试验所用西伯利亚鲟购自于北京市水产科学研究所房山基地。

根据NCBI GenBank中已知其他物种的C型PEPCK(PEPCK-C)、M型PEPCK(PEPCK-M)、FBPase和G6Pase氨基酸序列寻找相应的保守片段，采用CodeHop原理^[20]设计简并引物克隆西伯利亚鲟相应基因的保守片段。根据扩增到的保守片段，使用软件Primer 5.0设计用于3′-和5′-RACE扩增的特异性引物。所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。本试验中所用到的引物序列及相应的退火温度(Tm)见表1。

解剖西伯利亚鲟，取新鲜肝脏，经液氮研磨后用RNAiso Plus(TaKaRa，大连)抽提总RNA。总RNA用变性琼脂糖凝胶电泳显示28S和18S条带，验证所提取的总RNA的完整性。采用PowerWave^TM XS2全波长酶标仪(BioTek，美国)检测其在260 nm处的吸光值与在280 nm处的吸光值的比值(A260/A280)，并对所提取的总RNA进行定量。

cDNA第1链的合成采用PrimeScript Ⅱ 1^st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大连)，每个反转录反应使用约1.0 μg肝脏总RNA，操作步骤参照说明书进行。分别采用各基因的简并引物进行保守片段聚合酶链式反应(PCR)扩增，PCR反应体系包含合成的cDNA第1链1 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、TaKaRa Ex Taq 0.625 U、dNTP 200 μmol/L、上游引物0.4 μmol/L、下游引物0.4 μmol/L，加灭菌水至总体积25 μL。PCR扩增条件为：94 ℃，30 s；Tm，30 s；72 ℃，1 min；共35个循环。PCR产物经电泳后，在紫外灯下切取与目标序列大小一致的片段，使用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2.0(TaKaRa，大连)对扩增片段进行纯化。纯化产物与pMD19-T Vctor(TaKaRa，大连)连接，转化入大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细胞(TaKaRa，大连)中，经蓝白斑筛选后，对有插入片段的阳性克隆进行测序(北京华大基因服务公司)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 本试验中所用到的引物序列及相应的退火温度Table 1 Primer sequence and Tm used in this experiment 基因 Genes 引物 Primer 序列 Sequence (5′—3′) 退火温度 Tm/℃ 葡萄糖-6-磷酸酶 G6Pase 简并引物 Degenerate primers CAGTTCCCCATGACCTGYGARACNGG AGGGGGTGGTGTCCADRTGNACCCA 55.8 3′-RACE Inner primer TCTTCCTGGCTGCCCACTTC 62.3 3′-RACE Outer primer TCACCTCCATTCTGACCATT 54.6 5′-RACE primer ACCTCTTGGCTTTCTCCAGCGTCCA 71.3 果糖-1,6-二磷酸酶 FBPase 简并引物 Degenerate primers AACGTGACCGGCGAYSARGTNAA GGCCATGCCGCCNGCYTKYTC 56.6 3′-RACE Inner primer TCCTTCACCACCTGTGCTCT 57.5 3′-RACE Outer primer CCCTTATGGTGGGAGGTATG 56.8 5′-RACE primer ACATACCTCCCACCATAAGGGGCACTG 71.1 M型PEPCK PEPCK-M 简并引物 Degenerate primers CGTGGGCGACGACATHGCNTGGATG CGAAGCCGGGCCANAVRAA 59.2 3′-RACE Inner primer AGAGAGCCAAGCAAGAGAGGTT 59.3 3′-RACE Outer primer ATCGTCTCTTTCGGGAGTGGGT 63.8 5′-RACE primer GAAGATGGTGTTGCTCTGGACCGTCAG 71.1 C型PEPCK PEPCK-C 简并引物 Degenerate primers TCCTTCGGCTCCGGNTAYGGNGG TCATGGCCAGGTTGGTYTTNCCRCA 57.0 3′-RACE Inner primer GGTGGCTCACATCCCAGACAAG 64.0 3′-RACE Outer primer GGAAGAAGTACATCGCTGCTGC 61.7 5′-RACE primer GCCGTTCTCTGGATTGATGGCTCTCA 71.5

表1 本试验中所用到的引物序列及相应的退火温度Table 1 Primer sequence and Tm used in this experiment

3′-RACE扩增采用3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0(TaKaRa，大连)，操作步骤参照说明书进行。采用1.0 μg肝脏总RNA和3′-RACE Adaptor合成cDNA第1链，经过2轮嵌套PCR反应扩增各基因的3′末端。首先以合成的cDNA第1链为模板，分别以试剂盒提供的3′-RACE Outer primer和所设计的基因特异性3′-RACE Outer primer为引物进行第1轮PCR扩增，反应条件为：94 ℃，30 s；Tm，30 s；72 ℃，1.5 min；共35个循环。再以100倍稀释的Outer PCR产物为模板，分别以试剂盒提供的3′-RACE Inner primer和所设计的基因特异性3′-RACE Inner primer为引物进行第2轮PCR扩增，反应条件为：94 ℃，30 s；Tm，30 s；72 ℃，1.5 min；共30个循环。对Inner PCR产物进行电泳、切胶纯化、连接、转化和测序。

5′-RACE扩增采用SMART TM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美国)，操作步骤参照说明书进行。采用1.0 μg肝脏总RNA、5′-CDS Primer A和SMART Ⅱ A Oligo合成cDNA第1链，以Advantage 2 PCR Enzyme System(Clontech，美国)、UPM引物和所设计的基因特异性5′-RACE引物进行PCR扩增。扩增采用Touch-Down PCR程序：94 ℃，30 s；72 ℃，2.5 min；5个循环；94 ℃，30 s；70 ℃，30 s；72 ℃，2 min；5个循环；94 ℃，30 s；68 ℃，30 s；72 ℃，2 min；30个循环。对PCR产物进行电泳、切胶纯化、连接、转化和测序。

将测序所获得的核心片段、3′和5′区域拼接即获得了糖异生关键酶各基因的全长序列。将拼接结果与NCBI GenBank中的已知序列作blastx同源性分析，用DNAMAN(VERSION 5.2.2)软件分析所得cDNA序列及开放阅读框，预测编码氨基酸序列。根据GenBank中已报道的糖异生关键酶各基因的蛋白质序列用Lasergene 7.0程序中MegAlign进行多序列比对和一致性数值计算。采用MEGA 5.1软件，选择邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统进化树^[21]。

西伯利亚鲟PEPCK-C全长cDNA序列及推测编码的氨基酸序列见图1。cDNA全长2 598 bp，包括174 bp的5′非翻译区、1 869 bp的开放阅读框及555 bp的3′非翻译区；开放阅读框编码1个由622个氨基酸组成的蛋白质，预测其分子质量为69.62 ku，等电点为5.94。经过blastx比对发现其与其他物种PEPCK-C具有很高的相似性，具有与草酰乙酸结合的PEPCK特有结构域以及与三磷酸鸟苷(GTP)三磷酸链结合的激酶1和激酶2基序。将该序列提交至GenBank获得登录号为JQ995143。

图1

Fig. 1

图1 西伯利亚鲟PEPCK-C全长cDNA序列和预测的氨基酸序列(GenBank登录号JQ995143) Fig.1 PEPCK-C full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Siberian sturgeon

西伯利亚鲟PEPCK-M全长cDNA序列及推测编码的氨基酸序列见图2。cDNA全长3 277 bp，包括279 bp的5′非翻译区、1 935 bp的开放阅读框及1 063 bp的3′非翻译区；开放阅读框编码1个由644个氨基酸组成的蛋白质，预测其分子质量为71.11 ku，等电点为8.23。经过blastx比对发现其与其他物种PEPCK-M具有很高的相似性，具有与草酰乙酸结合的PEPCK特有结构域以及与GTP三磷酸链结合的激酶1和激酶2基序。将该序列提交至GenBank获得登录号为JQ995142。

图2

Fig. 2

图2 西伯利亚鲟PEPCK-M全长cDNA序列和预测的氨基酸序列(GenBank登录号JQ995142) Fig.2 PEPCK-M full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Siberian sturgeon

西伯利亚鲟FBPase全长cDNA序列及推测编码的氨基酸序列见图3。cDNA全长1 372 bp，包括71 bp的5′非翻译区、1 017 bp的开放阅读框及284 bp的3′非翻译区；开放阅读框编码1个由338个氨基酸组成的蛋白质，预测其分子质量为36.60 ku，等电点为7.13。经过blastx比对发现其与其他物种FBPase具有很高的相似性。将该序列提交至GenBank获得登录号为JF834908。

图3

Fig. 3

图3 西伯利亚鲟FBPase全长cDNA序列和预测的氨基酸序列(GenBank登录号JF834908) Fig.3 FBPase full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Siberian sturgeon

西伯利亚鲟G6Pase全长cDNA序列及推测编码的氨基酸序列见图4。cDNA全长2 625 bp，包括69 bp的5′非翻译区、1 080 bp的开放阅读框及1 476 bp的3′非翻译区；开放阅读框编码1个由359个氨基酸组成的蛋白质，预测其分子质量为40.62 ku，等电点为8.69。经过blastx比对发现其与其他物种G6Pase具有很高的相似性，具有磷酸酶家族保守结构域PAP2。将该序列提交至GenBank获得登录号为JF834907。

将西伯利亚鲟PEPCK-C氨基酸序列与其他物种的PEPCK-C氨基酸序列进行同源性比对，结果见图5。分析表明，西伯利亚鲟PEPCK-C氨基酸序列与大西洋鲑同源性最高，为80.5%，与斑马鱼(Danio rerio)、军曹鱼(Rachycentron canadum)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、鸡(Gallus gallus)和鸭嘴兽(Ornithorhynchus anatinus)的同源性分别为78.3%、78.0%、77.5%、78.0%、78.1%和77.3%。

将西伯利亚鲟PEPCK-M氨基酸序列与其他物种的PEPCK-M氨基酸序列进行同源性比对，结果见图6。分析表明，西伯利亚鲟PEPCK-M氨基酸序列与斑马鱼同源性最高，为78.3%，与大西洋鲑、军曹鱼、人、小鼠、鸡和鸭嘴兽的同源性分别为74.2%、72.8%、72.7%、71.3%、64.6%和72.8%。

图4

Fig. 4

图4 西伯利亚鲟G6Pase全长cDNA序列和推测的氨基酸序列(GenBank登录号JF834907) Fig.4 G6Pase full length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of Siberian sturgeon

将西伯利亚鲟FBPase氨基酸序列与其他物种的FBPase氨基酸序列进行同源性比对，结果见图7。分析表明，西伯利亚鲟FBPase氨基酸序列与裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)同源性最高，为88.7%，与人、小鼠、鸡、爪蟾(Xenopus tropicalis)、银鲫(Carassius gibelio)和胡瓜鱼(Osmerus mordax)的同源性分别为79.3%、73.4%、74.6%、81.7%、87.2%和85.5%。

将西伯利亚鲟G6Pase氨基酸序列与其他物种的G6Pase氨基酸序列进行同源性比对，结果见图8。分析表明，西伯利亚鲟G6Pase氨基酸序列与翘嘴红鲌同源性最高，为72.7%，与人、小鼠、猫(Felis catus)、猪(Sus scrofa)、火鸡(Meleagris gallopavo)、绿变色蜥(Anolis carolinensis)、胡瓜鱼和花鲈(Lateolabrax japonicus)的同源性分别为67.8%、67.2%、68.1%、68.6%、70.4%、72.3%、71.1%和71.8%。

图5

Fig. 5

图5 西伯利亚鲟与其他物种PEPCK-C氨基酸序列比对结果 Fig.5 Alignment results of PEPCK-C amino acid sequences between Acipenser baerii and other species

图6

Fig. 6

图6 西伯利亚鲟与其他物种PEPCK-M氨基酸序列比对结果 Fig.6 Alignment results of PEPCK-M amino acid sequences between Acipenser baerii and other species

比对所用到的物种和GenBank登录号包括：小鼠(BAA07678)、人(AAA35817)、鸡(XP_425039)、爪蜍(AAH61270)、银鲫(ADD91325)、裸盖鱼(ACQ58743)和胡瓜鱼(ACO09770)。“.”表示与顶行的西伯利亚鲟氨基酸序列相同的位点。

Used species with GenBank accession No. for alignment as follows: Mus musculus, BAA07678；Homo sapiens, AAA35817; Gallus gallus, XP_425039; Xenopus (Silurana) tropicalis, AAH61270; Carassius gibelio, ADD91325; Anoplopoma fimbria, ACQ58743; Osmerus mordax, ACO09770. Sites with an amino acid identical to that on the top line (Acipenser baerii) are indicated with a dot.

图8

Fig. 8

图8 西伯利亚鲟与其他物种G6Pase氨基酸序列比对结果 Fig.8 Alignment results of G6Pase amino acid sequences between Acipenser baerii and other species

PEPCK氨基酸序列系统进化树结果见图9。如图所示，西伯利亚鲟PEPCK-C与其他鱼类的PEPCK-C以bootstrap值为73的支持度形成了一个分支，再以bootstrap值为100的支持度与其他陆生脊椎动物的PEPCK-C合并为一个PEPCK-C分支；西伯利亚鲟PEPCK-M与其他鱼类的PEPCK-M以bootstrap值为95的支持度形成了一个分支， 再以bootstrap值为80的支持度与PEPCK-C分支合并；哺乳动物的PEPCK-M单独形成一个分支。

图9

Fig. 9

图9 西伯利亚鲟和其他物种PEPCK氨基酸序列系统进化树聚类分析 Fig.9 Cluster analysis of phylogenetic tree of PEPCK amino acid sequence between Acipenser baerii and other species

FBPase氨基酸序列系统进化树结果见图10。如图所示，西伯利亚鲟FBPase以bootstrap值为62的支持度与裸盖鱼和胡瓜鱼合并为一支，然后与银鲫和斑点叉尾 (Ictalurus punctatus)合并为鱼类分支，再与爪蟾合并为一支；乌梢蛇(Zaocys dhumnades)与鸡合并后与其他哺乳动物合并为另外一支。

G6Pase氨基酸序列系统进化树结果见图11。如图所示，西伯利亚鲟G6Pase以bootstrap值为99的支持度与其他鱼类合并成为一个分支；绿变色蜥和火鸡合并后，与哺乳动物共同形成另一个分支。