动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (8): 3906-3916    PDF    
利用人工瘤胃产气法比较不同品种肉牛瘤胃发酵特性和产甲烷差异
祝伊枭 , 王之盛 , 胡瑞 , 王雪莹 , 周芯宇 , 代秦丹 , 曹广 , 马健 , 张翔飞 , 邹华围 , 彭全辉 , 薛白 , 王立志     
四川农业大学动物营养研究所, 四川省牛低碳养殖与安全生产高校重点实验室, 成都 611130
摘要: 本试验旨在利用人工瘤胃产气法比较不同品种肉牛瘤胃发酵特性和产甲烷(CH4)等温室气体的差异。选用健康无病、年龄相近(24月龄)的麦洼牦牛、中国荷斯坦奶公牛、犏牛(藏黄牛×麦洼牦牛)阉公牛各5头,相同舍饲环境下饲喂相同饲粮42 d后,采集各品种肉牛瘤胃液进行相同饲粮底物的体外发酵,比较分析体外发酵产气量、产气参数、发酵参数以及CH4、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)产量。结果表明:1)各组产气量随着发酵时间延长呈增加趋势。犏牛组慢速发酵部分产气量和潜在产气量显著高于中国荷斯坦奶公牛组和麦洼牦牛组(P < 0.05),而中国荷斯坦奶公牛组和麦洼牦牛组快速发酵部分产气量和产气速率显著高于犏牛组(P < 0.05)。2)中国荷斯坦奶公牛组发酵24和48 h乙酸/丙酸显著高于其余2组(P < 0.05),麦洼牦牛组发酵48 h丙酸和总挥发性脂肪酸(TVFA)含量显著高于其余2组(P < 0.05),麦洼牦牛组发酵72 h乙酸、丙酸、丁酸和TVFA含量显著高于其余2组(P < 0.05)。同时,麦洼牦牛组乙酸、丙酸和丁酸理论最大产量以及乙酸和丁酸产量潜在增幅显著高于其余2组(P < 0.05)。3)各组发酵液pH均处于正常范围。犏牛组和麦洼牦牛组发酵24和48 h发酵液pH显著高于中国荷斯坦奶公牛组(P < 0.05),麦洼牦牛组发酵24、48、72 h发酵液氨态氮含量显著高于其余2组(P < 0.05),麦洼牦牛组发酵48、72 h发酵液微生物蛋白含量显著高于其余2组(P < 0.05)。综上所述,麦洼牦牛、中国荷斯坦奶公牛、犏牛的瘤胃微生物发酵能力不同。
关键词: 品种    肉牛    体外发酵    发酵特性    甲烷产量    
Comparison of Rumen Fermentation Characteristics and Methane Production of Different Breeds of Beef Cattle by Artificial Rumen Gas Production Method
ZHU Yixiao , WANG Zhisheng , HU Rui , WANG Xueying , ZHOU Xinyu , DAI Qindan , CAO Guang , MA Jian , ZHANG Xiangfei , ZOU Huawei , PENG Quanhui , XUE Bai , WANG Lizhi     
Key Laboratory of Low Carbon Culture and Safety Production in Cattle in Sichuan, Animal Nutrition Institute of Sichuan Agriculture University, Chengdu 611130, China
Abstract: This experiment was conducted to compare the differences in rumen fermentation characteristics, methane (CH4) production and other greenhouse gases of different breeds of beef cattle by artificial rumen gas production method. Each five healthy Maiwa yaks, Chinese Holstein steers, cattle-yaks (Tibetan yellow cattle×Maiwa yaks) with similar age (24-month-old) were selected and fed with the same diet for 42 days in the same house feeding environment, and then the rumen fluid of each breed were collected for in vitro fermentation with same diet substrate, the in vitro fermentation gas production, gas parameters, fermentation parameters and yield of CH4, hydrogen (H2) and carbon dioxide (CO2) were compared. The results showed as follows:1) the gas production of each group showed an upward trend with fermentation time increased. The slowly fermentation fraction gas production and potential gas production of cattle-yak group were significantly higher than those of Maiwa yak group and Chinese Holstein steer group (P < 0.05), while the rapidly fermentation fraction gas production and gas production rate of Maiwa yak group and Chinese Holstein steer group were significantly higher than those of cattle-yak group (P < 0.05). 2) The acetate/propionate at fermentation 24 and 48 h of Chinese Holstein steer group was significantly higher than that of other 2 groups (P < 0.05), the contents of propionate and total volatile fatty acid (TVFA) at fermentation 48 h of Maiwa yak group were significantly higher than those of other 2 groups (P < 0.05), and the contents of acetate, propionate, butyrate and TVFA at fermentation 72 h of Maiwa yak group were significantly higher than those of other 2 groups (P < 0.05). Meanwhile, the theological maximum productions of acetate, propionate, butyrate and potential growth rates of acetate, butyrate production of Maiwa yak group were significantly higher than those of other 2 groups (P < 0.05). 3) The fermentation liquid pH of each group was in the normal range. The fermentation liquid pH at fermentation 24 and 48 h of cattle-yak group and Maiwa yak group was significantly higher than that of Chinese Holstein steer group (P < 0.05), the fermentation liquid ammonia nitrogen content at fermentation 24, 48 and 72 h of Maiwa yak group was significantly higher than that of other 2 groups (P < 0.05), and the fermentation liquid microbial protein content at fermentation 48 and 72 h of Maiwa yak group was significantly higher than that of other 2 groups (P < 0.05). In conclusion, the rumen microorganisms have different fermentation capabilities among Maiwa yaks, Chinese Holstein steers and cattle-yaks.
Key words: breed    beef cattle    in vitro fermentation    fermentation characteristics    methane production    

我国是全球第4大肉牛生产国和第2大牛肉消费国,也是世界上牛种资源丰富的国家之一,但是牛源紧张已成为制约我国肉牛产业稳定发展的问题。提高肉牛养殖饲料利用效率并减少温室气体排放是我肉牛、牦牛产业可持续发展的基础。我国牦牛存栏量世界第一,占世界牦牛总数的90%以上,约2 000万头,主要分布在我国西藏、青海、四川、甘肃等高海拔地区,经过长期自然选择,牦牛瘤胃微生物具有较高的纤维降解能力和能量利用能力[1-2]。高原地区为改善牦牛生产性能,将其与其他普通牛种杂交,此杂交品种即为犏牛,同样有着独特的高原营养代谢特点[3]。另外,奶公牛因增重速度快、饲料报酬高、产肉率高等特点成为近年来有效补充牛源不足的新发展趋势[4],充分利用我国的奶公牛资源也可缓解我国牛源不足的问题。

研究表明,不同品种的肉牛对营养物质消化能力有差异[5]。武斌等[6]比较不同遗传基础肉牛的营养物质消化率,发现遗传基础影响粗蛋白质和粗脂肪的消化率。Li等[7]使用宏基因组学和转录组学比较研究3个肉牛品种瘤胃微生物区系,发现不同品种肉牛瘤胃微生物种群或降解酶活性不同。另外,瘤胃微生物降解有机物的同时会产生甲烷(CH4)等温室气体。CH4是仅次于二氧化碳(CO2)的第2大温室气体,约占全球温室气体总量的20.7%,对温室效应的贡献突出,并且CH4的排放会降低动物的饲料效率,损失的能量占总能摄入量的5%~12%[8-9]。Ramirez-Restrepo等[10]研究表明,不同品种肉牛对饲料的能量利用效率和CH4产量不同。虽然目前已有关于不同品种牛之间瘤胃发酵差异的研究,但是在饲喂相同饲粮的条件下,牦牛、犏牛、奶公牛的瘤胃发酵特性和产CH4的差异闪未见报道。

因此,本研究选用麦洼牦牛、犏牛(藏黄牛×麦洼牦牛)、中国荷斯坦奶公牛,在相同舍饲环境下饲喂相同饲粮42 d,利用人工瘤胃产气法比较不同品种肉牛瘤胃发酵特性和CH4产量的差异,以期为促进不同肉牛的科学饲养、提高饲料利用效率提供试验依据和数据资料。

1 材料与方法 1.1 试验设计

采用相互对比试验,选取健康无病、年龄相近(24月龄)的麦洼牦牛、中国荷斯坦奶公牛、犏牛阉公牛各5头,作为瘤胃液供体动物,相同舍饲环境下饲喂相同饲粮42 d,第43天晨饲前2 h采集瘤胃液,试验分为麦洼牦牛组、中国荷斯坦奶公牛组、犏牛组3个组,每个组5头牛的瘤胃液混合后用于体外发酵试验,3组发酵底物均为饲养阶段的试验饲粮,每组在发酵3、6、9、12、24、48、72 h时各设4个重复。

1.2 试验饲粮

试验饲粮在四川农业大学动物营养研究所基地自行配制,参照NRC(2000)中体重550 kg、日增重1.40 kg的肉牛营养需要推荐值,以玉米、豆粕、麦麸、菜籽粕等为精料补充料原料,以白酒糟、燕麦干草为粗饲料设计饲粮配方,精粗比为60 : 40。试验饲粮组成及营养水平见表 1

表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diet (DM basis) 
1.3 体外发酵试验 1.3.1 发酵底物

用四分法采集饲粮样品500 g,65 ℃烘箱烘干,粉碎过18目(1 mm)筛,称取300 mg饲粮样品作为发酵底物至于干燥密封性良好的100 mL透明玻璃发酵针筒底部,针管下部2/3抹上凡士林。

1.3.2 发酵培养液

试验第43天晨饲前2 h,使用真空胃管式瘤胃液采样器采集各组每头牛瘤胃液200 mL,4层纱布过滤,混合每组瘤胃液,置于充满CO2的预热至39 ℃的密封保温瓶中,立即带回实验室转移到39 ℃恒温水浴锅,持续通入CO2保持厌氧。

按照Menke等[11]的方法配制人工唾液,400 mL蒸馏水、0.1 mL微量元素溶液(A液)、200 mL缓冲液(B液)、200 mL常量元素溶液(C液)和1.0 mL刃天青溶液(D液)混合,持续通入CO2,水浴加热至39 ℃后加40 mL还原液(E液),直至溶液变为无色。最后将各组瘤胃液与人工唾液按1 : 2的体积比混合均匀,制成麦洼牦牛组、中国荷斯坦奶公牛组、犏牛组发酵培养液。

1.3.3 水浴恒温培养

采用无菌医用针管抽取30 mL培养液迅速从发酵管前端加入,排出发酵管中的空气,密封后将发酵管前端朝下插入自制不锈钢支架孔中,39 ℃水浴振荡培养(水面高度淹没发酵管内培养液液面高度)。每组设4个空白(仅含培养液30 mL),在第3、6、9、12、24、48、72 h[12]各设4个重复,并在这些时间点将对应的发酵针管迅速放入冷水浴中终止发酵,记录发酵管刻度,先用铝箔集气袋收集发酵气体用于测定气体成分,再分装发酵液于10 mL无菌离心管中,立即测定pH,所有发酵液保存于-20 ℃用于测定发酵参数。

1.4 指标测定 1.4.1 常规营养成分测定

参照GB/T 6438—2007通过550 ℃灰化法测定粗灰分(Ash)含量,间接计算有机物(OM)含量。使用半自动凯氏定氮仪(瑞士万通BUCHI K-355)测定粗蛋白质(CP)含量。使用纤维分析仪(美国安康ANKOM-A2000i)测定中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量。钙(Ca)和磷(P)含量分别参照GB/T 6436—2002和GB/T 6437—2002通过高锰酸钾法和钼黄比色法测定。总能(GE)使用氧弹式热量计(美国帕尔PARR-6400)测定,并根据我国《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)计算综合净能,计算公式为:

式中:NEmf为综合净能(MJ/kg);GE为总能(MJ/kg);能量消化率=91.669 4-91.335 9×(ADF/OM);Kmf为消化能转化为净能的效率。

1.4.2 产气量(GP)和产气动力学参数

参考公式计算产气量:

式中:GPt为样品在t时刻的产气量(mL/mg);Vt为样品发酵t小时后培养管刻度读数(mL);V0为对应时间空白培养管刻度读数(mL);W为样品重(mg)。

采用SAS 9.4统计软件NLIN过程,按照模型[13]对产气量进行非线性拟合计算:

式中:GPt为样品在t时刻的产气量(mL/mg);a为快速发酵部分产气量(mL/mg);b为慢速发酵部分产气量(mL/mg);a+b为潜在产气量(mL/mg);c为产气速率(%/h);t为发酵时间(h)。

1.4.3 发酵参数

瘤胃液pH采用25型高精度pH酸度计进行测定。氨态氮(NH3-N)含量采用碱性次氯酸钠-苯酚分光光度法进行测定[14]。使用差速离心法和二喹啉甲酸(BCA)法蛋白质定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定微生物蛋白(MCP)含量,具体操作步骤参照庄二林[15]和试剂盒说明书。乙酸、丙酸和丁酸3种挥发性脂肪酸(VFA)含量是以巴豆酸为内标物,采用气相色谱仪(美国瓦里安CP-3800)测定,总挥发性脂肪酸(TVFA)含量为乙酸、丙酸、丁酸含量之和。

采用SAS 9.4统计软件NLIN过程,按照模型[16]对VFA产量进行非线性拟合计算:

式中:Y为VFA产量(mmol/L);a为发酵液中VFA理论最大产量(mmol/L);b为随发酵时间延长VFA产量潜在增幅(mmol/L);c为VFA产量增速常数(%/h);t为发酵时间(h)。

1.4.4 气体成分测定

使用气相色谱仪(中国福立GC9790Ⅱ)同时测定CH4、CO2和氢气(H2)的百分比例。

式中:气体产量为单位发酵底物的CH4、CO2或H2产量(mL/mg);GPt为样品在t时刻的产气量(mL/mg);百分比例是发酵产生的总气体中CH4、CO2或H2百分比例测定值(%)。

1.5 数据统计与分析

采用Excel 2017对数据进行初步分析,通过SAS 9.4的一般线性模型(GLM)进行统计分析,组间使用SNK程序进行多重比较,以P < 0.05为差异显著。

2 结果 2.1 体外瘤胃发酵产气量和产气参数

图 1所示,随着发酵时间延长,各组产气量均呈增加趋势,发酵48 h后到达平台期。

图 1 体外发酵72 h产气量动态变化 Fig. 1 Dynamic change of 72 h GP in vitro fermentation

表 2可知,犏牛组和中国荷斯坦奶公牛组发酵48 h产气量显著高于麦洼牦牛组(P < 0.05);而犏牛组发酵72 h产气量最高,显著高于麦洼牦牛组和中国荷斯坦奶公牛组(P < 0.05)。同时,犏牛组慢速发酵部分产气量和潜在产气量显著高于中国荷斯坦奶公牛组和麦洼牦牛组(P < 0.05),而中国荷斯坦奶公牛组和麦洼牦牛组快速发酵部分产气量和产气速率显著高于犏牛组(P < 0.05)。

表 2 体外发酵产气量和产气参数 Table 2 GP and gas parameters in vitro fermentation
2.2 体外瘤胃发酵参数

图 2所示,各组发酵液TVFA含量随着发酵时间延长而增加,并且发酵前期(3~12 h)上升速率更快,而乙酸/丙酸呈先降低后上升的趋势。

图 2 体外发酵72 h总挥发性脂肪酸含量和乙酸/丙酸的动态变化 Fig. 2 Dynamic change of 72 h TVFA content and acetate/propionate in vitro fermentation

表 3可知,各组之间发酵24 h TVFA含量差异不显著(P>0.05),麦洼牦牛组发酵24 h之后TVFA含量继续升高,其余2组基本稳定。中国荷斯坦奶公牛组发酵24和48 h乙酸/丙酸最高,显著高于其余2组(P < 0.05)。麦洼牦牛组发酵48 h丙酸和TVFA含量显著高于其余2组(P < 0.05),麦洼牦牛组发酵72 h乙酸、丙酸、丁酸和TVFA含量显著高于其余2组(P < 0.05)。同时,麦洼牦牛组乙酸、丙酸和丁酸理论最大产量以及乙酸和丁酸产量潜在增幅最高,显著高于其余2组(P < 0.05)。

表 3 体外发酵挥发性脂肪酸含量和生成动力学参数 Table 3 Contents and production kinetic parameters of VFA in vitro fermentation

图 3所示,各组发酵液pH均处于正常范围,随发酵时间延长而下降,24~48 h基本稳定。

图 3 体外发酵72 h pH的动态变化 Fig. 3 Dynamic change of 72 h pH in vitro fermentation

图 4所示,各组发酵液NH3-N含量发酵前期(3~12 h)降低,之后逐渐升高;各组发酵液MCP含量基本呈升高趋势。

图 4 体外发酵72 h氨态氮和微生物蛋白含量的动态变化 Fig. 4 Dynamic change of 72 h NH3-N and MCP contents in vitro fermentation

表 4可知,犏牛组和麦洼牦牛组发酵24和48 h发酵液pH显著高于中国荷斯坦奶公牛组(P < 0.05);麦洼牦牛组发酵24、48、72 h发酵液NH3-N含量最高,显著高于其余2组(P < 0.05)。麦洼牦牛组发酵24 h发酵液MCP含量最高,显著高于犏牛组(P < 0.05);麦洼牦牛组发酵48、72 h发酵液MCP含量最高,显著高于其余2组(P < 0.05)。

表 4 体外发酵pH、氨态氮和微生物蛋白含量 Table 4 pH, NH3-N and MCP contents in vitro fermentation
2.3 体外瘤胃发酵气体组成

图 5所示,3组发酵气体H2、CH4和CO2比例在发酵后期稳定,中国荷斯坦奶公牛和犏牛组H2比例先下降后稳定,而麦洼牦牛组H2比例稍有降低后升高至稳定。3组CH4和CO2比例均呈先升高后稳定的趋势。

图 5 体外发酵72 h气体比例的动态变化 Fig. 5 Dynamic change of 72 h gas proportion in vitro fermentation

表 5可知,犏牛组48和72 h H2产量显著高于其余2组(P < 0.05)。麦洼牦牛组和中国荷斯坦奶公牛组24 h CO2产量显著高于犏牛组(P < 0.05),中国荷斯坦奶公牛组24 h CH4产量显著高于麦洼牦牛组和犏牛组(P < 0.05)。犏牛组和中国荷斯坦奶公牛组48 h CH4和CO2产量显著高于麦洼牦牛组(P < 0.05)。

表 5 体外发酵H2、CH4和CO2产量 Table 5 Yield of H2, CH4 and CO2 in vitro fermentation
3 讨论

瘤胃pH是瘤胃发酵状态的重要指标。瘤胃发酵产生的NH3-N可以提高瘤胃液的pH,而VFA可以降低瘤胃液的pH,使瘤胃液pH在正常范围内波动[17]。随着体外发酵发酵时间的延长,VFA等有机酸持续积累,发酵液pH逐渐下降。本研究中,各组发酵液pH随着发酵时间的延长同样呈下降趋势,但均处在正常pH范围内,说明发酵环境稳定,微生物的生长和代谢正常[18]

体外发酵产气量一定程度可反映OM降解率和微生物活性,产气量越大,OM降解率和微生物活性越高[19]。另外,发酵产气量受发酵底物的影响,发酵不可溶性碳水化合物产气量高于可溶性碳水化合物和蛋白质[20]。本研究发现,中国荷斯坦奶公牛组发酵前期产气量更高,犏牛组发酵后期产气量更高,而麦洼牦牛组产气量较低。犏牛组产气量、慢速发酵部分产气量和潜在产气量均高于其余2组,说明犏牛组不可溶性碳水化合物降解率最高。另外,犏牛组快速发酵部分产气量为负值,不符合快速降解部分产气量的概念,这可能是由于微生物定植延迟或即时可发酵的OM不足以产生大量气体而导致的发酵延迟[21]。牦牛组快速发酵部分产气量和产气速率较高,产气量较低,说明麦洼牦牛组瘤胃液中降解蛋白质等可溶性营养物质的微生物活性较高,蛋白质降解率最高。NH3-N是瘤胃内饲料蛋白质、氨基酸、氨化物、尿素和其他非蛋白氮化合物分解的终产物,同时又是微生物合成MCP的原料,较高的NH3-N含量表明蛋白质降解速度较快[22-23]。麦洼牦牛组发酵液较高的NH3-N含量同样说明麦洼牦牛蛋白质降解率较高。降解不可溶性碳水化合物的分解菌会消耗发酵产生的NH3-N,因此犏牛组NH3-N和MCP含量较低。因此,麦洼牦牛对蛋白质的降解和利用优于中国荷斯坦纳奶公牛和犏牛,这与牦牛瘤胃微生物氨基酸代谢基因显著富集结果[24]一致。随着发酵时间的延长,各组发酵液乙酸/丙酸也呈先降低后升高的趋势,这可能是由于发酵前期可溶性碳水化合物比例较高,微生物发酵以丙酸发酵为主,而在发酵后期主要是不溶性碳水化合物,微生物发酵转为乙酸发酵模式。瘤胃碳水化合物发酵产生乙酸、丙酸和丁酸等VFA,它们是反刍动物的主要能量来源[17, 25]。麦洼牦牛瘤胃发酵可产生较高的乙酸、丙酸、丁酸和TVFA含量,且VFA理论最大产量和潜在增幅也较高,表明麦洼牦牛瘤胃微生物可降解碳水化合物合成较高的VFA为宿主供能。

瘤胃发酵产生的气体主要包括H2、CO2、CH4。H2不仅可以被产甲烷菌消耗合成CH4,还会被细菌利用合成VFA[26]。因此,发酵前期各组气体H2比例都不同程度地下降,而CH4比例和VFA含量都上升。犏牛瘤胃微生物降解碳水化合物产生较高H2产量,但未用于合成VFA,而用于合成CH4,因此VFA含量较低,CH4产量较高。麦洼牦牛瘤胃发酵具有较低的H2产量以及较高的VFA含量,可能是因为其瘤胃微生物可以利用较多的H2合成VFA,而用于合成CH4的H2比例变少,因此CH4产量较低,CO2累积。中国荷斯坦奶公牛瘤胃液发酵产生的H2用来合成较多的乙酸,乙酸的产生伴随着CO2的产生,而CO2可能被产甲烷菌利用合成CH4,从而提高CH4产量。另外,研究表明乙酸/丙酸较小有利于动物对营养物质的降解与利用,与CH4产量呈正相关[27]。本试验的3组CH4产量与乙酸/丙酸结果一致。

4 结论

在相同饲粮条件下,麦洼牦牛、中国荷斯坦奶公牛、犏牛瘤胃微生物对营养物质发酵能力以及CH4产量均不同,主要表现在一下几方面:

① 麦洼牦牛瘤胃微生物可更好地利用快速发酵部分,NH3-N含量较高,MCP和VFA含量较高,发酵模式偏丙酸发酵,产气量及H2、CH4产量均较低;

② 中国荷斯坦奶公牛瘤胃微生物能较快地降解快速发酵部分,但是发酵模式偏乙酸发酵,CO2和CH4产量较高;

③ 犏牛瘤胃微生物能降解慢速发酵部分,NH3-N和MCP含量较低,产气量和H2产量较高,但VFA含量较低,CH4和CO2产量较高。

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