2. 湖南省畜牧兽医研究所, 长沙 410131;
3. 湖南省家禽安全生产工程技术研究中心, 长沙 410128
2. Hunan Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Changsha 410131, China;
3. Hunan Engineering Research Center of Poultry Production Safety, Changsha 410128, China
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)是一种高需氧脱氢酶，能氧化葡萄糖(GLU)成为葡萄糖酸和过氧化氢[1]，同时消耗大量的氧，在食品、医药工业以及血糖的测定方面广泛应用。我国农业农村部发布的《饲料添加剂品种目录》(2013)中，GOD被列入可用的13种饲用酶制剂之一，可作为抗生素的替代物在生产实际中推广应用[2]。大量研究表明，GOD可以降低肠道pH，促进养分消化吸收、改善肠道形态结构、提高畜禽生长性能、提高机体抗氧化能力等[2-5]。GOD在猪和鸡养殖生产上已有广泛报道，但其在肉鸭尤其地方麻鸭生产上的应用研究目前尚未见研究报道。因此，本试验拟研究饲粮中添加不同水平GOD对1~6周龄临武鸭生长性能、血清生化和抗氧化指标以及肠道形态结构和微生物多样性的影响，为其在临武鸭生产中的推广应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计采用单因子试验设计，选择480羽健康的7日龄临武鸭，随机分为5个组，每组6个重复，每个重复16羽。试验期35 d。
1.2 试验饲粮基础饲粮参照《临武鸭营养需要》(DB43/T 898—2014)配制，主要原料为玉米、豆粕、次粉等，基础饲粮组成及营养水平见表 1。对照组饲喂基础饲粮，试验组(A、B、C、D组)分别在基础饲粮中添加10、20、30、40 g/t GOD。GOD活性为10 000 U/g，试验饲粮均制成颗粒料。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验在湖南省畜牧兽医研究所试验鸭场进行，采用网上饲养，自由饮水和自由采食(计量但不限量)，人工光照，常规免疫。
1.4 样品采集与指标测定 1.4.1 生长性能分别于试验开始和结束时，以重复为单位称取试验鸭空腹初始体重和终末体重；试验期以重复为单位准确记录喂料量和剩料量，计算试验鸭平均日采食量、平均日增重和料重比。
1.4.2 血清生化和抗氧化指标在试验结束时，每个重复随机选取体重相近的试验鸭2只，空腹12 h后，翅下静脉采血5 mL，静置30 min后，3 000 r/min离心15 min，分离血清，-20 ℃保存。使用全自动生化分析仪(URIT-8000，优利特，美国)检测血清中总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)、GLU含量，采用比色法检测血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)含量，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.4.3 肠道微生物菌落PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱分析在试验结束当天，从各重复分别选取2只试验鸭，解剖后用70%的酒精棉球擦拭肠外壁后分别取回肠中段和盲肠，用无菌水冲洗各段肠道并收集洗液到无菌的离心管中。最后将来自同一重复的2只试验鸭的洗液混合。参照周笑犁等[6]方法进行肠道微生物群落总DAN提取、PCR-DGGE及序列分析。
1.4.4 肠道形态结构在步骤1.4.3采样完成后，分离十二指肠、空肠、回肠，剪取十二指肠、空肠和回肠中段2 cm左右，用玻璃棒轻轻挑去其中内容物，并用生理盐水轻轻冲洗干净，再用滤纸吸干残余水分之后，置于10%甲醛磷酸缓冲液中固定。接着将固定的标本经脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→展片→常规苏木精-伊红(HE)染色等处理后，制成石蜡切片。之后用显微镜在40、100倍下随机选择多个非连续性视野观察切片，并在40、100倍下挑选典型视野拍摄成图片，比较各组临武鸭肠绒毛形态结构发育状况，并测定十二指肠、空肠、回肠的绒毛高度、隐窝深度和肠壁厚度，计算绒毛高度/隐窝深度。
1.5 数据处理及统计试验数据先用Excel 2010进行整理和初步计算，再采用SPSS 19.0统计软件中ANOVA程序进行方差分析，对差异显著者进行Duncan氏法多重比较，各组试验结果均用“平均值±标准差”表示。对组间P < 0.05的指标作回归分析，对模型P < 0.05相关敏感指标建立线性或二次曲线回归模型，并通过求导得出回归方程中饲粮GOD适宜添加水平。
PCR-DGGE指纹图谱用Quantity One(Bio-Rad Laboratories，CA公司，美国)软件进行分析。
2 结果与分析 2.1 GOD对1~6周龄临武鸭生长性能的影响由表 2可知，各组试验鸭的末重、平均日增重、平均日采食量及料重比均无显著差异(P>0.05)。试验结果表明，在本试验条件下，饲粮中添加GOD对1~6周龄临武鸭生长性能无显著影响。
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表 2 GOD对1~6周龄临武鸭生长性能的影响 Table 2 Effects of GOD on growth performance of 1 to 6-week-old Linwu ducks |
由表 3可知，血清生化指标方面，各组试验鸭的血清TP、ALB含量无显著差异(P>0.05)。B和C组的血清GLU含量显著高于对照组(P < 0.05)，而与A和D组差异不显著(P>0.05)。A、B、C和D组的血清UN含量均显著低于对照组(P < 0.05)。
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表 3 GOD对1~6周龄临武鸭对血清生化和抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of GOD on serum biochemical and antioxidant indexes of 1 to 6-week-old Linwu ducks |
血清抗氧化指标方面，各组试验鸭的血清SOD、GSH-Px活性无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，A、B和C组的血清GSH含量有增加趋势，但差异不显著(P>0.05)；D组的血清GSH含量显著高于其他各组(P < 0.05)。C组的血清MDA含量显著低于其他各组(P < 0.05)，但A、B和D组的血清MDA含量与对照组差异不显著(P>0.05)。
由表 4可知，综合考虑P值和决定系数(R2)，通过非线性回归模型分别建立血清GLU、UN含量与饲粮GOD添加水平之间的二次回归方程，根据二次回归方程估测，1~6周龄临武鸭获得最高血清GLU含量时饲粮GOD适宜添加水平为24.04 g/t，获得最低血清UN含量时饲粮GOD适宜添加水平为29.40 g/t。
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表 4 根据二次回归方程估测1~6周龄临武鸭饲粮GOD适宜添加水平 Table 4 Dietary GOD suitable supplement level of 1 to 6-week-old Linwu ducks estimated based on quadratic regression equation |
由表 5可知，各组试验鸭的十二指肠绒毛高度、隐窝深度及绒毛高度/隐窝深度没有显著差异(P>0.05)；B和D组的十二指肠肠壁厚度显著低于A组和对照组(P < 0.05)，与C组差异不显著(P>0.05)。各组试验鸭的空肠绒毛高度、隐窝深度和肠壁厚度没有显著差异(P>0.05)；C组的空肠绒毛高度/隐窝深度显著高于D组(P < 0.05)，与其他各组差异不显著(P>0.05)。各组试验鸭的回肠隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度没有显著差异(P>0.05)；A组的回肠绒毛高度显著高于C组(P < 0.05)，与B、D组差异不显著(P>0.05)；B、C、D组的回肠肠壁厚度显著低于A组和对照组(P < 0.05)。
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表 5 GOD对1~6周龄临武鸭小肠形态结构的影响 Table 5 Effects of GOD on small intestinal morphology of 1 to 6-week-old Linwu ducks |
采用Quantity-One软件将原DGGE胶图转换成条带分布图(图 1)，位于同一水平线的为相同物种，该图左右两侧的数字为经分析后该板胶共有的条带数(也可认为是该板胶上所有样本包含的物种数)。图下部的数字代表样本编号。最下面一行是在以第1个样本为基准的前提下，其余样本与第1个样本的相似性，后面的戴斯相似性系数是每2个样本之间的相似度情况。图 1显示的是临武鸭回肠和盲肠内容物微生物DGGE胶图物种条带分析图谱，条带越多表示肠道内容物微生物越丰富，从图中可以看出，各组样品中肠道内容物微生物丰富度有一定差异。
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首行1、2、3、4、5……18、19、20分别表示组号为1-1、1-2、1-3、1-4、2-1……5-2、5-3、5-4的样品。最末行百分比数值表示以第1个样本为基准(100%)，其余样本与第1个样本的相似性；位于同一水平线的为相同物种。 The first lane 1, 2, 3, 4, 5……18, 19, 20 belong to the samples of groups 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 2-1……5-2, 5-3, 5-4 respectively. The percentage value of the last line represents the similarity between the first sample and the rest samples, based on the first sample (100%); the same species are located at the same horizontal line. 图 1 1~6周龄临武鸭回肠和盲肠内容物微生物DGGE物种条带分析图谱 Fig. 1 DGGE species strip analysis map of microorganism in ileum and cecum contents of 1 to 6 week-old Linwu ducks |
由表 6可知，各组试验鸭的回肠食糜微生物均匀度指数、香农指数、辛普森指数无显著差异(P>0.05)；A和B组的回肠食糜微生物丰富度指数显著高于对照组(P < 0.05)。A组的盲肠食糜微生物均匀度指数、香农指数和辛普森指数均显著高于对照组(P < 0.05)；C组的盲肠食糜微生物丰富度指数显著高于对照组(P < 0.05)；与对照组相比，A、B和D组盲肠食糜微生物丰富度指数有增加趋势，但差异不显著(P>0.05)。回归分析表明，回肠食糜微生物丰富度指数与饲粮GOD添加水平之间存在先升高后降低的二次回归方程(Y=-0.043X2+1.693 9X+20.293，P=0.025，R2=0.812 5)，对该模型求导得出基础饲粮中添加19.70 g/t GOD时，试验鸭获得最高回肠食糜微生物丰富度指数。
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表 6 GOD对1~6周龄临武鸭肠道微生物多样性指数的影响 Table 6 Effects of GOD on intestinal microbial diversity index of 1 to 6-week-old Linwu ducks |
临武鸭属中小型麻鸭，生长速度较慢，在饲粮营养水平能满足其基本需要的前提下，非营养性添加剂对其生长性能的促进作用有限。GOD在动物体内可以利用GLU为底物通过酶解反应产生葡萄糖酸和过氧化氢，可降低动物胃内pH，能够有效抑制有害菌，促进有益菌的生长，改善动物肠道健康，提高饲粮营养物质消化吸收，改善动物生长性能[1-4]。杨久仙等[2]研究表明，断奶仔猪饲粮中添加0.1%~0.2%的GOD能显著降低胃肠道内食糜pH，改善仔猪肠道形态结构，促进饲粮营养物质消化率，提高断奶仔猪平均日增重和饲料转化率；吴端钦等[7]研究了GOD对仔猪生产长能的影响，结果表明，饲粮中添加30 mg/kg GOD在一定程度上改善了仔猪生长性能。贡筱等[8]研究报道，在复合酶的基础上添加GOD可进一步改善肉鸡生长性能。但在本试验条件下，饲粮中添加GOD对1~6周龄临武鸭生长性能无显著影响，这与侯振平等[9]研究结果基本一致。侯振平等[9]研究表明，与对照组相比，在饲粮中添加GOD的基础上补充复合酶对樱桃谷肉鸭生长性能无显著影响。推测GOD的作用主要体现在作为抗氧化剂参与体内氧化还原反应，专一催化β-D-GLU产生葡萄糖酸和过氧化氢[10]，使肠道形成酸性厌氧环境，抑制霉菌、大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌的生长和繁殖，但由于禽类肠道较短，其中的分子氧或原子氧含量或β-D-GLU含量较低，不足以产生达到质变的催化反应，从而对肉鸭生长表现出促进作用。
3.2 GOD对1~6周龄临武鸭血清生化和抗氧化指标的影响动物机体血液中的许多生化参数受年龄、发育阶段、饲粮营养水平和内分泌状况等的影响，可作为反映机体生理健康状况的指标[11]。血清中GLU主要参与糖代谢，是动物机体各组织细胞活动所需能量的主要来源，GLU含量的高低直接反映了动物对营养物质的吸收情况[12]；本试验中，临武鸭可能对于GLU含量升高具有一定的调节和耐受能力，说明GOD可加快碳水化合物代谢的同时对于生长性能和其他血清生化指标未有负面影响。血清TP和ALB含量在一定程度上反映了机体健康状况[13]；血液中的尿素是通过鸟氨酸循环合成，是机体蛋白质代谢的终产物之一，也是反映蛋白质代谢的重要指标，UN可作为机体蛋白质沉积和衡量机体蛋白质分解代谢的指标[14]。在本试验中，GOD虽然对试验鸭血清TP和ALB含量无显著影响，但饲粮中添加20和30 g/t GOD时，血清GLU含量要显著高于对照组；饲粮中添加GOD时显著降低了血清UN含量。以上结果表明，GOD可促进除β-D-GLU之外的糖元的分解和氮的沉积，提高蛋白质的合成，改善1~6周龄临武鸭的机体代谢能力，有利于临武鸭的正常生长发育。
血清GSH、GSH-Px、SOD活性及MDA含量可作为反映动物机体抗氧化能力的指标。MDA是氧自由基引起的脂质过氧化反应所产生的脂质过氧化物在机体内代谢的终产物，能够间接地反映机体内氧自由基代谢的状况、机体组织细胞受自由基攻击的程度及脂质过氧化程度[15-16]。SOD和GSH-Px在生物抗氧化方面具有重要作用，SOD可以清除体内自由基，防止细胞和组织受到氧化损伤等[17]。穆淑琴等[18]研究表明，在饲粮中添加400 g/t的GOD可有效改善仔猪血液抗氧化能力，缓解仔猪的肝脏损伤；宋海彬等[19]研究表明，GOD能够不同程度地提高肉鸡血清SOD活性，降低血清MDA含量，增强肉鸡抗氧化能力。本试验中，GOD对1~6周龄临武鸭血清SOD和GSH-Px活性无显著影响；但随着饲粮GOD添加水平的增加，试验鸭血清GSH含量呈上升趋势，饲粮中添加40 g/t的GOD时，试验鸭血清GSH含量显著高于对照组；饲粮中添加30 g/t的GOD时，试验鸭血清MDA含量显著低于对照组。这与上述研究结果基本一致，证实了GOD在动物体内能通过消耗分子氧或原子氧氧化GLU，表现出增强机体抗氧化能力的作用。
3.3 GOD对1~6周龄临武鸭小肠形态结构的影响小肠是动物体内重要的消化器官，是营养物质在体内进行消化吸收最多的场所，对营养物质的消化、吸收和转运有着重要作用。正常的肠道结构可以促进营养物质的消化吸收[20]，小肠绒毛高度和隐窝深度与肠道的消化吸收功能密切相关，小肠绒毛变短、隐窝变深说明绒毛萎缩，吸收能力下降，绒毛高度/隐窝深度可以反映小肠的功能状态，绒毛高度/隐窝深度越大说明肠上皮表面积越大，黏膜完整性越好，肠道的消化吸收能力就会越强[21]。GOD催化GLU产生的葡萄糖酸经发酵后产生短链脂肪酸，这些短链脂肪酸不仅能显著提高肠道绒毛高度、降低隐窝深度、增加黏膜厚度和扩大绒毛面积，还能改善肠道对氨基酸的吸收能力[22]。胡秀华[23]研究表明，在饲粮中添加酶制剂后，较明显地改善了肉鸡的生长性能，而肉鸡肠壁厚度都有不同程度地降低，认为外源酶的添加对肉鸡生长性能和养分消化率的改善可能是通过降低肠壁厚度、增加小肠表面积和小肠消化酶活性而实现的。在本试验中，B和D组的十二指肠壁厚度显著低于A组和对照组，C组的空肠绒毛高度/隐窝深度显著高于D组，A组的回肠绒毛高度显著高于C组，B、C、D组的回肠肠壁厚度显著低于A组和对照组。这提示GOD有可能促进了小肠的吸收能力或增强了肠壁通透性，更有利于营养物质吸收。GOD对于3个肠段绒毛形态结构发育的影响规律不尽一致，其作用机理有待进一步研究。
3.4 GOD对1~6周龄临武鸭肠道微生物多样性的影响肠道微生物区系的多样性是反映宿主健康以及微生态系统稳定性的重要信号[24]。微生物多样性指标是由族群中的种类数与个体数所构成，可反映群聚的特性及功能。微生物物种的多样性与群聚的稳定程度有关，一般而言均匀的分布表示微生物多样性较高[25]。常用到的表示微生物多样性的指标有[26]：种的数目或丰富度指数、香农指数、辛普森指数及均匀度指数。丰富度指数指的是一个群落或生境中物种数目的多寡，这个指标更客观的反映了多样性指标；香农指数数值越大表示生态系统中物种越丰富，也越趋近于稳定；辛普森指数用以表示环境中有无优势物种出现，数值介于0~1，数值越小则表示有明显优势物种出现；均匀度指数指一个群落环境中全部物种个体数目的分配状况，反映的是各物种数目分配的均匀程度，当数值越接近于1，优势种越不明显。本试验使用PCR-DGGE技术对临武鸭回肠和盲肠微生物多样性进行了分析，试验结果表明，GOD对临武鸭回肠食糜微生物均匀度指数、香农指数和辛普森指数无显著影响，但GOD对回肠食糜微生物丰富度指数有显著影响，且二者间存在二次曲线相关性，说明GOD可以改善回肠微生物多样性；饲粮中添加10 g/t GOD时，临武鸭盲肠微生物均匀度指数、香农指数及辛普森指数均显著高于对照组；饲粮中添加30 g/t GOD时，临武鸭盲肠微生物丰富度指数显著高于对照组。这表明GOD能够提高盲肠微生物丰度及多样性，可能是GOD进入消化道后，可通过氧化GLU分子，促使肠道形成低pH的厌氧环境，能够为肠道有益菌的定植提供良好条件，增强了有益菌群的定植和发酵。
4 结论① 在1~6周龄临武鸭饲粮中适量添加GOD可以改善血清生化指标，增强机体抗氧化能力，并不同程度地改善回肠和盲肠微生物多样性。
② 根据二次回归模型估测，获得最高血清GLU含量时饲粮GOD适宜添加水平为24.04 g/t，获得最低血清UN含量时饲粮GOD适宜添加水平为29.40 g/t，获得最高回肠食糜微生物丰富度指数时饲粮GOD适宜添加水平为19.70 g/t。
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