2. 扬州大学动物科技学院, 家禽矿物元素营养研究室, 扬州 225000
2. Poultry Mineral Nutrition Laboratory, College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225000, China
铁是动物必需的微量元素之一，在动物的许多生命活动中起着重要的作用，如参与血红蛋白和肌红蛋白的合成，保证氧气的正常运输，作为酶的辅助因子而参与能量和蛋白质代谢、DNA与神经递质等物质的合成及免疫等[1-6]。动物机体缺铁或铁利用不良时，会造成机体生理功能紊乱，甚至会导致缺铁性贫血，严重影响动物的健康及生产。鸡等家禽，尤其是快速生长的肉仔鸡对铁的需要量较高，但其饲粮中存在许多限制铁吸收利用的因素，因此，肉鸡饲粮中通常需要添加外源铁来满足其对铁的需要[7]。但现代畜牧生产中由于添加铁的成本相对较低，通常按饲养标准中的需要量全额甚至超额添加，而过量的铁可引起动物病变，例如通过催化产生活性氧(ROS)而造成DNA损伤、脂质过氧化、蛋白质变性，导致突变、致癌效应等[8-11]，从而影响生产性能；不仅如此，过量的铁排出体外也可造成环境污染。因此，加强肉鸡铁营养的深入研究，具有十分重要的意义。
铁在肠道内的吸收、储存及调控的相关研究已相当深入[12]，但铁从肉鸡肠道吸收后运送到肉鸡体组织细胞中代谢利用的机制尚不清楚。铁在机体内主要作为含铁关键酶或功能蛋白质而发挥作用，琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase，COX)是动物体内的含铁关键酶，也是呼吸作用的关键酶，在大鼠和猪上的研究表明，其活性均受铁水平的调节[13-16]。本实验室前期一系列研究发现，肉鸡肝脏SDH、CAT和COX活性和mRNA表达对饲粮不同铁水平的反应比其他指标更敏感[17-18]。铁蛋白重链1(ferritin heavy chain 1，FTH1)是体内铁的主要储存形式，不仅调节体内铁的含量，而且在抵抗氧化损伤、调节细胞增殖等方面发挥重要作用[19]。有研究表明，大鼠肝脏FTH1的合成受铁水平的影响，且铁主要在翻译水平上调节FTH1的合成[20]，但上述研究多是采用体内试验，而采用体外原代培养肉鸡肝细胞模型直接研究不同铁水平对肉鸡肝细胞中铁含量及含铁关键酶活性和mRNA表达影响的研究，在国内外文献中尚未见报道。因此，本试验拟通过研究不同铁水平和孵育时间对原代培养肉鸡鸡胚肝细胞中铁含量，含铁关键酶(SDH、CAT和COX)活性及mRNA和蛋白表达，以及 FTH1 的mRNA和蛋白表达的影响，以初步揭示铁在肉鸡肝细胞中代谢利用的分子机制，并为后续肉鸡肝细胞铁代谢利用机制研究中铁水平和孵育时间设置提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计本试验采用5×3两因子完全随机设计，根据前人的研究结果[21-23]，设置5个铁水平，分别为0(对照)、0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L；3个铁孵育时间，分别为24、48和72 h。按照试验设计，共形成15个组，每组6个重复。
1.2 试验动物14胚龄的爱拔益加(AA)肉鸡鸡胚购自河北滦平华都肉鸡公司。
1.3 孵育液的配制无铁基础培养液的配制，参考何文刚[23]的方法，配制Leibovitz’s L-15 Medium含10%胎生牛血清、10 μg/mL人转铁蛋白、10 μg/mL维生素C、1×10-6 mmol/L地塞米松、10 μg/mL胰岛素、1%双抗(100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素)的贴壁培养液及不含胎牛血清的基础培养液。含铁孵育培养液的配制，在以上无铁基础液中以FeCl3·6H2O的形式添加不同浓度的铁，过滤除菌，4 ℃保存备用。
1.4 肉鸡鸡胚肝细胞不同水平铁孵育液孵育以1×106个/mL将细胞接种到6孔培养板内，并放入培养箱中37 ℃、5% CO2条件下进行培养。并根据模型评估的检测结果，即肝细胞纯度较高，在培养72 h后肝细胞汇合度达90%后，在每块6孔培养板内的各孔中分别添加预先配制好的不同水平铁(0、0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L)孵育液，放回培养箱中分别继续培养24、48和72 h，每24 h换液1次。将孵育结束的细胞培养板从培养箱中取出，在超净工作台中放置在冰上，磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液清洗2~3遍，收集细胞。
1.5 样品采集与制备孵育培养24、48和72 h后，培养板上的细胞在冰上最后1次洗涤吸干PBS后，将同一组2个重复孔的细胞加入超纯水洗涤并收集到同一个2 mL灭菌离心管中作为1个重复样品，-20 ℃冻存，以备测定肝细胞中铁含量和SDH、CAT、COX活性。
孵育培养24、48和72 h后，培养板上的细胞在冰上最后1次洗涤吸干PBS后，各培养孔中每孔加入500 μL、4 ℃ Trizol静置5 min后，收集样品-80 ℃冻存，以备测定SDH、CAT、COX1及 FTH1 的mRNA表达水平；另外各2个培养孔中加入200 μL组织裂解基础液，收集样品，-80 ℃冻存，以备测定SDH、CAT、COX1及FTH1的蛋白表达水平。
1.6 指标测定参照Zhang等[17]的方法测定肝细胞中SDH、CAT和COX的活性，参考Gokduman等[24]的方法测定肝细胞中铁含量。其中，SDH、CAT及COX活性测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所，细胞铁含量测定试剂盒购于美国ScienCell公司。
采用实时荧光定量(real-time)PCR法测定肝细胞中SDH、CAT、FTH1 、COX1、COX7A2L的mRNA表达水平，选用3-磷酸甘油醛(GAPDH)和β-肌动蛋白(β-actin)为双内参，采用2-ΔΔCt方法计算目的基因的mRNA表达水平[17]，引物序列见表 1。
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表 1 鸡SDH、CAT、COX1、COX7A2L、FTH1 、GAPDH及β-actin的引物序列 Table 1 Primer sequences of SDH, CAT, COX1, COX7A2L, FTH1 , GAPDH and β-actin for chicken |
采用Western blotting法[25]测定肝细胞中SDH、CAT、FTH1、COX1的蛋白表达水平，以β-微管蛋白(β-tubulin)为内参计算目的蛋白表达水平。SDH、CAT、FTH1、COX1抗体均购买于Abclonal公司，稀释倍数均为1 : 2 000。β-tubulin抗体购于华兴博创试剂公司，稀释倍数1 : 5 000。
1.7 数据统计分析采用SAS 9.4软件中的GLM程序对数据进行5(铁水平)×3(孵育时间)两因子方差分析，统计模型包括铁水平、孵育时间及铁水平与孵育时间的互作，差异显著者以LSD法比较平均值间的差异显著性；对铁水平方差分析差异显著的指标，用不相关比较法分析各指标与铁水平间的线性或二次曲线反应，以P < 0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果与分析 2.1 铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞中铁含量的影响由表 2可见，铁水平、孵育时间及两者的互作对肝细胞中铁含量均有显著影响(P < 0.05)。24、48和72 h时，0.25、0.50、0.75、1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中铁含量均显著高于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)，且肝细胞铁含量随着添加铁水平的增加而呈线性(24 h)或二次曲线(48和72 h)趋势升高。当铁水平为0、0.75 mmol/L时，24、48和72 h肝细胞中铁含量无显著差异(P>0.05)；当铁水平为0.25 mmol/L时，24和48 h、48和72 h肝细胞中铁含量无显著差异(P>0.05)，但72 h肝细胞中铁含量显著高于24 h(P < 0.05)；当铁水平为0.50 mmol/L时，48 h肝细胞中铁含量显著高于24和72 h(P < 0.05)。
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表 2 铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞中铁含量和含铁酶活性的影响 Table 2 Effects of Fe level and incubation time on Fe content and iron-containing enzyme activities in hepatocytes of broiler embryos |
综上，在提高肝细胞中铁含量方面，适宜的铁水平为0.25~1.00 mmol/L，孵育时间为48或72 h。
2.2 铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞中含铁酶活性的影响由表 2可见，铁水平和孵育时间对肝细胞中SDH和COX活性均有显著影响(P < 0.05)，但两者的互作对肝细胞中SDH和COX活性无显著影响(P>0.05)。与0 mmol/L铁水平组相比，0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中SDH活性显著降低(P < 0.05)；24 h肝细胞中SDH活性显著高于48 h(P < 0.05)，而72 h又显著高于24和48 h(P < 0.05)。与0 mmol/L铁水平组相比，0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中COX活性显著提高(P < 0.05)；24和48 h之间肝细胞中COX活性无显著差异(P>0.05)，但均显著高于72 h(P < 0.05)。
铁水平、孵育时间及两者的互作对肝细胞中CAT活性有显著影响(P < 0.05)。24 h时，0.75 mmol/L铁水平组肝细胞中CAT活性显著高于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)；48 h时，各铁水平组肝细胞中CAT活性无显著差异(P>0.05)；72 h时，0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中CAT活性显著高于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)。随着培养时间的增长，0 mmol/L铁水平组肝细胞中CAT活性显著降低(P < 0.05)；0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L铁水平组的24 h肝细胞CAT活性显著高于48和72 h(P < 0.05)，而48和72 h之间无显著差异(P>0.05)。
综上，在提高含铁酶活性方面，适宜的铁水平为0.50 mmol/L，孵育时间为24 h。
2.3 铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞中含铁酶及 FTH1 的mRNA表达水平的影响由表 2可见，铁水平、孵育时间及两者的互作对肝细胞中SDH、CAT、COX7A2L和 FTH1 的mRNA表达水平均有显著影响(P < 0.05)；铁水平及铁水平与孵育时间的互作对肝细胞中COX1的mRNA表达水平有显著影响(P < 0.05)，但孵育时间对肝细胞中COX1的mRNA表达水平无显著影响(P>0.05)。
24、48和72 h时，随着铁水平的升高，肝细胞中SDH的mRNA表达水平呈线性升高趋势。铁水平为0和0.25 mmol/L时，24、48和72 h的肝细胞中SDH的mRNA表达水平无显差异(P>0.05)；铁水平为0.50 mmol/L时，24 h的肝细胞中SDH的mRNA表达水平显著高于72 h(P < 0.05)；铁水平为0.75 mmol/L时，48 h的肝细胞中SDH的mRNA表达水平显著高于72 h(P < 0.05)；铁水平为1.00 mmol/L时，48 h的肝细胞中SDH的mRNA表达水平显著高于24 h(P < 0.05)，24 h又显著高于72 h(P < 0.05)。
24 h时，0.50和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中CAT的mRNA表达水平显著高于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)；48 h时，0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中CAT的mRNA表达水平显著低于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)，但0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L铁水平组之间无显著差异(P>0.05)；72 h时，0.50 mmol/L铁水平组肝细胞中CAT的mRNA表达水平显著高于于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)，而1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中CAT的mRNA表达水平则显著低于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)。铁水平为0 mmol/L时，24、48和72 h肝细胞中CAT的mRNA表达水平无显著差异(P>0.05)；铁水平为0.25、0.50和0.75 mmol/L时，24和72 h肝细胞中CAT的mRNA表达水平显著高于48 h(P < 0.05)，而24和72 h之间无显著差异(P>0.05)；铁水平为1.00 mmol/L时，24 h肝细胞中CAT的mRNA表达水平显著高于48和72 h(P < 0.05)，而48和72 h之间无显著差异(P>0.05)。
24 h时，0、0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中COX1的mRNA表达水平无显著差异(P>0.05)；48 h时，0.25、0.50、0.75 mmol/L铁水平组肝细胞中COX1的mRNA表达水平显著低于0和1.00 mmol/L铁水平组(P < 0.05)；72 h时，0.25、0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中COX1的mRNA表达水平显著低于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)，0.50 mmol/L铁水平组肝细胞中COX1的mRNA表达水平与0 mmol/L铁水平组无显著差异(P>0.05)。铁水平为0、0.25和0.75 mmol/L时，24、48和72 h肝细胞中COX1的mRNA表达水平无显著差异(P>0.05)；铁水平为0.50 mmol/L时，72 h肝细胞中COX1的mRNA表达水平显著高于24 h(P < 0.05)，而24 h又显著高于48 h(P < 0.05)；铁水平为1.00 mmol/L时，24和48 h肝细胞中COX1的mRNA表达水平显著高于72 h(P < 0.05)，且24和48 h之间无显著差异(P>0.05)。
24 h时，0.50、0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中COX7A2L的mRNA表达水平显著低于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)；48 h时，1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中COX7A2L的mRNA表达水平显著高于0.75 mmol/L铁水平组(P < 0.05)，0.75 mmol/L铁水平组显著高于0、0.25 mmol/L铁水平组(P < 0.05)，且0、0.25和0.50 mmol/L铁水平组之间差异不显著(P>0.05)；72 h时，0、0.25、0.50、0.75和1.00 mmol/L铁水平组之间肝细胞中COX7A2L的mRNA表达水平无显著差异(P>0.05)。铁水平为0和0.25 mmol/L时，24、48和72 h肝细胞中COX7A2L的mRNA表达水平无显著差异(P>0.05)；铁水平为0.50和0.75 mmol/L时，24 h肝细胞中COX7A2L的mRNA表达水平显著高于48和72 h(P < 0.05)，且48和72之间差异不显著(P>0.05)；铁水平为1.00 mmol/L时，24和48 h肝细胞中COX7A2L的mRNA表达水平显著高于72 h(P < 0.05)，且24和48 h之间差异不显著(P>0.05)。
24 h时，0.50、0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中 FTH1 的mRNA表达水平显著高于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)；48 h时，0.50和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中 FTH1 的mRNA表达水平显著高于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)；72 h时，0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中 FTH1 的mRNA表达水平显著高于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)。铁水平为0.50 mmol/L时，24 h肝细胞中 FTH1 的mRNA表达水平显著高于72 h(P < 0.05)，而24和48 h之间及48和72之间均差异不显著(P>0.05)；铁水平为0.75 mmol/L时，24和72 h肝细胞中 FTH1 的mRNA表达水平显著高于48 h(P < 0.05)，而24和72 h之间差异不显著(P>0.05)；铁水平为1.00 mmol/L时，24 h肝细胞中 FTH1 的mRNA表达水平显著高于72 h(P < 0.05)，而24和48 h及48和72 h之间均差异不显著(P>0.05)。
综上，在提高含铁酶及 FTH1 的mRNA表达水平方面，适宜的铁水平为0.50 mmol/L，孵育时间为24 h。
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表 3 铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞含铁酶及 FTH1 的mRNA表达水平的影响 Table 3 Effects of Fe level and incubation time on mRNA expression levels of iron-containing enzymes and FTH1 in hepatocytes of broiler embryos |
由表 4可见，铁水平、孵育时间及两者的互作对肝细胞中SDH和CAT的蛋白表达水平均无显著影响(P>0.05)；铁水平和孵育时间对肝细胞中COX1的蛋白表达水平有显著影响(P < 0.05)，但两者的互作对肝细胞中COX1的蛋白表达水平无显著影响(P>0.05)；铁水平及铁水平与孵育时间的互作对肝细胞中FTH1的蛋白表达水平表达有显著影响(P < 0.05)，但孵育时间对肝细胞中FTH1的蛋白表达水平无显著影响(P>0.05)。
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表 4 铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞中含铁酶和FTH1的蛋白表达水平的影响 Table 4 Effects of Fe level and incubation time on protein expression levels of iron-containing enzymes and FTH1 in hepatocytes of broiler embryos |
24和72 h肝细胞中COX1的蛋白表达水平显著高于48 h(P < 0.05)，而24和72 h之间无显著差异(P>0.05)；随着铁水平升高，肝细胞中COX1的蛋白表达水平呈线性升高(P < 0.05)，1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中COX1的蛋白表达水平显著高于其他铁水平组(P < 0.05)。
24、48和72 h时，0.50、0.75和1.00 mmol/L铁水平组肝细胞中FTH1的蛋白表达水平显著高于0 mmol/L铁水平组(P < 0.05)。铁水平为0、0.25和0.50 mmol/L时，24、48和72 h肝细胞中FTH1的蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)；铁水平为0.75 mmol/L时，24和48 h肝细胞中FTH1的蛋白表达水平显著高于72 h(P < 0.05)；铁水平为1.00 mmol/L时，48和72 h肝细胞中FTH1的蛋白表达水平显著高于24 h(P < 0.05)。
综上，肉鸡鸡胚肝细胞中SDH和CAT的蛋白表达水平不受铁水平和孵育时间的影响。在提高肝细胞中COX1的蛋白表达水平方面，适宜铁水平为1.00 mmol/L；在提高肝细胞中FTH1的蛋白表达水平方面，适宜铁水平为0.25、0.50和0.75 mmol/L；而提高COX1和FTH1的蛋白表达水平的适宜孵育时间均为24 h。
3 讨论 3.1 铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞中铁含量的影响前人关于铁对动物肝细胞中铁利用方面的研究较少。据报道，在原代培养大鼠肝细胞铁摄入调控试验中，设置细胞培养液中铁水平分别为0.01、0.10和0.50 mmol/L，发现在不同水平的铁培养液中处理24 h后，与对照组相比，培养液铁水平为0.10 mmol/L时肝细胞中铁含量最高(大约是对照组肝细胞铁含量的2倍)，显著高于铁水平为0.01和0.50 mmol/L铁水平时，但铁蛋白mRNA表达水平在铁水平为0.50 mmol/L时最高[21]。但采用原代培养鸡胚肝细胞模型来研究铁在肝细胞中的利用及其机制的研究尚未见报道。本试验前期，在肉仔鸡铁需要量相关研究中发现：饲喂正常饲粮的22日龄肉鸡肝脏铁含量为59 mg/kg(约1.0 mmoL/L)[7]。因此，本试验以1.0 mmol/L为最高铁水平，在0.50 mmoL/L铁水平上下，采用等差法设置0、0.25、0.50、0.75及1.00 mmol/L 5个铁水平是合理可行的。
肝脏是大多数动物铁代谢的主要器官，研究者们多采用肝脏铁作为评价动物体内铁营养状况的敏感指标。Ma等[26]研究发现，在1~21日龄肉仔鸡饲粮中添加20~120 mg/kg铁时，随铁添加水平的升高，21日龄肝脏铁含量呈二次曲线形式升高，当铁添加水平为60 mg/kg时，肝脏铁含量达到最大值，之后保持稳定。Seol等[27]研究表明，在1~35日龄肉仔鸡饲粮中添加100或200 mg/kg的铁(源于蛋氨酸铁)，可显著提高35日龄肝脏铁含量。Ahmad等[21]研究发现，当培养液中铁水平为0.01和0.10 mmol/L时，原代培养大鼠肝细胞铁含量随着培养时间的延长而升高，而铁水平为0.50 mmol/L时，大鼠肝细胞铁含量随着孵育时间的延长先升高后保持稳定。以上研究结果与本试验结果相一致。铁作为一种必要的营养物质，如果摄入过量会导致细胞损伤，例如：参与氧化还原反应，而导致不受控制自由基的产生，从而破坏脂质膜、蛋白质或DNA[28]。故由于游离铁对细胞有害，铁在细胞中会被迅速用于代谢目的，进入线粒体，以无毒的形式储存或输出细胞中所有多余的铁，来防止不可控的氧化还原反应物质的产生而造成细胞损伤[29]。同时，在细胞水平上，缺铁也会影响细胞增殖、生长、分化、能量代谢及生物转化等多方面的功能[30-31]。由于游离的铁离子对细胞有损伤，故在进入细胞以后，一部分铁与含铁酶结合，参与细胞代谢，而大部分则与细胞内的铁蛋白结合，生产铁蛋白复合物而转换成惰性形式存储在肝细胞中。可以推测，当孵育液铁水平较低时，随着孵育时间的延长，细胞内铁水平有一定的累积，而继续增大铁水平，则会使细胞中铁蛋白很快到达饱和而维持动态平衡，且多余的铁则被运输出细胞外，之后，随着孵育时间的延长细胞铁含量基本保持不变。细胞铁含量可能随着铁水平升高而升高，当升高到一定程度后，可通过自身调节使铁水平保持在一定的水平，进而可避免因铁水平过高而引起细胞中毒。
3.2 铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞中含铁酶活性的影响动物体内的SDH存在于所有有氧呼吸细胞中，和线粒体膜牢固结合，是三羧酸循环中唯一与内膜结合的酶，也是脱氢酶中最重要的酶，SDH与自由基的减少和生成有关[32]。CAT被认为是主要的抗氧化酶，因为它们参与了ROS的直接清除[15]。COX是呼吸链末端的电子受体，通过铜离子(Cu2+)将获得的电子直接传递给氧原子，使氧气转化成水[13]。这3种酶都是机体呼吸链中的含铁关键酶，以它们为指标进行动物体内铁代谢利用方面的研究已有较多报道。研究表明，随着饲粮中铁添加水平的升高，断奶仔猪肝脏中SDH和CAT活性线性升高[15]；而大鼠缺铁时，其大脑中COX活性降低[13]。Ma等[20]发现，在1~21日龄肉仔鸡饲粮中添加20~120 mg/kg铁(源于无机硫酸亚铁)时，随着饲粮添加铁水平的增加，21日龄肝脏组织中SDH、CAT和COX1活性均呈二次曲线形式升高。Liao等[33]也报道，在22~42日龄肉仔鸡饲粮中添加20~100 mg/kg铁(源于无机硫酸亚铁)可显著提高42日龄肝脏COX活性。本试验研究发现，在孵育24和72 h，铁水平显著提高了肉鸡鸡胚肝细胞中CAT活性，且肝细胞中COX活性随着培养液铁水平的升高而呈明显的线性升高，这与以上前人体内试验结果基本一致。但在本试验中，肉鸡鸡胚肝细胞中SDH活性随着培养液铁水平的升高而呈线性或二次曲线形式下降，这与前人的研究不一致。其原因可能是：本试验采用体外细胞培养试验，而前人采用动物试验，动物机体对铁水平有一定的耐受性，而细胞相对于动物机体结构简单，对铁反应更敏感，耐受性较低，本试验中所设置的铁水平可能高于肉鸡肝细胞中SDH所需的铁水平，进而出现负反馈调节，降低了SDH活性。
本研究发现，孵育时间对肝细胞中SDH、CAT及COX活性均有影响，SDH随着孵育时间的延长其活性先降低后升高；COX活性则在孵育24与48 h后无明显的变化，然而继续延长孵育时间则会降低其活性；在铁水平为0 mmol/L时，肝细胞中CAT活性随着孵育时间的延长其活性持续下降，在添加铁后，孵育24 h后其活性明显高于48和72 h。以上述酶活性作为评价指标，在动物试验中有报道，但是在体外细胞培养相关研究中还未见报道，而SDH、CAT及COX是呼吸链中的关键酶，主要存在于线粒体中。推测是由于本试验利用原代肉鸡鸡胚肝细胞培养模型来进行研究，随着培养时间的延长，细胞增殖的速率有所下降，故而活细胞相对数量减少，线粒体数量减少，细胞呼吸相关酶活性下降。但由于这3种酶在线粒体中的含量及结构有所不同，故其活性下降的趋势和程度略有不同。
3.3 铁水平和孵育时间对肉鸡鸡胚肝细胞中含铁酶及 FTH1 基因和蛋白表达的影响Ma等[26]研究表明，当1~21日龄肉鸡饲粮中添加20~120 mg/kg硫酸亚铁形式铁时，21日龄肉仔鸡肝脏SDH和COX的mRNA表达水平随饲粮铁添加水平的增加而呈明显的二次曲线形式上升，但CAT的mRNA表达水平不受饲粮铁添加水平的影响。Zhang等[17]研究发现，1~21日龄肉仔鸡饲粮中添加20~60 mg/kg的铁(分别源于硫酸亚铁、蛋氨酸铁或蛋白铁)，14日龄肝脏CAT和21日龄肝脏SDH的mRNA表达水平随铁添加水平的升高呈明显的线性升高。但Liao等[33]却发现，当22~42日龄饲粮添加20~100 mg/kg硫酸亚铁形式铁时，42日龄肉仔鸡肝脏SDH、CAT和COX的mRNA表达水平不受饲粮添加铁水平的影响。以上结果说明，肝脏中以上含铁关键酶的mRNA表达受饲粮铁水平和肉鸡日龄的影响。本试验的研究结果也表明，铁水平和孵育时间均对肉鸡鸡胚肝细胞中SDH、CAT、COX7A2L的mRNA表达水平有显著影响，与上述体内试验结果基本一致。本试验还发现，铁水平对肉鸡鸡胚肝细胞中SDH和CAT的蛋白表达水平无显著影响，说明铁对SDH、CAT及COX1的基因表达调控可能主要是在转录水平，但铁对上述含铁酶的mRNA表达调控的机制目前尚不清楚。FTH1一方面可储存机体中的过剩铁，避免产生铁中毒；另一方面，可以释放铁，用于体内合成含铁的蛋白质[34]。调节 FTH1 表达的典型体系是在转录后基于靶mRNA上铁调控蛋白(IRP)和铁反应元件(IRE)相互作用的铁依赖性调节体制[35]。当细胞内铁离子浓度较低时，IRP和IRE阻止了核糖体组装，从而抑制了铁蛋白的翻译；当细胞内铁离子浓度升高时，IRP和IRE含量减少，从而增加了铁蛋白的翻译来储存过量的铁[36]。铁调节铁蛋白的生物合成主要是在翻译水平，但也会在转录水平上调节铁蛋白的表达，对机体外源注射三价铁离子(Fe3+)，在转录水平上调节了铁蛋白的表达[37-38]。本试验中，铁既提高了 FTH1 的mRNA表达水平，又提高了其蛋白表达水平，这与前人的研究结果一致，说明铁调节铁蛋白基因表达，是从转录水平和翻译蛋白水平2方面进行调节。本研究还表明，铁水平较低时，肝细胞中FTH1蛋白表达水平不受孵育时间的影响，铁水平较高时，随铁水平的升高，孵育时间延长可更好地提高其蛋白表达水平，但这种调节的具体作用机制尚不清楚，有待于进一步研究。
4 结论培养液中铁水平和孵育时间可影响原代培养肉鸡鸡胚肝细胞中铁含量，SDH、CAT、COX活性及其mRNA表达水平，以及 FTH1 的mRNA表达水平。综合考虑以上指标，适宜的铁水平为0.50 mmol/L，孵育时间为24 h。
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