钼(Mo)是人类、动物、植物及微生物所必需的微量元素。钼在动物机体内含量为1~4 mg/kg,是体内黄嘌呤氧化酶(XOD)、醛类氧化酶和亚硫酸肝素氧化酶的基本成分之一,参与电子传递以及铁的释放和运输,能影响多种物质的代谢[1-3]。
钼还与鸡的生长、产蛋率、受精率、孵化率关系密切相关[4-5]。家禽对钼的需要量低,仅为0.2 mg/kg[6],但由于地壳中平均钼含量高、分布广泛,并且钼也是工业中广泛使用的一种金属,自然条件下不会发生钼缺乏症,一般饲粮中不用单独添加,饲粮中的钼已经能满足其需要,极少出现缺乏,且过量的钼具有一定的毒性,有些地方由于土壤蓄积和工业污染常发生动物钼中毒[7-8]。前人研究发现低剂量的钼能提高肉鸡的生长性能[9],但高剂量(50和1 000 mg/kg)的钼会降低幼龄家禽的生长性能[10-11]。而钼作为XOD的组成成分,模式动物试验表明,过量的钼可能降低XOD的活性,因为自由基代谢障碍,引起肝脏氧化损伤,导致细胞凋亡,从而降低肝脏、肾脏功能[12]。前人研究发现过量的钼会产生较强的毒性作用,引起大鼠腹泻,导致肝细胞、肾细胞凋亡,磷代谢障碍,脂代谢与自由基代谢障碍, 免疫功能下降[12-13]。但是,目前,关于过量的钼对蛋鸡生产性能、蛋品质和机体健康的影响未见系统报道。因此,本试验以蛋鸡为研究对象,通过在饲粮中添加不同水平的钼,探讨高钼饲粮对产蛋高峰后期蛋鸡生产性能、血液生化指标和肝脏抗氧化指标影响,为进一步认识钼的毒性效应、缓解钼毒性提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用钼源为钼酸钠(Na2MoO4·2H2O),购买自天津市化学试剂厂,纯度为99.9%,含钼39.66%。
1.2 试验设计试验采用单因素完全随机设计,选用200只健康产蛋高峰后期罗曼粉壳蛋鸡(65周龄),随机分为4个组,每组5个重复,每个重复10只。其中,对照组饲喂基础饲粮(钼含量为1.50 mg/kg),其余3组分别饲喂在基础饲粮基础上以钼酸钠形式添加10(M10组)、20(M20组)、100 mg/kg钼(M100组)的试验饲粮。试验期为5周。在试验开始前进行4周的预试期,在预试期内饲喂不添加钼的基础饲粮,每天记录产蛋率并调整初始产蛋率在各组之间没有显著差异(P>0.05)。试验用基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮,参照中国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)中蛋鸡营养需求配制,其组成及营养水平见表 1,基础饲粮中钼含量为1.50 mg/kg。
饲养试验在四川农业大学动物营养所试验场进行,蛋鸡采用3层阶梯式笼养,每笼2只鸡,5笼为1个重复,每组的5个重复均匀分布在鸡舍内,并且每个组的鸡都均匀分布在上中下3层。每天光照16 h,舍内温度控制在25 ℃左右,自由饮水,每天喂食2次粉料,并观察鸡有无异常行为,每天16:00拣蛋并记录称重,定期打扫圈舍卫生。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 生产性能试验期间每天记录各重复总产蛋数、总蛋重,每周统计1次采食量,计算平均日采食量、产蛋率、平均蛋重、破壳蛋率和料蛋比。
1.4.2 蛋品质在饲养试验结束后每组采集30枚(6枚/重复)外形完好且重量接近平均蛋重的鸡蛋测定蛋品质(16:00采集,19:00测定)。蛋壳强度使用蛋壳强度测定仪测定,蛋壳颜色采用色差仪测定,蛋黄颜色、哈氏单位、蛋白高度采用蛋品质全自动测定仪进行测定,蛋壳厚度(钝端、尖端和赤道)使用蛋壳厚度测定仪测定。用分蛋器将蛋白和蛋黄分离,并对蛋黄重及蛋壳重进行测定,用以计算蛋壳、蛋白和蛋黄相对重量。
1.4.3 血清生化指标在饲养试验结束后每个重复随机挑选2只产蛋鸡,每组20只鸡,禁食24 h后从翅静脉抽取10 mL血液,分离血清,-20 ℃保存。血清葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、尿酸(UA)含量与谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性均使用日立7020全自动生化分析仪测定,血清乳酸脱氢酶(LDH)、碱性磷酸酶(AKP)和XOD活性使用试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定。
1.4.4 肝脏抗氧化指标在饲养试验结束后每个重复随机挑选2只产蛋鸡,每组20只鸡,禁食24 h后处死,取肝脏组织样品,-20 ℃保存。肝脏总抗氧化能力(T-AOC)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性、还原型谷胱甘肽(GSH)含量均使用试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)测定。
1.5 数据处理与分析试验数据采用SAS 9.0进行一般线性模型(GLM)分析,不同添加量的钼的作用效果利用正交多项式进行一次和二次回归趋势分析,并以Tukey’s多项检验法进行显著性比较,P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 高钼饲粮对蛋鸡生产性能的影响由表 2可知,饲粮中添加钼可线性降低蛋鸡的产蛋率(P=0.04)。与对照组相比,M100组蛋鸡的产蛋率降低5.62%,料蛋比增加11.98%,破壳蛋率增加168.59%,差异均达到显著水平(P < 0.05)。M10和M20组蛋鸡的产蛋率、平均蛋重、平均日采食量、料蛋比和破壳蛋率与对照组相比均没有显著差异(P>0.05)。
由表 3可知,饲粮中添加钼可线性降低蛋壳厚度(P=0.04),线性降低蛋黄颜色(P=0.01),线性增加蛋壳亮度值(P=0.01),线性降低蛋壳红度值(P=0.04)。与对照组相比,M20和M100组的蛋壳厚度降低8.33%,M100组的蛋黄颜色降低7.63%,差异均达到显著水平(P < 0.05)。此外,M10、M20和M100组的蛋壳亮度值均显著高于对照组(P < 0.05),蛋壳红度值均显著低于对照组(P < 0.05)。
由表 4可知,饲粮中添加钼可线性降低血清中UA含量(P=0.01)。与对照组相比,M100组血清中AST、ALT和AKP活性显著提高(P < 0.05),提升率分别为46.02%、51.99%和15.72%。M100组血清中UA含量显著低于其他各组(P < 0.05)。饲粮中添加低剂量钼可以提高血清XOD活性,但添加高剂量钼则降低血清XOD活性,血清XOD活性呈现二次曲线变化(P=0.01)。与对照组相比,M10和M20组血清中XOD活性提高了85.93%和101.14%(P < 0.05),而M100组降低了46.64%(P < 0.05)。血清中GLU、TC、TG和LDH含量各组之间无显著差异(P>0.05)。
由表 5可知,与对照组相比,M100组肝脏总抗氧化能力、GSH-Px活性显著降低(P < 0.05),GSH和MDA含量显著增加(P < 0.05)。肝脏T-SOD活性并没有受到钼添加量的显著影响(P>0.05)。
本试验发现,饲粮添加10和20 mg/kg钼对蛋鸡的生产性能没有正面影响,且饲粮添加100 mg/kg钼还显著降低了蛋鸡的产蛋性能(产蛋率和饲料转化效率)。目前,国际上尚无家禽钼营养需求量的规定,一般认为其最低需要量为0.2 mg/kg[6],因此,正常情况下,鸡群很少出现钼缺乏症状。朱重伟等[9]报道,在饮水中添加50 mg/L钼能增加肉鸡的增重和采食量。但张元贞[10]研究发现,饲粮中钼添加量超过50 mg/kg时,雏鸡生长受阻。郭荣富等[11]研究发现,在饲粮中添加10和100 mg/kg的钼并不会显著影响雏鸭的生产性能,但添加1 000 mg/kg钼则显著降低雏鸭的日增重。郝贵增等[4]研究发现,饲粮中钼添加量达到2 000 mg/kg以上时雏鸡的生长受到严重抑制,羽毛杂乱,死亡率上升。高钼影响蛋鸡生产性能可能与高钼会增加自由基代谢障碍,导致细胞凋亡,从而影响肝脏、肾功能有关[12-13]。关于钼对禽生产性能影响的研究结果并不一致,这可能与禽的品种、生理阶段以及钼的添加方式有关,而处于产蛋后期的蛋鸡由于长期较高的产蛋性能降低了机体对于应激的抵抗能力,因而可能对高钼的耐受力降低,但有关钼对蛋鸡生产性能影响的研究较少,具体机制还不清楚,有待进一步研究。
3.2 高钼饲粮对蛋鸡蛋品质的影响本研究发现,饲粮中添加100 mg/kg钼显著降低了蛋壳厚度和蛋壳颜色(蛋壳亮度值更高、红度和黄度值更低),显著增加了破壳蛋率。由于钼对蛋品质影响的试验数据缺乏,无法类比。高钼对蛋鸡蛋壳厚度的影响可能与高钼拮抗钙、磷、铜、硒的吸收,导致机体血清和骨骼中钙、磷、铜、硒含量降低,或间接影响骨骼生长发育中所需要的酶活性,从而影响钙磷代谢有关。在绵羊[14]、禽[15]和小鼠[16]上的研究表明,高钼及钼镉暴露能加剧机体钙磷流失,造成体内磷缺乏,从而导致骨钙和血钙水平降低[14-16],而机体钙磷代谢紊乱则会导致蛋壳品质下降。此外,钼还可以通过损伤肝脏和肾脏功能,降低维生素D3转化为其活性形式1, 25-二羟维生素D3[1, 25(OH)2D3]的能力,间接影响钙磷代谢[17]。研究发现,高钼会导致山羊[12]和雏鸡[17]肝细胞和肾细胞凋亡,损伤肝脏和肾脏功能。徐雄卫[18]也发现高钼会造成鸭的心脏、肾脏、睾丸等器官的铜平衡紊乱,从而影响组织和器官的正常生理功能。蛋壳颜色也可以在一定程度反映蛋鸡机体健康和应激状态,本试验发现高钼会导致蛋壳颜色变浅,这也说明了机体处于应激状态。本实验室前期研究发现,同样作为过渡金属的钒也可以导致鸡蛋蛋壳颜色变浅[19-20],而关于钼对蛋壳颜色的影响尚未见文献报道,有待进一步研究。
3.3 高钼饲粮对蛋鸡血清生化指标的影响血清中ALT和AST的活性可以反映肝细胞受损程度。在本试验中,饲粮中添加100 mg/kg的钼后蛋鸡血清中AST和ALT活性显著升高,说明高钼诱导了肝脏损伤。研究发现钼和镉可以诱导麻鸭[21]和山羊[22]血液ALT和AST活性增加。钼的生物学毒性或活性是通过XOD、黄嘌呤氧化还原酶(XOR)和醛氧酶等实现的[1-3],本研究发现,饲粮中添加低剂量(10和20 mg/kg)的钼可以升高血清中XOD的活性,但添加高剂量(100 mg/kg)的钼则降低了血清中XOD的活性,说明钼的生物学毒性可能是通过降低XOD活性来实现的。近年来研究发现,高钼可以导致脂质过氧化,使促凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(Bax)表达量增加,诱导肝细胞和肾细胞凋亡,从而引起肝脏和肾脏功能损伤[13, 17]。UA是嘌呤代谢的终产物,血液和尿中UA的含量过高或过低都是检测代谢紊乱的标识[23]。AKP是一种动物体内广泛分布的非特异性磷酸单酯酶,主要来源于骨骼和肝脏,是反映骨盐沉积情况的重要指标,发生佝偻症时其活性显著升高[24]。已有研究发现高钼可以引起动物体内AKP活性增加[15, 25-27],本研究结果与之一致。
3.4 高钼饲粮对蛋鸡肝脏抗氧化指标的影响本研究发现,饲粮中添加100 mg/kg钼显著降低了蛋鸡肝脏T-AOC和GSH-Px活性,显著增加了肝脏中GSH和MDA含量。GSH-Px是机体广泛存在的一种重要的分解过氧化物的酶,可以特异催化GSH对脂质过氧化物还原反应。有研究表明,随着钼中毒的加深,家禽血浆和组织中GSH-Px和SOD活性显著降低[28],本试验结果与此结果一致。同时,研究还表明高钼可以通过降低硒含量,从而影响含硒的抗氧化酶GSH-Px的活性,这与本研究所得结果一致[15]。MDA是脂质过氧化产物,其含量的高低可反映体内脂质过氧化水平的高低。本研究中,饲粮中添加100 mg/kg钼显著增加了蛋鸡血清中MDA的含量,证明高钼增加了体内脂质过氧化水平,本试验结果与肖杰[29]所得结果一致。但王宏伟等[30]研究发现,饮水中添加不同水平(25、50和100 mg/L)的钼显著提高了鸡血清中SOD、GSH-Px活性和GSH含量,增加了鸡的免疫功能和抗氧化能力。郝贵增等[4]也发现通过饮水添加不同水平(3、6和9 mg/L)钼可以提高肉鸡血清中T-SOD和GSH-Px的活性。不同的试验结果可能与钼的添加量、添加方式以及动物的品种、生理阶段和试验期有关,与上述试验通过饮水添加,而本试验是通过饲粮添加,且最高添加量(100 mg/kg)也高于上述试验的剂量,由此可以说明钼对机体的影响与之添加量和添加方式有关。另外,处于产蛋后期的蛋鸡,由于其长期高产导致其抗应激能力显著下降,对饲粮的应激因素更加敏感[31]。由此可见,高钼可以在一定程度上降低蛋鸡机体抗氧化能力,造成氧化应激,这可能是高钼导致产蛋后期蛋鸡生产性能和蛋品质下降的主要原因。
4 结论在产蛋后期蛋鸡饲粮中添加10和20 mg/kg钼可增加血清中XOD的活性,但对生产性能、蛋品质和肝脏抗氧化能力没有显著影响,不过高钼饲粮(饲粮中钼添加量达到100 mg/kg)会降低蛋鸡的生产性能和蛋品质,这与高钼导致血清中XOD活性和肝脏抗氧化能力降低有关。
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