2. 内蒙古乌兰察布市农牧业科学研究院, 集宁 012000
2. Agriculture and Animal Husbandry Academy of Ulanchabu, Jining 012000, China
乳腺的健康与否是保障泌乳反刍动物乳产量和乳质量的主要前提。乳腺不健康时易发生炎症(如乳腺炎)，而目前生产实践中，抗生素仍是乳腺炎治疗的主要手段，但是抗生素引发的内源感染、药物残留及耐药性等一系列问题会给人体和环境带来极大危害。因此，在养殖业限抗和禁抗的大背景下，寻找绿色安全有效的抗生素替代品，使乳腺炎的防控从被动治疗转向积极干预，对进一步提高乳品安全具有十分重要的意义。甘氨酸是氨基酸种类中结构最简单的氨基酸，传统营养学中属非必需氨基酸，甘氨酸还是还原性谷胱甘肽的组成成分之一，机体发生严重应激时常外源补充甘氨酸，所以也被认为是半必需氨基酸。目前研究已表明甘氨酸对机体多种生理病理反应具有调节保护作用，典型的如休克、缺血再灌注损伤、细胞膜损伤、氧化应激、酒精性肝炎、肝纤维化、药物中毒和肿瘤转移等[1-8]。近年来的研究表明甘氨酸还有抗炎作用[9-12]。但目前关于甘氨酸抗炎及免疫调节作用的研究主要集中在以人类和啮齿类动物为模型的大脑、心脏、肝脏、肠道等部位的细胞系(巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和Kupffer细胞等)上，在奶山羊乳腺及其细胞系上的研究未见报道。笔者所在课题组在前期不同粗饲料饲喂奶牛的试验中发现游离氨基酸中甘氨酸的乳腺摄入和排出表现出与其他氨基酸截然不同的规律，甘氨酸的乳腺静脉输出高于动脉输入，这意味着不同饲粮条件下的乳腺甘氨酸代谢释放大于消耗，且优质粗饲料组奶牛乳腺释放的甘氨酸显著高于秸秆组，同期获得的生产性能结果也表明优质粗饲料组乳中体细胞数低于秸秆组[13]，这是否说明优质粗饲料组奶牛乳腺健康状态比秸秆组奶牛要好，需要进行的细胞修复要少?是否是由于秸秆组奶牛乳腺免疫系统的激活干扰了乳腺正常的生理代谢而导致对某些特殊氨基酸的需要量增加，使得秸秆组奶牛乳腺中部分甘氨酸被重分配参与了免疫反应而导致其相对释放量大大降低？为了弄清楚甘氨酸与乳腺的健康或者乳腺的免疫究竟有无直接或间接关联？甘氨酸对乳腺的炎症有无一定的调节作用？这种调节效应具体通过哪些途径表现在哪些方面？影响背后的信号通路机制怎样？我们在体内条件下开展了甘氨酸对奶山羊乳腺炎性应答调节及其信号通路影响的研究，旨在为泌乳反刍动物乳腺营养与免疫领域提供数据支持，为生产实践奠定基础研究支持。
1 材料与方法 1.1 主要仪器和试剂主要仪器：高速冷冻离心机(HC-2518R，安徽中科)、电泳仪(DYY-6C，北京六一)、凝胶成像系统(上海复日)、TU-1901紫外分光光度计(北京普析)、定量PCR仪(Light Cycler480 Software Setup，Roche)、移液器(BBI)、-80 ℃冰箱(Thermo)。
主要试剂：甘氨酸(G7 126，Sigma)、脂多糖(LPS，L4516，Sigma)、Trizol®总RNA提取试剂盒(SK1321，上海生工)、反转录试剂盒(SK2445，上海生工)、荧光定量PCR试剂盒(B639271，BBI)、蛋白质提取试剂盒(C510003-0050，上海生工)、BCA试剂盒(C503021-0500，上海生工)、核转录因子-κB(NF-κB)p65一抗(ab13594，Abcam)；二抗：辣根过氧化物酶标记的猴抗兔/小鼠免疫球蛋白G[monkey anti-rabbit/mouse IgG (H+L) HRP，D110056-0100/D110085-0100，BBI]。
1.2 试验动物与饲粮选用15只泌乳期经产健康萨能奶山羊，体重为(42.36±1.94) kg、年龄2.5岁左右，单笼饲养，每天于早晚等量饲喂，自由饮水，饲养管理程序一致。试验饲粮参照NRC(1981)[14]，并结合我国奶山羊饲养标准[15]配制，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet (DM basis) |
将15只奶山羊随机分为对照组、LPS模型组和甘氨酸干预组，每组3只。LPS模型组奶山羊于左右乳区通过乳头管分别注射1 mL LPS溶液(4 μg/乳区)；3个甘氨酸干预组奶山羊分别按照低[1 g/(只·d)]、中[5 g/(只·d)]、高[25 g/(只·d)]的剂量，于左右乳区通过乳头管分别注射0.5 mL甘氨酸，连续注射5 d，第6天在左右乳区通过乳头管注射1 mL LPS(4 μg/乳区)；对照组奶山羊不注射LPS和甘氨酸，以1 mL生理盐水取代。各组奶山羊在注射LPS或生理盐水24 h后屠宰取乳腺组织样。一部分乳腺组织样使用4%多聚甲醛进行固定，用于病理学观察; 另一部分乳腺组织样分装于冻存管，液氮保存，用于后续分子试验。
1、5、25 g/(只·d)甘氨酸剂量溶液的配制：取甘氨酸100 g，分别加100、20、10 mL生理盐水，即配成浓度分别为1、5、25 g/mL的溶液，每天早上挤奶后3个甘氨酸干预组分别注射1 mL相应浓度的甘氨酸溶液。所有溶液确保配制过程无菌无污染。
1.4 指标测定 1.4.1 组织病理学观察组织病理学观察具体步骤如下：1)将乳腺组织固定，修剪。2)酒精脱水，二甲苯进行透明。3)浸蜡，包埋。4)切片，4 ℃保存。5)苏木精-伊红(HE)染色，封片。6)镜下观察，拍照并保存。
1.4.2 乳腺炎症相关信号通路分子基因表达的测定采用实时定量PCR法检测乳腺组织中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、环氧合酶-2(COX-2)、Toll样受体(TLR)2、TLR4、TLR9、髓样分化因子88(MyD88)、β-干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)基因的表达水平。实时定量PCR引物序列见表 2，引物由Primer Premier 5.0软件设计，生工生物工程(上海)股份有限公司合成，β-肌动蛋白(β-actin)为管家基因。
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表 2 实时定量PCR引物序列 Table 2 Sequences of primers for real-time qPCR |
按照Trizol®总RNA提取试剂盒说明提取乳腺组织中总RNA，并采用琼脂糖凝胶电泳(1.5%琼脂糖，1×TAE电泳缓冲液)对所提取的总RNA进行检测，紫外灯下观察并拍照。
1.4.2.2 反转录按照反转录试剂盒说明进行，反应体系为：总RNA，2.0 μL；Random Primer p(dN)6(0.2 μg/μL)，1.0 μL；RNase-free ddH2O，10 μL；5×Reaction Buffer，4.0 μL；dNTP Mix(10 mmol/L)，2.0 μL；RNase inhibitor(20 U/μL)，1.0 μL；AMV Reverse Transcriptase(10 U/μL)，2.0 μL。反应程序为：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。反转录产物于-20 ℃保存备用。
1.4.2.3 荧光定量PCR反应体系(20 μL)为：SYBRGreen qPCR Master Mix(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA 2 μL，无酶水7.2 μL。主要反应条件为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 7 s，57 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，45个循环。
采用2-△△Ct法计算目的基因的表达水平，计算公式如下：
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采用Western blotting法检测乳腺组织中NF-κB p65蛋白的表达水平。1)按试剂盒步骤提取蛋白，测定蛋白浓度，制备聚丙烯酰胺凝胶(浓缩胶5%，分离胶12%)，上样量为20 μg。2)电泳：浓缩胶80 V，30 min；分离胶120 V，Marker确定停止时间。3)转膜：湿转，300 mA，100 min。4)封闭：5%脱脂乳，37 ℃缓慢振荡1 h。5)一抗孵育：5%脱脂乳稀释抗体，稀释比例1 : 1 000，室温孵育15 min，4 ℃缓慢振荡过夜，次日室温孵育30 min。6)洗涤：TBST(Tris-HCl缓冲溶液+吐温20)洗膜5次，3 min/次。7)二抗孵育：monkey anti-rabbit/mouse IgG (H+L) HRP，1 : 8 000稀释，37 ℃孵育1 h。8)洗涤：TBST洗膜6次，3 min/次。增强化学发光(ECL)法曝光。9)内参检测：蛋白印迹膜再生液Stripping Buffer洗膜，37 ℃洗膜30 min，去离子水洗膜3次，TBST洗膜3次，3 min/次，其他步骤同4)~8)。
目的蛋白的表达水平采用蛋白质条带灰度值来表示。
1.5 数据统计分析所有数据均采用SAS 9.0软件的ANOVA程序进行分析，并采用Duncan氏法进行多重比较。P < 0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 甘氨酸干预对LPS诱导的奶山羊体温变化的影响如图 1所示，对照组奶山羊体温在正常范围内波动，LPS模型组及3个甘氨酸干预组体温在注射LPS 3 h后均上升到40.2~41.9 ℃，之后一直持续在39.5 ℃以上，12 h后开始下降，24 h后除了LPS模型组的其他组均降至39.5 ℃以下。
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L代表LPS模型组，N代表对照组，G1代表低剂量甘氨酸干预组，G2代表中剂量甘氨酸干预组，G3代表高剂量甘氨酸干预组。下图同。 L represented LPS model group, N represented control group, G1 represented low dose Gly intervention group, G2 represented medium dose Gly intervention group, and G3 represented high dose Gly intervention group. The same as below. 图 1 各组奶山羊体温变化 Fig. 1 Body temperature change of dairy goats in each group |
由图 2可知，与LPS模型组相比，3个甘氨酸干预组炎性细胞侵润明显减少，乳腺细胞坏死程度明显减轻。
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图 2 奶山羊乳腺组织的组织病理学观察结果 Fig. 2 Histopathological observation results of mammary tissue in dairy goats (200×) |
电泳结果(图 3)显示所用样本提取的总RNA浓度均保持在186.61~1 777.63 ng/μL的范围内，OD260 nm/OD280 nm值在1.94~2.01，没有蛋白质和DNA的污染，可用于后续基因表达的分析。
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图 3 试验羊乳腺组织总RNA电泳结果 Fig. 3 Total RNA electrophoresis results of dairy goats mammary gland |
如图 4所示，相比不做任何处理的对照组，LPS刺激了奶山羊乳腺炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2基因的表达，使这些基因的表达水平显著升高(P < 0.05)。就IL-1β基因的表达水平而言，相比LPS模型组，3个甘氨酸干预组均显著下调(P < 0.05)，特别是中剂量甘氨酸干预组，其甚至显著低于对照组(P < 0.05)；对IL-6基因的表达水平而言，相比LPS模型组，只有中剂量甘氨酸组显著下调(P < 0.05)，低剂量甘氨酸干预组没有产生显著变化(P>0.05)，高剂量甘氨酸干预组甚至显著高于LPS模型组(P < 0.05)；就IL-8基因的表达水平而言，相比LPS模型组，3个甘氨酸干预组均显著下调(P < 0.05)，且低和高剂量甘氨酸干预组的下降程度比中剂量甘氨酸干预组显著(P < 0.05)；对TNF-α基因的表达水平来说，各组变化情况类似于IL-6基因的表达水平，只是中剂量甘氨酸干预组下降到和对照组不显著的水平(P>0.05)；对COX-2基因的表达水平来说，相比LPS模型组，3个甘氨酸干预组均显著下调(P < 0.05)，且低、高剂量甘氨酸干预组达到了与对照组相当的水平(P>0.05)，中剂量甘氨酸干预组甚至显著低于对照组(P < 0.05)。
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数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。 Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05), while with the same or no letters mean no significant difference (P>0.05). The same as below. 图 4 甘氨酸对炎性因子基因表达的影响 Fig. 4 Effects of Gly on inflammatory factor gene expression |
如图 5所示，对TLR2基因的表达水平来说，相比对照组，LPS刺激并未引起其发生显著变化(P>0.05)，同时，低、高剂量甘氨酸的干预也没对其产生显著影响(P>0.05)，只有中剂量甘氨酸的干预引起其显著下调(P < 0.05)；就TLR4基因的表达水平而言，相比对照组，LPS模型组显著升高(P < 0.05)，而3个甘氨酸干预组相比对照组和LPS模型组均显著下调(P < 0.05)，但3个甘氨酸干预组间差异不显著(P>0.05)；相比对照组，LPS刺激也并未引起TLR9基因的表达水平发生显著变化(P>0.05)，低、高剂量甘氨酸干预组TLR9基因的表达水平显著高于对照组和LPS模型组(P < 0.05)，而中剂量甘氨酸组该基因的表达水平则较其他组显著下调(P < 0.05)。
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图 5 甘氨酸对TLR基因表达的影响 Fig. 5 Effects of Gly on TLR gene expression |
如图 6所示，相比对照组，LPS刺激引发了MyD88和TRIF基因的表达水平显著升高(P < 0.05)，而不同剂量甘氨酸的干预效应则不尽相同。相比LPS模型组，3个甘氨酸干预组MyD88基因的表达水平均显著下调(P < 0.05)，低、高剂量甘氨酸干预组MyD88基因的表达水平甚至显著低于对照组(P < 0.05)；相比LPS模型组，低、高剂量甘氨酸干预组TRIF基因的表达水平也显著下调(P < 0.05)，同样显著低于对照组(P < 0.05)，但中剂量甘氨酸干预相比LPS模型组和对照组则显著上调了TRIF基因的表达水平(P < 0.05)。
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图 6 甘氨酸对MyD88和TRIF基因表达的影响 Fig. 6 Effects of Gly on MyD88 and TRIF gene expression |
如图 7所示，相比对照组，LPS刺激使得NF-κB p65蛋白的表达水平显著升高(P < 0.05)，而高、中、低剂量甘氨酸的干预则显著降低了这种刺激效应(P < 0.05)，其中中剂量甘氨酸的降低效果最为显著。
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图 7 甘氨酸对NF-κB p65蛋白表达的影响 Fig. 7 Effects of Gly on NF-κB p65 protein expression |
乳腺炎是由物理、化学及病原微生物等各种因素引起的包括乳腺感染、炎症、微循环和免疫障碍等在内的综合征，乳腺感染在各种乳用家畜中普遍存在[16-17]。引起乳腺炎的病因复杂，细菌、真菌、支原体、病毒等病原微生物感染是主要原因。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌以及链球菌是乳腺炎致病菌的主要代表[18]。病原体入侵乳腺组织时，引发大量嗜中性白细胞聚集，随之产生的大量毒性介质(活性氧和炎性细胞因子等)会损伤在乳腺免疫中扮演重要角色的上皮细胞，导致乳腺分泌功能异常[19]。
IL-1又被称为淋巴细胞刺激因子，主要以IL-1β的形式存在，其主要生物学功能是介导炎症和免疫反应、维持分离后的粒细胞、扩增细胞因子以及间接刺激造血干细胞动员和分化[20]。IL-6是一种可溶性介质，主要由单核巨噬细胞、成纤维细胞、骨髓瘤细胞株等产生，它在炎症、免疫反应以及造血系统中都具有广泛的效应[21]。IL-8是CXC家族的一种趋化因子，在应对外界刺激和感染的条件下，IL-8基因在机体内表达活跃[22]。TNF-α可增强内皮细胞表达黏附因子，增加中性粒细胞附着，刺激细胞的呼吸链，是系统炎症反应过程中起关键作用的毒性因子[23]。环氧酶(COX)是前列腺素(PGs)合成的关键限速酶，COX-2可以被LPS和促炎性细胞因子如IL-1β和IL-6诱导，进而促进PGs的合成并引发炎症[24]。有研究表明甘氨酸能够抑制LPS刺激的小鼠肺泡巨噬细胞和人脑巨噬细胞中TNF-α、IL-1β和过氧化物的表达[9]；甘氨酸可以抑制体内和体外条件下Kupffer细胞中IL-6的分泌[25-27]；甘氨酸还能下调LPS刺激的单核细胞与3T3-L1细胞系中TNF-α和IL-6的分泌[28-29]。体内证据也证明甘氨酸能够减缓炎症反应、减少动物病原感染的发病率。甘氨酸可改善链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的炎症反应[30]。研究发现，饲喂甘氨酸4周阻止了LPS诱发的大鼠急性肺部炎症和损伤[31]，提高了存活率。饲喂添加5%甘氨酸的饲粮降低了LPS诱导的大鼠血浆TNF-α水平，并使大鼠的存活率提高[32]。同样，饲喂添加5%甘氨酸的饲粮可阻止大鼠试验性结肠炎的发生，改善了腹泻和体重减轻的发生[33]。另外，在鸡上的试验表明饲粮补充甘氨酸可缓减LPS带来的免疫损害[34]。牛奶中添加1%的甘氨酸可减少犊牛炎症反应，并可减缓LPS感染引发的体温升高[35]。
本研究中，LPS刺激引发了奶山羊乳腺炎症，直接诱导了炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、COX-2的释放，试验羊体温急剧升高，乳腺组织细胞坏死程度严重，但是甘氨酸的干预对这种效应起到了不同程度的下调和抑制作用，炎性细胞因子表达减少，体温下降，病理组织炎性细胞侵润明显减少，细胞坏死程度明显减轻，这与前人的研究结果一致。但是不同剂量的甘氨酸所发挥的调节作用没有规律，无剂量依赖效应，有待于进一步研究确定。
3.2 甘氨酸干预对LPS诱导的奶山羊乳腺炎症的调节机制就乳腺抗感染的免疫应答信号通路而言，在病原微生物感染早期，由模式识别受体(PRRs)识别相关病原模式(PAMP)，并通过不同的信号途径刺激炎性细胞因子的产生，一方面吸引其他吞噬细胞对病原微生物进行吞噬，另一方面可以刺激抗原递呈细胞成熟，从而启动适应性免疫应答[36]。TLR是主要模式识别受体，它可通过识别病原体，启动先天性免疫和获得性免疫而发挥在机体免疫防御中的重要作用[37]。目前研究的TLR都为Ⅰ型跨膜蛋白，牛上已有10种不同的TLR被鉴定(TLR1~10)[38]。TLR能识别LPS、肽聚糖(PGN)、脂磷壁酸(LTA)等病原微生物细胞壁成分和支原体的某些成分。其中TLR1可以识别细菌、真菌细胞细胞壁部分；TLR2、TLR6可以识别损伤组织的双链RNA、脂蛋白、脂多糖、脂磷壁酸等；TLR3可以识别病毒双链RNA；TLR4可以识别LPS、防御素、纤维蛋白等；TLR5可以识别细菌鞭毛蛋白；TLR7可以识别单链RNA；TLR9可以识别DNA中非甲基化CpG[39]。目前研究较深的有TLR2、TLR4、TLR5和TLR9。PAMP作用于TLR后，通过LPS与细胞表面的受体CD14分子作用，借助复杂、多级的信号传导途径使NF-κB磷酸化，引起单核巨噬细胞和巨噬细胞等释放IL-1、IL-6、IL-12、IL-8和TNF-α等细胞因子，这些细胞因子在炎症反应中起重要作用[40-41]。MyD88和TRIF是TLR信号通路下游的关键信号接头分子，可以激活NF-κB途径，进而控制细胞因子的表达[42]。
本研究中，LPS刺激并未引起TLR2、TLR9基因的表达水平的显著变化，但显著上调了TLR4、MyD88和TRIF基因及NF-κB p65蛋白的表达，而3个剂量甘氨酸的干预则不同程度地抑制了上述3个基因的表达，并下调了NF-κB p65蛋白的表达，同样也没有剂量依赖效应，这初步说明甘氨酸是通过下调TLR4及其下游关键信号分子MyD88和TRIF基因表达，进而影响转录因子NF-κB p65磷酸化，从而抑制炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和COX-2的分泌。目前甘氨酸的抗炎机制还没有完全清楚，其对靶细胞的效应可能是多因素的共同作用，而甘氨酸调节多种细胞类型的能力增加了研究者想探明其作用机制的难度。有学者提出甘氨酸通过抑制甘氨酸门控的氯离子通道而抑制某些免疫细胞的激活或者炎性细胞的活性，阻止炎性细胞因子和前列腺素等炎症介质的释放，进而起到减缓和阻碍炎症反应的作用[43]。支持这一理论的研究认为甘氨酸通过氯离子通道阻止了LPS引发的钙离子的增加，从而减少枯否细胞分泌有毒介质[44]。这些多重作用可能涉及到和NF-κB相关的信号转导通路[45-47]。
3.3 甘氨酸对泌乳反刍动物乳腺免疫调控的可能性探讨近年来的研究不断证实了一些非必需氨基酸除了用于机体蛋白质的合成外，它们还通过自身及其代谢产物对机体内营养物质代谢、内分泌、免疫与抗氧化、基因表达与信号转导等生理过程进行调节，并最终影响到动物的生长、生产以及健康[48]。营养物质调控免疫系统运行的能力已成为现代动物生产中的重要关注点。在免疫反应中，氨基酸将发生重分配并用于某些参与炎症和免疫反应的蛋白质和其他化合物的合成[49]。所谓的非必需氨基酸可能在动物的某些特殊生理阶段需求量增加，而容易出现相对缺乏现象。因此，人类和家畜的氨基酸需要量推荐中，除了考虑氨基酸本身的蛋白质底物作用外，还应考虑其同等重要的生理活性功能[50]。甘氨酸虽然在营养学中被归类为非必需氨基酸，但它作为一种重要的神经递质，不仅参与了蛋白质和许多代谢性生理分子的合成，还对机体多种生理病理反应具有调节保护作用，如器官移植、切除术等手术过程中伴随的缺血再灌注损伤，聚多糖诱导的关节炎，LPS和败血症引发的休克，以及细胞膜损伤、氧化应激、炎症、药物中毒、高血糖等[43, 51]。长期、慢性的甘氨酸缺乏可能会导致对机体健康和营养代谢终生不利的影响[52]。
但目前有关甘氨酸抗炎和免疫调节作用的研究都集中于人类和啮齿类动物模型的大脑、心脏、肝脏、肠道等部位及其免疫细胞。笔者所在课题组在前期研究中测定了奶牛3种不同饲粮条件(优质混合粗饲料组和秸秆A、B组)下，从饲粮氨基酸摄入到乳腺氨基酸供应、摄取、产出及相关生理、生产性能的动态变化规律，结果发现，游离氨基酸中甘氨酸的乳腺摄入和排出表现出与其他氨基酸截然不同的规律，甘氨酸的乳腺静脉输出高于动脉输入，这意味着3组饲粮的乳腺甘氨酸代谢释放大于消耗，且优质粗饲料组甘氨酸释放程度显著高于秸秆组。有关人原代乳腺上皮细胞、淋巴细胞上的研究也表明甘氨酸释放大于消耗，其消耗量、吸收和生物合成的破坏与细胞的增殖密切相关[53]。笔者所在课题组在前期研究中同期进行的生产性能结果也表明优质粗饲料组乳中体细胞数显著低于秸秆组，且乳中体细胞数与乳腺甘氨酸释放量呈显著的负相关。因此，我们推测这样的结果可能是因为优质粗饲料组奶牛乳腺健康状态比秸秆组奶牛要好，需要进行的细胞修复要少；换个角度说，可能由于秸秆组奶牛乳腺免疫系统的激活干扰了其正常的生理代谢而导致对某些特殊氨基酸的需要量增加，使得秸秆组奶牛乳腺中部分甘氨酸被重分配参与了免疫反应而导致其相对释放量大大降低。本研究中，我们建立了大肠杆菌LPS诱导的奶山羊乳腺炎模型，通过活体乳腺注射甘氨酸，观察了甘氨酸对奶山羊乳腺炎症的保护作用，并探讨了甘氨酸是否通过下调乳腺TLR基因的表达而调节乳腺炎性应答，以及乳腺中TLR下游信号分子及转录因子与甘氨酸调节炎性反应的相关性，结果表明，甘氨酸通过下调TLR4及其下游关键接头分子MyD88和TRIF基因的表达，进而影响了转录因子NF-κB p65磷酸化，从而抑制了炎性因子的分泌，最终减缓了乳腺的炎症反应。目前甘氨酸的免疫调节作用与机理还处在试验动物模型阶段，应用还局限于人类临床。本研究结果可为甘氨酸作为天然免疫生理调节剂在泌乳反刍动物营养与免疫研究及乳腺炎防控方面的研究提供有益的基础数据。
4 结论本研究通过体内试验表明，甘氨酸通过下调TLR4及其下游关键信号分子MyD88和TRIF基因的表达，抑制转录因子NF-κB p65磷酸化，从而减少炎性因子的分泌。本研究初步阐明了甘氨酸通过抑制TLR-NF-κB信号通路来抑制炎性细胞的激活，阻止炎症介质的释放，进而阻碍炎症的发生。
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