猪小肠内消化酶的种类与活性对饲粮养分的消化有重要的影响，因此，在体外模拟消化中，研究小肠消化阶段各消化酶及其活性对饲粮养分消化的贡献非常关键。Geraets等[1]、Wilfart等[2]的研究结果表明，饲粮在生长猪小肠阶段的消化率达50%以上，占全消化道消化率的60%以上。而且猪肠液中某些消化酶的活性与饲粮养分的消化率有相关性[3-4]。此外，黄瑞林等[5]通过胃蛋白酶-胰蛋白酶两步体外法测定饲粮粗蛋白质的消化率时，发现在一定范围内随着胰蛋白酶剂量的增加，粗蛋白质的消化率随之增加。由此可见，小肠消化阶段各消化酶的活性可能对饲粮养分消化的贡献有较大差异，而且该差异与所消化饲粮底物的组成有关。然而，在小肠模拟消化阶段，除了淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶以外，其他未知酶系对饲粮体外消化率的贡献总体上相差不大，且也随饲粮底物的不同而异[6]。本研究组前期对猪仿生消化中消化酶活性的监测发现，小肠阶段淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性随消化时间均呈现不同程度的衰减，其中胰蛋白酶活性在小肠消化0~8 h急剧衰减。与此对应的是基于单胃动物仿生消化系统猪模拟胃液-模拟小肠液2阶段消化测定的饲粮粗蛋白质体外消化率比体内实测值低10%左右[3]。该差值是否与仿生消化过程中消化酶活性的衰减及程度有关仍需要进一步研究。为此，本研究探讨猪仿生消化中模拟小肠液各消化酶对饲粮总能与粗蛋白质消化率的贡献以及在小肠消化4 h时根据消化酶的衰减补充消化酶后对饲粮养分消化率的影响。为仿生消化法评定猪饲粮的养分生物学效价提供参考。
1 材料与方法 1.1 饲料原料与饲粮以玉米、豆粕、小麦麸、玉米-豆粕型饲粮为消化底物，用万能粉碎机粉碎后过60目方形筛孔，分别密封于标样袋后于-20 ℃保存待用，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 饲料原料、玉米-豆粕型饲粮的组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of feed ingredients and corn-soybean meal diet (air-dry basis) |
试验采用单因素完全随机设计，5个处理分别为胃模拟消化、胃+小肠(淀粉酶)模拟消化、胃+小肠(淀粉酶+糜蛋白酶)模拟消化、胃+小肠(淀粉酶+糜蛋白酶+胰蛋白酶)模拟消化、胃+小肠(淀粉酶+糜蛋白酶+胰蛋白酶+小肠消化4 h时补充消化酶)模拟消化，每个处理5个重复，每个重复1根消化管。各处理小肠消化期消化酶的组成见表 2，考察各处理条件下玉米、豆粕、小麦麸及玉米-豆粕型饲粮的干物质、总能及粗蛋白质消化率的差异。
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表 2 各处理小肠消化期消化酶的组成 Table 2 Composition of digestive enzymes in small intestinal digestion phase of each treatment |
单胃动物仿生消化系统测定猪饲粮干物质、总能及粗蛋白质消化率的原理与方法参考Zhao等[7]、王钰明[3]的描述及《单胃动物仿生消化系统操作手册》第2版，其中最后水解产物的清洗参数设置为每次4 h，共清洗6次。
1.4 计算公式饲粮养分消化率的计算公式：
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式中：N1为饲粮样品粗蛋白质重量(g)；N2为残渣中粗蛋白质重量(g)；N0为消化酶粗蛋白质残留量(g)；M1为饲粮样品干物质重量(g)；M2为残渣干物质重量(g)；M0为消化酶干物质残留量(g)；E1为饲粮样品总能值(J)；E2为残渣总能值(J)；E0为消化酶干物质残留量总能值(J)。
1.5 统计分析采用SAS 9.2的MEANS模块计算基本统计量。采用GLM模块进行单因素方差分析，并以Duncan氏法对各处理均值进行多重比较。P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 小肠仿生消化中酶的种类及补充对玉米养分消化率的影响及贡献在玉米的仿生消化中(表 3)，经胃消化后模拟小肠液中的淀粉酶、糜蛋白酶显著提高了干物质、粗蛋白质及总能的消化率(P＜0.05)，而胰蛋白酶并没有在此基础上进一步提高玉米养分的消化率。小肠消化4 h时补充消化酶后没有进一步提高玉米的干物质、粗蛋白质和总能的消化率。在模拟小肠液消化酶对玉米干物质和总能消化率的贡献上，淀粉酶显著高于胰蛋白酶、糜蛋白酶及补充消化酶(P＜0.05)；糜蛋白酶显著高于胰蛋白酶及补充消化酶(P＜0.05)。在模拟小肠液消化酶对玉米粗蛋白质消化率的贡献上，糜蛋白酶显著高于淀粉酶、胰蛋白酶及补充消化酶(P＜0.05)；淀粉酶显著高于胰蛋白酶(P＜0.05)。
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表 3 小肠仿生消化阶段消化酶活性对玉米养分消化率的影响 Table 3 Effects of digestive enzyme activity in simulated digestion of small intestine on nutrient digestibility of corn |
在豆粕的仿生消化中(表 4)，经胃消化后模拟小肠液中的淀粉酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶均显著提高了干物质、粗蛋白质及总能的消化率(P＜0.05)。小肠消化4 h时补充消化酶后并未进一步提高对豆粕干物质、粗蛋白质及总能的消化率(P＞0.05)，但粗蛋白质消化率有升高的趋势。在模拟小肠液消化酶对豆粕干物质消化率的贡献上，淀粉酶和糜蛋白酶间无显著性差异(P＞0.05)，但显著高于胰蛋白酶和补充消化酶(P＜0.05)；胰蛋白酶显著高于补充消化酶(P＜0.05)。在模拟小肠液消化酶对豆粕粗蛋白质消化率的贡献上，淀粉酶>糜蛋白酶>胰蛋白酶>补充消化酶(P＜0.05)。在模拟小肠液消化酶对豆粕总能消化率的贡献上，糜蛋白酶>胰蛋白酶>淀粉酶>补充消化酶(P＜0.05)。
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表 4 小肠仿生消化阶段消化酶活性对豆粕养分消化率的影响 Table 4 Effects of digestive enzyme activity in simulated digestion of small intestine on nutrient digestibility of soybean meal |
在小麦麸的仿生消化中(表 5)，经胃消化后模拟小肠液中的淀粉酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶显著提高了干物质、粗蛋白质及总能消化率(P＜0.05)。小肠消化时4 h补充消化酶后并未进一步提高对小麦麸干物质、总能消化率(P＞0.05)，但进一步提高了粗蛋白质消化率(P＜0.05)。在模拟小肠液消化酶对小麦麸干物质消化率的贡献上，淀粉酶>糜蛋白酶>胰蛋白酶>补充消化酶(P＜0.05)。在模拟小肠液消化酶对小麦麸粗蛋白质消化率的贡献上，淀粉酶和糜蛋白酶间无显著性差异(P＞0.05)，但显著高于胰蛋白酶和补充消化酶(P＜0.05)，胰蛋白酶又高于补充消化酶(P＜0.05)。在模拟小肠液消化酶对小麦麸总能消化率的贡献上，淀粉酶>胰蛋白酶>糜蛋白酶>补充消化酶(P＜0.05)。
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表 5 小肠仿生消化阶段消化酶活性对小麦麸养分的消化率影响 Table 5 Effects of digestive enzyme activity in simulated digestion of small intestine on nutrient digestibility of wheat bran |
在玉米-豆粕型饲粮的仿生消化中(表 6)，经胃消化后模拟小肠液中的淀粉酶、糜蛋白酶显著提高了干物质、粗蛋白质及总能消化率(P＜0.05)，而胰蛋白酶并没有在此基础上进一步提高玉米-豆粕型饲粮干物质和总能的消化率(P＞0.05)，但显著提高了粗蛋白质消化率(P＜0.05)。小肠消化时4 h补充消化酶后进一步提高了玉米-豆粕型饲粮干物质、粗蛋白质及总能消化率(P＜0.05)。在模拟小肠液消化酶对玉米-豆粕型饲粮干物质和总能消化率的贡献上，淀粉酶>糜蛋白酶>补充消化酶>胰蛋白酶(P＜0.05)。在模拟小肠液消化酶对玉米-豆粕型饲粮粗蛋白质消化率的贡献上，糜蛋白酶>淀粉酶>胰蛋白酶>补充消化酶(P＜0.05)。
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表 6 小肠仿生消化阶段消化酶活性对玉米-豆粕型饲粮养分消化率的影响 Table 6 Effects of digestive enzyme activity in simulated digestion of small intestine on nutrient digestibility of corn-soybean meal diet |
在猪体内消化中，小肠的消化对整个饲粮养分的消化率有重要的贡献。Geraets等[1]、Wilfart等[2]的研究结果表明，饲粮在生长猪十二指肠的干物质、粗蛋白质消化率为0.4%~16.1%和7.1%~14.5%，且饲粮养分在十二指肠消化率的高低与粗纤维水平呈强的负相关，而在回肠末端的消化率则分别高达63.8%~76.8%和70.4%~80.7%。由此可见，小肠消化阶段直接贡献的消化率占全消化道消化率的50%以上。然而，Corring等[8]通过结扎仔猪的胰导管后，发现胰液中的消化酶被阻断后可使仔猪对饲粮氮的消化率降低35%，总能消化率降低12%。这表明食糜经胃消化后产生的一些小分子可在小肠被吸收，即使在小肠消化阶段没有胰腺分泌的消化酶水解，饲粮养分的消化率仍然不低。这表明由于胃对有机物的吸收较少[9]，因此，消化率的测值较低。而实际上胃的消化程度可能比Geraets等[1]、Wilfart等[2]报道的饲粮养分在十二指肠的消化率高。同时根据党方坤[4]、王钰明[3]、Zhang等[10]的结果也可以推测，猪体内胃阶段的消化与小肠阶段的消化在水解功能上有叠加的现象。党方坤[4]用生长猪小肠液仅模拟小肠阶段体外消化6种饲粮的干物质消化率为72.67%~79.42%，而采用胃-小肠2阶段的消化率为81.99%~87.22%[3]。Zhang等[10]用鸭空肠液体外消化饲料原料的干物质消化率与胃-小肠2阶段消化获得的消化率非常接近。上述结果进一步佐证了胃液与小肠液在对饲粮底物的水解功能上有叠加。本研究中，胃阶段以及胃-小肠阶段对玉米-豆粕型饲粮的总能消化率分别为27.90%和82.71%，小肠阶段直接贡献的消化率为54.81%，这与Wilfart等[2]的结果类似。而小肠阶段直接贡献的粗蛋白质消化率为34.18%，该结果远低于Geraets等[1]和Wilfart等[2]的动物试验结果，而与Wilfart等[11]报道的体外模拟消化中饲粮粗蛋白质主要在胃阶段消化的结论相类似。这是因为在仿生消化中，胃阶段水解的产物被及时透析出去，而在猪胃内对有机物的吸收很少而出现测定到的养分消失率(消化率)很低。玉米、豆粕、小麦麸在胃仿生消化阶段的粗蛋白质消化率也大大高于体内值，这是因为模拟胃液中的胃蛋白酶对饲粮的大部分蛋白质进行了水解，模拟小肠液在与胃蛋白酶类似水解功能叠加基础上的粗蛋白质消化率只直接贡献了13.96%~39.19%。
3.2 猪小肠仿生消化中酶的组成对消化率的影响在体外模拟消化中，消化的温度、pH、离子浓度等都会影响到饲粮底物的消化率。本研究中仿生消化的温度、缓冲液pH、离子浓度等消化参数均参照生长猪的体内条件设置。而在仿生消化过程的混合频率上由于猪肠道蠕动的频率鲜见相关报道，设置为180 r/min使测定结果在重复性上是满意的[12-13]。在小肠消化液的组成上，淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶贡献了小肠消化阶段所有消化酶总活性的90%以上[6]，但这3种消化酶在体外模拟消化中均有不同程度的衰减，其中胰蛋白酶在小肠消化前期急剧衰减。当消化酶相对于底物不足时呈现饲粮养分消化率随着消化酶活性的升高而增加[5, 14-15]。一些学者因考虑到生长猪体内消化酶过量分泌，周转速度快，在体外模拟消化时胃蛋白酶和胰液素的浓度通常过量使用[16]。在该体系下，消化酶活性与养分的消化率无显著的相关性。这一现象同猪空肠液中消化酶活性与饲粮主要养分的消化率间无显著相关性的结论类似[3]。而对小肠液中各消化酶而言，淀粉酶特定地作用于α-1, 4糖苷键[17]，因此，当消化底物中淀粉的含量占比大时，淀粉酶对饲粮的干物质与总能的消化率有较大贡献。在本试验中，豆粕、小麦麸、玉米-豆粕型饲粮、玉米的淀粉含量依次升高(豆粕淀粉含量1.89%、小麦麸淀粉含量22.56%、玉米淀粉含量62.55%)[18]，淀粉酶对消化率的贡献也依次升高。这与猪体内和体外消化中几乎所有的淀粉都在小肠末端前被消化的结果一致[19-20]。糜蛋白酶主要切断蛋白质肽链中酪氨酸、苯丙氨酸的羧端肽链，可以专一性地水解羧端芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸、亮氨酸)或侧链大体积的疏水性残基甲硫氨酸等。而胰蛋白酶主要专一性地水解L-型精氨酸和L-型赖氨酸端的羧肽键[17]。上述2种蛋白酶在水解功能上与胃蛋白酶水解部位为芳香族氨基酸或酸性氨基酸端肽键有叠加。因此，当本试验中玉米、玉米-豆粕型饲粮、小麦麸、豆粕的粗蛋白质含量依次升高时，胃消化阶段干物质消化率与总能消化率也依次升高。由于糜蛋白酶在水解功能上与胃蛋白酶有互补，因此，小肠消化阶段糜蛋白酶对饲粮的粗蛋白质消化率仍有较大的贡献。而胰蛋白酶虽然与胃蛋白酶和糜蛋白酶在水解功能上也有互补性，但本实验室前期的结果表明，仿生消化中胰蛋白酶活性随消化时间急剧下降，降低了胰蛋白酶对粗蛋白质消化的贡献。此外，饲粮蛋白质经胃蛋白酶和糜蛋白酶消化后，留给胰蛋白酶专一性水解的底物量较少，这也导致了胰蛋白酶对粗蛋白质消化率贡献相对较少。小肠阶段消化4 h时补充消化酶后仍能小幅度地提高玉米、小麦麸、玉米-豆粕型饲粮的粗蛋白质消化率和玉米-豆粕型饲粮总能消化率。这表明仿生消化过程中消化活性随消化时间的衰减导致了部分消化酶相对于饲粮底物不足。而动物体内胰液呈脉冲式补充到小肠中，从而表现为消化酶活性相对于采食的饲粮底物过量[21-24]。因此，在仿生消化中小肠阶段补充消化酶是有必要的。
4 结论在猪的小肠模拟消化阶段，淀粉酶、糜蛋白酶对总能和粗蛋白质消化率的贡献相对较高，而胰蛋白酶和小肠阶段消化4 h时补充消化酶对饲粮养分消化率的贡献虽然相对较少，但也可以引起消化率显著性差异。
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