乳蛋白所含必需氨基酸对生命健康具有重要作用[1],乳蛋白含量也是评价奶牛泌乳性能及牛乳质量的关键指标。乳蛋白由饲粮营养成分经过奶牛自身复杂生物学系统转化产生,与饲粮结构[2]和体内多种激素[3]等密切相关。奶牛摄入饲粮蛋白质后,经过瘤胃微生物作用分解产生氨基酸,而后发酵成氨态氮用于合成瘤胃微生物蛋白;部分微生物蛋白在瘤胃内降解,但大部分随食糜进入皱胃,受消化酶作用后分解成氨基酸[4];余下瘤胃未降解蛋白到达小肠后受消化酶作用分解成氨基酸[5]。以上途径产生的氨基酸经由小肠吸收进入血液[6]转变为游离氨基酸(free amino acids,FAA),FAA是决定最终乳蛋白含量的必要物质基础[7]。血液中FAA流经乳腺时被乳腺组织摄取利用,加工后合成乳蛋白,约占全部乳蛋白的90%[8],其余乳蛋白来自奶牛血液转运[9]。由此可见,瘤胃微生物对饲粮蛋白质的作用强度直接影响进入小肠的氨基酸含量,进一步对作为乳蛋白前体物的FAA产生影响,从而间接对乳蛋白的自身合成起到一定调节作用。但目前对瘤胃微生物与乳蛋白合成相关性的报道相对较少。
瘤胃微生物通过自身合成的酶类对饲粮中营养成分进行降解,其中嗜淀粉瘤胃杆菌、溶纤维丁酸弧菌、栖瘤胃普雷沃氏菌等能够降解饲粮中的蛋白质[10]。研究瘤胃内微生物与乳蛋白合成调控之间的关系对提升乳品质具有重要意义,但由于瘤胃微生物不易体外培养,使得相关研究受到限制,而利用宏基因组学技术不仅能够对整个瘤胃微生态进行系统地分析,还可以得到物种、基因和功能三者之间的联系[11]。孙会增[12]利用宏基因组学技术分析了瘤胃微生物受饲粮结构影响对奶牛生长性能指标产生的变化规律。田彦[13]通过高通量测序技术分析了瘤胃微生物与乳脂肪合成前体物之间存在的潜在关系。迄今为止,很少有研究者探讨相同饲粮结构及饲养环境下,瘤胃微生物与乳蛋白合成前体物之间的潜在关系。本试验以黑龙江省某牧场内荷斯坦奶牛为研究对象,在相同饲粮结构及饲养环境下,采集乳蛋白含量长期偏高及长期偏低奶牛的瘤胃内容物样本,通过宏基因组学分析试验组别之间微生态的差异性,旨在探究瘤胃微生物与乳蛋白合成之间潜在的调节关系,为提升乳蛋白含量提供新的参考思路以及数据支持。
1 材料与方法 1.1 试验设计本试验选用黑龙江省某牧场荷斯坦奶牛,对牧场内全部奶牛进行为期12个月的奶牛生产性能测定(dairy herd improvement,DHI)数据定向追踪,筛选出产奶量[(35.1±2.4) kg/d]相近,且乳蛋白含量长期偏高(>3.7%)的奶牛3头,为HighMP组;乳蛋白含量长期偏低(3.0%~3.3%)的奶牛3头,为LowMP组。筛选条件参照中国奶牛数据中心https://www.holstein.org.cn/。为最大限度降低其他因素对本试验结果可能造成的干扰,全部试验牛只来自同一父本且均为2014年2月出生,其饲养环境、饲粮配方[饲喂参照NRC(2001)标准配制,见表 1。参照GB/T 6434—2006方法测定酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量,参照GB/T 6432—1994方法测定粗蛋白质含量,参照GB/T 6433—2006方法测定粗脂肪含量,参照GB/T 6436—2002方法测定磷含量,参照GB/T 6435—2002方法测定钙含量]、产犊胎次(3胎)都相同,同时试验牛只均处于泌乳中期[泌乳天数为(150±12) d,见表 2]。采取当月(2018年6月)牛乳样本后测定试验牛只产奶量及乳蛋白含量,并进行体细胞数检测,符合要求后进行瘤胃内容物样本采集。
通过牧场转盘式挤奶厅下方的牛乳采样器收集每头试验牛只当日的牛乳样品各50 mL,其中早、中、晚采样量比例为4 : 3 : 3。牛乳样品送至黑龙江省农垦畜牧兽医研究所DHI测定中心检测乳蛋白含量、产奶量及体细胞数。
1.2.2 瘤胃内容物样品的采集与处理确认上述检测结果后,于牧场奶牛晨饲后3~4 h内用瘤胃口腔导管法采集所有试验牛只瘤胃内容物。每头试验牛只采集36 mL经4层纱布过滤后的瘤胃内容物,首先采用便携式pH计(testo-206-pH2)测量瘤胃内容物pH,再将其中6 mL分装于4只1.5 mL冻存管,立即投入液氮罐中速冻后经干冰运输至实验室,保存于-20 ℃,以便进行微生物DNA的提取与检测。余下30 mL分装于2只15 mL离心管中,立即投入液氮罐中速冻,再转移到实验室,-80 ℃超低温冰箱保存备用。为防止采样过程中唾液影响,弃掉起初50 mL左右瘤胃内容物;为降低瘤胃口腔导管插入深度和位置对不同试验牛只样本采集的潜在影响,口腔导管均保持相同的插入深度;为减小人为误差,采样固定由1名技术娴熟的专业人员负责操作。
1.3 宏基因组DNA提取及建库测序 1.3.1 DNA提取使用DNA提取试剂盒(HiPure Stool DNA Kits, 美基生物,广州)从装于1.5 mL冻存管的瘤胃内容物中提取基因组DNA。具体操作严格按照DNA Kit的标准规范进行。提取后的DNA使用1%的琼脂糖电泳、NanoPhotometer®微量分光光度计(IMPLEN, 美国)和Qubit® 2.0 Flurometer核酸浓度检测仪器(Life Technologies, 美国)进行DNA浓度与质量的检测。全部样品DNA总量均大于1 μg,OD260/280≥1.8,条带未见降解。提取后,所有DNA样品均保存在-80 ℃下,直到进行后续处理。
1.3.2 文库构建与测序每个样本用1 μg DNA作为模板,使用NEBNext® ULtraTM DNA Library Prep Kit for Illumina®(NEB#7370)试剂盒进行文库构建。
1.3.3 上机测序首先通过Agilent2100生物分析仪和实时荧光定量PCR(real-time PCR)以进行文库质量检测与定量。再取10 ng的文库,用MiSeq Reagent Kit v3(Illumina Inc, San Diego, 美国)在Illumina MiSeq中进行双向测序,测序过程在基迪奥生物科技有限公司进行。
1.4 宏基因组数据预处理 1.4.1 数据过滤与去除宿主污染使用软件Trimmomatic(v0.32)对原始数据进行过滤,数据过滤内容为:去除含adapter的reads、去除N的比例大于10%的reads、去除低质量reads(质量值Q≤20的碱基数占整个read的40%以上),得到clean reads。将clean reads与bosTau8宿主基因组数据库比对,比对软件为bowtie2,得到HQ clean reads用于后续分析。
1.4.2 序列组装利用MEGAHIT软件对有效序列进行组装,并在不同kmer长度下组装reads获得contigs。
1.5 微生物多样性与功能分析利用MetaGeneMark对>500 bp的contigs进行开放阅读框(open reading frame, ORF)预测,再采用CD-HIT软件对符合条件(95%多样性,90%覆盖率)的预测基因进行聚类,选取最长的基因作为每类代表序列,构建初始非冗余基因集合。获得非冗余基因集后,使用KEGG orthology数据库(版本67.1)进行分级功能分类,以鉴定各种途径之间的层级关系并获得KEGG正位标识符和酶委员会(EC)系数。为了获得每组中的独有功能,通过Mac终端中的Mother程序将所有6个样本及每组3个样本的数据分别组合在一起,并且上传到MG-RAST中以进行相同的功能分析,其中以所有样本组合功能分析作为参考。将得到的可用序列整理到Excel表格中,先计算每个水平微生物或功能在每个样本中的相对比例(相对丰度),然后进行统计分析:对每种微生物或功能进行正态分布检测,符合正态分布的用SAS 22.0中的TTEST模型程序进行统计分析,不符合正态分布的用SAS 22.0中的GLM模型程序进行统计分析。同时将Unigenes通过DIAMOND软件比对到eggNOG数据库,对基因进行进一步功能注释。同时,使用NCBI的RefSeq数据库,对其中的微生物构建索引,使用MetaOthello,在k-mer=31的条件下进行物种注释,并统计各样本的物种注释及丰度信息,获得物种丰度结果。根据基因丰度结果、基因功能注释结果以及物种丰度信息结果,开展组间比较,获得组间差异物种以及差异基因。对物种丰度差异分析采用R包DESeq2(v1.20.0), Wald测验(fitType=“parametric”)方法进行差异微生物相关性分析。
1.6 统计分析使用SPSS 22.0中的Mann-Whiney U检验比较2组间统计结果的差异。P < 0.05为差异显著,P < 0.01为差异极显著。
2 结果与分析 2.1 不同乳蛋白含量奶牛相关参数全部样本牛乳体细胞数均小于200 000个/mL(图 1-A),符合欧盟规定的奶牛健康乳腺判定标准(体细胞数<300 000个/mL)[14]。pH介于6.2~6.5,符合健康奶牛瘤胃标准[15]。HighMP组奶牛体细胞数和产奶量与LowMP组差异不显著(P=0.299, P=0.911)(图 1-A、图 1-C);瘤胃pH略低于LowMP组(图 1-B),但并不具有统计学意义(P=0.067);乳蛋白含量极显著高于LowMP组(P < 0.001)(图 1-D)。
试验共收集6例奶牛瘤胃内容物样本进行宏基因组分析,将测序后得到的raw data进行过滤(图 2-A),进一步去除宿主污染后共产生314 525 919条HQ clean reads(图 2-B),其中HighMP组共获得149 239 610条HQ clean reads,平均每个样本49 746 537条HQ clean reads;LowMP组共获得165 286 309条HQ clean reads,平均每个样本55 095 436条HQ clean reads。所有样本中包含HQ clean reads最多的为58 340 861条,最少的为48 027 731条。
主坐标分析(principal coordinates analysis,PCoA)图中明确地展示出HighMP组与LowMP组微生物物种基因的趋向特征(图 3-A)。物种分析结果显示,瘤胃内细菌相对含量在69.23%~70.83%,真菌相对含量在18.32%~19.80%,其他微生物相对含量在10.54%~10.97%(图 3-B)。检测结果中共鉴定得到39门、1 774属和5 567种的微生物。其中HighMP组各样本均检测到39门、1 743属、5 493种的微生物;LowMP组各样本均检测到39门、1 744属、5 496种的微生物(图 3-C)。
本次试验结果显示,门水平微生物有30种细菌,8种真菌,1种原虫,且在HighMP组与LowMP组各样本中均检测到。其中变形菌门(Proteobacteria, 30.79%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 16.44%)、厚壁菌门(Firmicutes, 13.89%)是主要优势菌门。属水平HighMP组与LowMP组共有微生物1 739个类别,其中普雷沃氏菌属(Prevotella, 12.56%)是主要优势菌属。在种水平共检测到1 122种优势微生物(相对含量>0.01%)。
2.3 高乳蛋白含量奶牛瘤胃内特征性微生物依据线判别分析及影响因子(LEfSe)进化分支图及线性判别分析(LDA)值分布图(图 4-A、图 4-B)可知,在HighMP组中,Bacteroidetes、拟杆菌纲(Bacteroidia)、Prevotella、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、拟杆菌目(Bacteroidales)、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)等微生物显著富集,且具有较大影响。
对种水平优势微生物(相对含量>0.01%)的基因相对丰度分析后发现,HighMP组表达Prevotella ruminicola的基因相对丰度极显著升高(P < 0.01),表达Prevotella的基因相对丰度显著升高(P < 0.05)(图 5-A、图 5-B);同时,三角酵母属(Trigonopsis)是HighMP组独有微生物。
将检测结果中的raw data经处理后得到非冗余基因集,再通过DIAMOND软件(阈值evalue≤1e-5)比对到KEGG、eggNOG数据库,同时集合基因的相对丰度表格计算不同数据库比对结果的丰度信息。
2.4.1 与蛋白质生理代谢相关的功能基因富集情况京都基因与基因组百科全书通路注释(kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway annotation,KEGG pathway annotation)结果表明,瘤胃内微生物基因功能主要富集于碳水化合物代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢等生理过程(图 6-A)。试验进一步筛选出与蛋白质生理代谢相关的功能后,发现功能基因主要富集于半胱氨酸和蛋氨酸代谢过程(图 6-B)。对比2组基因功能后发现,瘤胃内微生物的氨基酸代谢和其他氨基酸代谢功能基因存在显著差异(图 6-C、图 6-D),HighMP组显著高于LowMP组(P < 0.05)。
通过对比HighMP组与LowMP组eggNOG数据库反馈结果,得到2组微生物基因在蛋白质降解及氨基酸代谢功能上的区别。在结果中选取相对丰度前30%的基因分析后发现,与氨基酸转运与代谢相关功能基因中,COG2755呈现高度富集状态(图 7-A);与翻译后修饰、蛋白质转换、蛋白质伴侣相关功能基因中,COG0524、COG0612、COG0526、COG1404呈现高度富集状态(图 7-B)。为进一步研究瘤胃内蛋白质生理代谢的生物学过程,试验筛选结果中与蛋白质降解及氨基酸代谢过程密切相关的COG0006、COG0265、COG0542、COG0612、COG0826、COG1404、COG1506、COG2195、COG2755、COG4870基因,比对后发现:HighMP组COG0542、COG0612、COG1404、COG1506、COG2755、COG4870的基因数量显著高于LowMP组,而COG0006、COG0265、COG0826、COG2195的基因数量虽然略高于LowMP组,但不具有统计学意义(P < 0.05, 图 7-C~图 7-L)。
对HighMP组显著升高基因的富集度进一步统计发现,COG1404为主要富集基因,之后依次为COG0612、COG2755、COG0542、COG1506、COG4870(图 8)。
目前,在相同饲粮结构及饲养环境下对瘤胃微生物群与宿主乳蛋白含量之间相互作用关系的报道较少。本试验通过宏基因组学技术,综合分析瘤胃微生物、微生物基因、基因功能与宿主合成乳蛋白之间的潜在调节作用。
3.1 不同乳蛋白含量奶牛瘤胃微生物组成结构的差异本试验结果显示,奶牛瘤胃内优势门水平微生物为Proteobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes,优势属水平微生物为 Prevotella,与马健等[16]以及Jami等[17]分析荷斯坦奶牛瘤胃内优势微生物的结果相一致,而与逄宾宾等[18]以及李子健等[19]的研究结果在3种优势微生物相对含量顺序上有一定差异,引起这种情况的原因可能与外界环境、饲养方式[20]、饲粮结构[21]等多方面因素有关,有待进一步的研究。本试验结果显示,在相同饲粮结构及饲养环境下,高乳蛋白含量奶牛瘤胃内种水平微生物 Prevotella ruminicola 的相对含量显著升高,与Xue等[22]的研究结果一致。Hazlewood等[23]的研究表明,Prevotella ruminicola 是瘤胃内具有降解蛋白质功能数量最多的微生物,能够分泌多种蛋白酶。Gruninger等[24]的研究同样表明 Prevotella ruminicola 与瘤胃内蛋白质和氨基酸的代谢紧密相关。此外,本试验首次发现,乳蛋白含量可能与瘤胃微生物 Trigonopsis 有关,赵沁沁等[25]的研究表明,Trigonopsis 与氨基酸代谢密切相关。酵母类微生物的生存条件受到pH的影响[26],HighMP组奶牛瘤胃内相对较低的pH环境可能为 Trigonopsis 的生长提供了一定的条件。因此,在相同饲粮结构及饲养环境下,Prevotella ruminicola 和 Trigonopsis 的相对含量的差异可能是导致HighMP组奶牛乳蛋白含量显著升高的主要原因。以上结果表明,HighMP组奶牛具有特定功能的微生物群通过作用于瘤胃内蛋白质及氨基酸进而产生了一种稳定的微生态系统,并倾向于增强瘤胃内氨基酸代谢的能力。
3.2 不同乳蛋白含量奶牛瘤胃微生物基因功能的差异综合分析KEGG和eggNOG数据库结果可知,奶牛瘤胃内微生物基因功能主要富集于碳水化合物代谢和氨基酸代谢的生理过程,与孙会增[12]的研究结果相一致。瘤胃内碳水化合物代谢包括对饲粮中结构性碳水化合物和非结构性碳水化合物的代谢[27],通过表达纤维素、木葡聚糖、甘露聚糖、(1,3:1,4)-β-D-葡聚糖、木聚糖、鼠李聚半乳糖醛酸等相关降解酶发挥作用[28];瘤胃内与乳蛋白合成相关的氨基酸代谢主要为限制性氨基酸代谢[29],包括对蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸和组氨酸等[30]的作用。本试验结果显示,HighMP组奶牛半胱氨酸与蛋氨酸代谢功能的基因相对丰度显著升高,通常情况下蛋氨酸为奶牛第一限制性氨基酸,李吕木等[31]的研究表明,在瘤胃微生物无其他氮源和碳源的条件下,添加蛋氨酸可加速缬氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和组氨酸的利用,同时改变组氨酸的代谢情况,使产物中游离甘氨酸含量增加。此外,本试验结果显示,HighMP组奶牛表达氨基酸代谢和其他氨基酸代谢功能基因的相对丰度显著升高,因此能够增强瘤胃内氨基酸代谢能力。
本试验结果显示,HighMP组微生物在瘤胃内蛋白质降解及氨基酸代谢过程中,COG0542、COG0612、COG1404、COG1506、COG2755、COG4870的基因数量显著高于LowMP组,其中COG1404为主要富集基因。结合eggNOG数据库分析可知,基因COG1404、COG0612在微生物对蛋白质降解过程中通过表达多肽酶发挥功能,基因COG2755在氨基酸生理代谢过程中通过表达脂解蛋白GDSL发挥作用,基因COG0542在微生物对蛋白质降解过程中通过表达ATP依赖性CLp蛋白酶ATP结合亚基发挥作用,基因COG1506在氨基酸生理代谢过程中通过作用于多肽酶s9脯氨酰寡肽酶活性位点域蛋白发挥功能,基因COG4870在氮循环中通过表达组织蛋白酶发挥作用。升高的COG0542、COG0612、COG1404、COG1506、COG2755、COG4870基因为HighMP组奶牛提供了更好的蛋白质降解及氨基酸代谢能力。以上结果表明,微生物促进了饲粮蛋白质向乳蛋白前体物的转化,同时也促进了瘤胃内蛋白质降解及氨基酸代谢的生理过程。HighMP组奶牛瘤胃内微生物的组成与功能均具有更好地促进乳蛋白前体物合成的能力。
4 结论在相同饲粮结构及饲养环境下,瘤胃内 Prevotella ruminicola 和 Trigonopsis 这2种微生物相对含量的差异对调节乳蛋白含量具有一定作用;瘤胃内微生物可能通过高表达 COG0542、COG0612、COG1404、COG1506、COG2755、COG4870 基因,增强瘤胃内蛋白质降解及氨基酸代谢作用,影响乳蛋白前体物合成情况,进而调节乳蛋白的产量。
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