-way ANOVA)程序分析组间数据的差异显著性，分析结果采用平均值±标准差(mean±SD)表示，所得结果使用Graphpad Prism软件绘制图表。其中，P＜0.05代表差异显著，P＜0.01代表差异极显著。各指标至少重复测定3次。
2 结果与分析 2.1 牛ADSCs形态观察部分代次的牛ADSCs形态如图 1所示。牛ADSCs刚分离时杂质较多，呈圆形散布于培养基内；贴壁后细胞呈纺锤形或梭形，数量稀疏，生长方向多变；随着细胞代次的增加，杂质慢慢减少甚至消失，生长方向趋向于统一，生长速度逐渐增快；但在P10代细胞开始呈现衰老状态，会出现生长速度减慢、细胞空泡化等现象。
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图A~I依次为牛ADSCs P0、P1、P3、P5、P6、P7、P8、P9、P10代形态。 Figures A to I were the morphology of cattle ADSCs for P0, P1, P3, P5, P6, P7, P8, P9 and P10 generations in turn. 图 1 牛ADSCs形态(标尺为100 μm) Fig. 1 Morphology of cattle ADSCs (scale bar=100 μm, 10×) |
表面标记蛋白CD29、CD44、CD73和Vimentin多在细胞质中表达，呈绿色荧光；DAPI主要对细胞核进行着色，呈蓝色荧光。牛ADSCs表面标记蛋白免疫荧光鉴定结果如图 2所示。染色结果显示，牛ADSCs中CD29、CD44、CD73和Vimentin蛋白表达呈阳性，说明从脂肪组织获得的牛ADSCs具有一般间充质干细胞的表面蛋白。
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图 2 牛ADSCs表面标记蛋白免疫荧光鉴定(标尺为500 μm) Fig. 2 Immunofluorescence identification of cattle ADSCs surface marker proteins (scale bar=500 μm, 20×) |
如图 3所示，与空白组相比，100、200 μmol/L H2O2对细胞存活率为产生显著影响(P>0.05)，当H2O2浓度大于500 μmol/L时，细胞存活率极显著降低(P＜0.01)，H2O2浓度为1 000 μmol/L时细胞存活率过小，不足空白组的20%，此时H2O2浓度过大并且对细胞造成了不可逆的损伤。故本试验采用浓度为500 μmol/L的H2O2构建牛ADSCs氧化应激模型。
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数据柱标注“*”表示与空白组相比差异极显著(P＜0.01)，“* *”表示与空白组相比差异极显著(P＜0.01)。图 4同。 Date columns with "*" mean significant difference (P < 0.01) and with "* *" mean extremely significant difference (P < 0.01) compared with blank group. The same as Fig. 4. 图 3 H2O2对牛ADSCs存活率的影响 Fig. 3 Effects of H2O2 on viability of cattle ADSCs |
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图 4 PT对牛ADSCs存活率的影响 Fig. 4 Effects of PT on viability of cattle ADSCs |
利用CCK-8试剂盒检测PT对牛ADSCs存活率的影响，结果如图 4所示。与空白组相比，PT浓度小于100 μmol/L时不影响细胞存活率。当PT浓度达到100 μmol/L时，细胞存活率显著降低(P＜0.05)。故本试验采用浓度为10、50 μmol/L的PT对牛ADSCs进行预保护，应用于后续试验。
2.5 PT缓解H2O2诱导的牛ADSCs内氧化应激相关指标变化PT对H2O2诱导的牛ADSCs内氧化应激相关指标MDA含量和SOD活性的影响如图 5所示。由图 5-A可知，与氧化应激组相比，PT浓度为10、50 μmol/L时均可显著降低牛ADSCs内MDA含量(P＜0.05)；由图 5-B可知，与氧化应激组相比，PT浓度为50 μmol/L时可以显著升高牛ADSCs内SOD活性(P＜0.05)。
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数据柱标注“*”表示与氧化应激组相比差异极显著(P＜0.01)，“* *”表示与氧化应激组相比差异极显著(P＜0.01)。图 5至图 7同。 Date columns with "*" mean significant difference (P < 0.01) and with "* *" mean extremely significant difference (P < 0.01) compared with oxidative stress group. The same as Fig. 5 to Fig. 7. 图 5 牛ADSCs内MDA含量和SOD活性 Fig. 5 MDA content and SOD activity in cattle ADSCs |
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A: 不同组牛ADSCs内ROS含量；B：图A中荧光强度量化柱状图。 A: ROS content of cattle ADSCs in different groups; B: quantitative histogram of fluorescence intensity in figure A. 图 6 牛ADSCs内ROS含量 Fig. 6 ROS content in cattle ADSCs |
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图 7 PT对H2O2诱导的牛ADSCs凋亡的影响 Fig. 7 Effects of PT on apoptosis induced by H2O2 in cattle ADSCs |
PT对H2O2诱导的牛ADSCs内ROS含量的影响如图 6所示。DCFH-DA是一种渗透入细胞检测细胞内ROS含量的探针，在细胞内可以被水解成2′, 7′-二氯二氢荧光素(DCFH)，ROS可以氧化DCFH生成有荧光的2′, 7′-二氯荧光素(DCF)，因此可以依据试验结果的荧光强度判断细胞内ROS含量。结果显示，与氧化应激组相比，PT浓度为10、50 μmol/L时均能极显著降低牛ADSCs内ROS含量(P < 0.01)，且浓度为50 μmol/L时作用更明显。
2.7 PT对H2O2诱导的牛ADSCs凋亡的影响PT对H2O2诱导的牛ADSCs凋亡的影响如图 7所示。与空白组相比，500 μmol/L H2O2处理显著上调牛ADSCs内促凋亡基因Bax和Caspase-3的表达(P＜0.05)，极显著下调抗凋亡基因Bcl-2的表达(P＜0.01)；而在加入10、50 μmol/L PT与H2O2共处理时，PT并没有显著缓解ADSCs的凋亡(P>0.05)。
3 讨论氧化应激是机体内的一种不良状态，在这种状态下，氧化作用大于抗氧化作用。机体在进行呼吸代谢等生理过程时都会产生自由基[24-25]，一定量的自由基在体内是必须的，虽然会造成组织损伤，但是具有刺激损伤修复作用；然而，当过量的自由基产生时，不仅会造成组织损伤，还会破坏修复过程，从而导致氧化应激。ADSCs是从脂肪组织中提取的成体干细胞，在脂肪沉积中发挥着重要作用，同时在组织损伤修复等方面具有不可忽视的重要性，因而在研究如何改善氧化应激及凋亡从而提高肉质时，ADSCs是一种关键的试验材料。H2O2是一种强氧化剂，机体在正常状态下，只有2.7%的H2O2可以被降解[26]，因此，H2O2为构建氧化应激模型的首选材料。Liu等[27]采用600 μmol/L H2O2刺激H9c2心肌细胞构建氧化应激模型；Kim等[28]采用300 μmol/L H2O2刺激人视网膜色素上皮细胞构建氧化应激模型；Chen等[29]采用100 μmol/L H2O2刺激人脐静脉内皮细胞构建氧化应激模型。这些研究说明不同细胞对H2O2的敏感性不同，选取细胞类型不同，构建氧化应激模型所需要的H2O2处理条件也不尽相同。因此，本试验选用不同浓度(100、200、500、1 000 μmol/L)的H2O2刺激牛ADSCs发生氧化应激，通过CCK-8法确定构建牛ADSCs氧化应激模型的适宜H2O2浓度，结果表明，500~1 000 μmol/L的H2O2均可极显著降低细胞存活率，并且呈现一定的浓度依赖性。当H2O2浓度达到1 000 μmol/L时，牛ADSCs的存活率过低，不足初始细胞数量的20%，此时细胞已经产生了不可逆转的损伤，无法进行后续试验。而当H2O2浓度达到500 μmol/L时，牛ADSCs的存活率达到初始细胞的60%~80%，所以选用该浓度作为构建H2O2氧化应激模型的H2O2浓度。当用500 μmol/L H2O2刺激牛ADSCs时，细胞内ROS、MDA含量极显著升高，SOD活性极显著下降，说明成功引起牛ADSCs产生氧化应激。
ROS是一类氧的单电子还原产物，机体代谢产生的ROS主要来源于线粒体，大约有2%的氧在线粒体内膜和基质由于未传递到呼吸链而转化为氧自由基[30]。过量ROS会造成DNA发生点突变、碱基的插入和缺失，造成DNA发生移码突变，或者引起氨基酸肽键断裂，形成蛋白质交联复合物改变蛋白质构象，引起蛋白质性质的改变，严重时还会造成机体死亡。MDA是细胞膜脂质过氧化的重要产物之一[31-32]，它的形成会引起机体内DNA、蛋白质等物质交联聚合，加快机体氧化应激速度。SOD作为抗氧化系统的第1道防线，可以通过歧化反应催化超氧化物转化为氧气和H2O2，是机体内最重要的抗氧化酶，在抗氧化、抗癌和抗炎等方面均有重要作用[33-34]。因此本试验选取ROS、MDA含量和SOD活性这3个指标来反映牛ADSCs氧化应激的程度。在本试验中，10 μmol/L PT可以缓解牛ADSCs氧化应激时MDA和ROS含量的变化，而50 μmol/L PT可以同时缓解MDA、ROS含量和SOD活性的变化。这说明在本试验条件下50 μmol/L PT是缓解牛ADSCs氧化应激的最适浓度。
氧化应激和细胞凋亡密不可分，氧化应激可以通过内源性和外源性2种途径引起细胞凋亡[35]。细胞发生凋亡时，凋亡相关基因如Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达量会发生改变。Bax和Bcl-2均为Bcl-2家族中的关键基因，Bax是一种促凋亡基因，发挥的主要功能有破坏线粒体合成ATP的功能，与呼吸链解偶联，干扰氧化磷酸化作用[36]；Bcl-2是一种抗凋亡基因，发挥的主要功能有阻断氧化剂对细胞结构和形态的破坏，改变钙通道蛋白分布从而影响物质跨膜转运，抑制细胞色素C释放到细胞质从而维持呼吸链，保护DNA、氨基酸等物质的结构改变[37]。Caspase-3属于半胱天冬酶(Caspase)基因家族, 在凋亡过程中可以破坏细胞结构，调节蛋白质功能[38]。本试验在检测细胞内氧化应激相关指标的同时也检测了凋亡相关基因的表达情况，结果表明，H2O2处理使得牛ADSCs内促凋亡基因Bax以及Caspase-3 mRNA相对表达量显著上升，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA相对表达量极显著下降，说明细胞发生氧化应激后可以引起细胞凋亡。此外，本研究还对PT抑制细胞凋亡的作用进行了探索，但是并没有显著性差异，说明在本试验条件下PT并没有明显的抗凋亡作用。
PT的抗氧化应激作用已经被广泛研究。在不同细胞中，PT可以降低ROS含量，提高SOD活性，抑制氧化应激[13, 16, 18-19]。为了探究PT发挥作用的分子机制，Yang等[16]先用棕榈酸对人血管内皮细胞(HUVECs)进行氧化应激造模，随后用适宜浓度PT处理该细胞恢复生理状态，对空白组、氧化应激造模组和恢复组进行转录组测序，发现差异基因主要富集于环磷酸腺苷(cAMP)、细胞凋亡以及细胞骨架调控等信号通路；随着进一步探索，该研究还发现PT可以通过激活LKB1/腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶-1(HO-1)信号通路改善HUVECs氧化应激。本研究发现PT在牛ADSCs中同样具有抗氧化应激的作用，其具体分子机制还需进一步深入研究。综上所述，PT可以减轻H2O2诱导的细胞氧化应激水平，但是对于其作用机制以及在畜牧业中的具体应用还需进行深度研究。
4 结论综上可知，500 μmol/L H2O2处理牛ADSCs 24 h可以引起其发生氧化应激。在牛ADSCs发生氧化应激条件下，10 μmol/L PT预保护4 h可以降低牛ADSCs内MDA和ROS含量，而50 μmol/L PT预保护4 h可以降低牛ADSCs内MDA和ROS含量，提高SOD活性，说明PT对牛ADSCs的氧化应激具有抑制作用。
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