2. 青岛市畜牧兽医研究所, 青岛 266100
2. Qingdao Research Institute of Husbandry and Veterinary, Qingdao 266100, China
饲粮中添加抗生素能够促进动物的生长、预防动物疾病、提高畜禽产品的产量，但是抗生素长期使用所产生的耐药性、药物残留、以及对环境的污染问题，已经受到越来越多的关注，微生态制剂(probiotics)是一种无公害添加剂，以其无毒副作用、无耐药性、无残留等特点成为理想的抗生素代替品[1]。微生态制剂是一种可调整动物机体微生态平衡的活菌制剂[2]，通过补充肠道的正常菌群，使得原籍菌数量占得优势，并通过竞争性排斥抑制需氧性病菌的生长繁殖，发酵产生大量的乳酸、乙酸，降低肠道里的pH，使得致病菌难以在肠道内生存，而且有益菌在肠道内代谢可以产生各种氨基酸、维生素等能被机体吸收和利用。此外，微生态制剂还可以刺激肠道黏膜中淋巴细胞的转化，继而产生细胞免疫和体液免疫，增强机体的免疫力[3]。国内外有关微生态制剂的应用，在家禽、猪、反刍动物以及水产动物中较多。元娜等[4]报道，饲粮中添加适量含有活性微生物、孢性活性生物体的微生态制剂可显著提高蛋种鸡的产蛋率、受精率和受精蛋孵化率，显著降低料蛋比、破蛋率，并显著提高饲粮的表观营养物质吸收率。程婷婷等[5]报道，肉鸡饮水中添加主要包括嗜酸杆菌、植物乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌等优质定植菌株的微生态制剂，能够显著提高肉鸡出栏重，显著降低料重比。邓露芳[6]通过试验证明，纳豆芽孢杆菌具有显著提高奶牛产奶量的作用，并存在提高饲料转化效率、提高牛奶中乳蛋白和乳糖产量、改善牛奶品质的趋势。但是目前对微生态制剂的研究多是将1种或2种菌种添加到饲粮中研究其对动物的影响，而对多种菌种复合后在动物上的研究较少，多种乳酸杆菌复合后在蛋鸡上的应用研究更少。为此，本试验将多种乳酸杆菌制剂混合，旨在通过研究饲粮中添加不同剂量复合乳酸杆菌制剂对蛋种鸡产蛋性能、肠道菌群数量、营养物质表观消化率和免疫机能的影响，为其在蛋种鸡生产中的应用提供理论依据。
试验微生态制剂选用乳酸杆菌菌种，所用乳酸杆菌菌种由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供。将乳酸杆菌含量均为2×1011 CFU/g的干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum P-8)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum F-6)3个菌种按照1∶ 1∶ 1混合，然后稀释100倍制成复合乳酸杆菌制剂。
试验采用单因子完全随机试验设计，选择170日龄海兰褐蛋种鸡288只，随机分为4组，每组6个重复，每个重复12只鸡。
参照NRC(1994)产蛋种鸡营养需要配制基础饲粮，其组成及营养水平见表1。对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂在基础饲粮中分别添加0.05%、0.10%和0.20%复合乳酸杆菌制剂的试验饲粮。
试验蛋种鸡采取3层阶梯式鸡笼饲养，采用人工光照与自然光照相结合的方法，每天光照10 h，机械通风加自然通风，自由采食，自由饮水，按免疫程序正常接种免疫，定期消毒。每日08:30、16:00 2次喂料，每周统计耗料量。每日08:00、13:30 2次捡蛋，捡蛋后分别进行记数、标记、称重、存放，同时计算每日的产蛋率、破损率。监测鸡群健康状况，记录死淘鸡数及死淘原因。
每天按重复计算蛋种鸡的产蛋数及产蛋重，饲养试验结束后统计每日的平均蛋重、产蛋率、料蛋比。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % |
平均蛋重(g)=平均每日总蛋重/总蛋数；
产蛋率(%)=(平均每日总蛋数/鸡数)×100；
平均日采食量 ＝平均每日消耗饲粮总量/鸡数；
日均产蛋重 ＝平均每日总蛋重/鸡数；
料蛋比＝平均日采食量/日均产蛋重。
采用内源指示剂法测定粗蛋白质、钙和磷表观消化率。指示剂用盐酸不溶灰分(GB/T 23742—2009)。粗蛋白质含量测定采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)，钙含量测定采用高锰酸钾滴定法(GB/T 6436—2002)，磷含量测定采用钼黄比色法(GB/T 6437—2002)。
营养物质表观消化率(%)= 100- [100×(b×c)/(a×d)]。
式中：a为饲粮中的某营养物质含量；b为粪中的某营养物质含量；c为饲粮中的酸不溶灰分含量；d为粪中的酸不溶灰分含量。
试验结束时，每重复选取1只体重接近平均体重的鸡，颈静脉放血法处死。打开腹腔，结扎盲肠2端并剪下。采用倾注平板法对盲肠中大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)计数。大肠杆菌利用麦康凯培养基计数，乳酸菌利用乳酸细菌培养基(MRS培养基)计数，双歧杆菌利用TPY琼脂培养基计数，产气荚膜梭菌利用胰 -亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂基础计数。计算公式如下：
每克盲肠内容物菌落数=lg(菌落数×稀释倍数×每次稀释取样体积)/(接种用样品体积×样品质量)。
抗体水平检测：试验结束时每重复选取1只鸡，颈静脉或翅下采血，3 000 r/min离心5 min并分离血清，参照《家禽传染病试验指导》[7]的方法测定禽流感和鸡新城疫血凝抑制效价。
免疫器官重量和指数的测定：在肠道指标测定的同时，解剖后分离胸腺、脾脏、法氏囊，用滤纸吸去水分后，用天平称重。
免疫器官指数(%)=(免疫器官重量/体重)×100。
试验数据采用Excel进行初步处理后用SPSS 17.0软件进行统计，用单因子方差(one-way ANOVA)分析进行差异显著性检验，多重比较采用最小显著差数法(LSD)，结果以平均值±标准差表示，P<0.05和P<0.01分别为差异显著和极显著水平。
由表2可知，各试验组蛋种鸡平均日采食量与对照组未呈现显著性差异(P>0.05)。试验组蛋种鸡料蛋比均在一定程度上低于对照组，分别降低了2.68%、1.79%和3.57%，但是与对照组也差异不显著(P>0.05)。饲粮添加复合乳酸杆菌制剂可显著影响蛋种鸡的产蛋率(P<0.05)，其中0.05%乳酸杆菌添加组蛋种鸡产蛋率显著高于对照组(P<0.05)，0.10%乳酸杆菌添加组和0.20%乳酸杆菌添加组蛋种鸡产蛋率与对照组差异不显著(P>0.05)，各试验组之间差异均不显著(P>0.05)。复合乳酸杆菌制剂的添加对蛋种鸡平均蛋重没有显著影响(P>0.05)。日均产蛋重各组之间也未见显著差异(P>0.05)，但试验组均在一定程度上高于对照组，分别提高了1.21、0.86和1.71 g/(只·d)。
由表3可知，饲粮添加复合乳酸杆菌制剂可显著影响蛋种鸡对粗蛋白质的表观消化率(P<0.05)，各试验组粗蛋白质的表观消化率均显著高于对照组(P<0.05)，但3个试验组之间差异不显著(P>0.05)，表观消化率最高的为0.05%乳酸杆菌添加组。试验组蛋种鸡对钙和磷的表观消化率与对照组均差异不显著(P>0.05)。
由表4可知，与对照组相比，试验组蛋种鸡的新城疫抗体效价均有所提高，分别提高了6.12%、8.08%、1.96%，但是均与对照组差异不显著(P>0.05)。0.05%乳酸杆菌添加组蛋种鸡的禽流感抗体效价显著高于对照组(P<0.05)，0.10%乳酸杆菌添加组、0.20%乳酸杆菌添加组与对照组和0.05%乳酸杆菌添加组均差异不显著(P>0.05)，试验组比对照组分别提高了13.23%、9.14%和11.46%。
饲粮添加复合乳酸杆菌制剂可显著影响蛋种鸡的胸腺指数(P<0.05)，其中0.05%乳酸杆菌添加组与对照组差异不显著(P>0.05)，0.10%乳酸杆菌添加组和0.20%乳酸杆菌添加组的胸腺指数显著高于对照组(P<0.05)。对照组与试验组蛋种鸡的脾脏指数差异不显著(P>0.05)，但均有所提高，分别比对照组提高了8.96%、4.48%和6.72%。法氏囊指数方面，对照组显著低于0.10%乳酸杆菌添加组(P<0.05)，但与0.05%乳酸杆菌添加组和0.20%乳酸杆菌添加组差异不显著(P>0.05)，试验组内，0.05%乳酸杆菌添加组与0.10%乳酸杆菌添加组和0.20%乳酸杆菌添加组差异不显著(P>0.05)，0.10%乳酸杆菌添加组显著高于0.20%乳酸杆菌添加组(P<0.05)。
| 表2 复合乳酸杆菌制剂对蛋种鸡产蛋性能的影响Table 2 Effects of compound Lactobacillus preparation on laying performance of laying breeders |
| 表3 复合乳酸杆菌制剂对蛋种鸡营养物质表观消化率的影响Table 3 Effects of compound Lactobacillus preparation on nutrient apparant digestibility of laying breeders % |
| 表4 复合乳酸杆菌制剂对蛋种鸡免疫机能的影响Table 4 Effects of compound Lactobacillus preparation on immune function of laying breeders |
从表5可以看出，饲粮添加复合乳酸杆菌制剂可显著或极显著影响蛋种鸡盲肠大肠杆菌(P<0.01)、乳酸菌(P<0.01)和双歧杆菌的数量(P<0.05)。与对照组相比，试验组蛋种鸡盲肠大肠杆菌的数量减少，0.05%乳酸杆菌添加组与对照组差异显著(P<0.05)，0.10%乳酸杆菌添加组和0.20%乳酸杆菌添加组与对照组差异极显著(P<0.01)，各试验组之间差异不显著(P>0.05)。饲粮添加0.05%、0.10%和0.20%复合乳酸杆菌制剂均可使盲肠产气荚膜梭菌的数量显著降低(P<0.05)，0.05%乳酸杆菌添加组显著低于0.20%乳酸杆菌添加组，但均与0.10%乳酸杆菌添加组差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，0.05%乳酸杆菌添加组蛋种鸡盲肠乳酸菌的数量显著提高(P<0.05)，0.10%乳酸杆菌添加组和0.20%乳酸杆菌添加组均极显著提高(P<0.01)，各试验组间差异不显著(P>0.05)。试验组蛋种鸡盲肠双歧杆菌的数量与对照组相比呈现显著性的提高(P<0.05)，试验组间无显著差异(P>0.05)。
| 表5 复合乳酸杆菌对蛋种鸡盲肠微生物区系的影响 Table 5 Effects of compound Lactobacillus preparation on cecal microflora of laying breeders lg(CFU/g) |
本试验结果表明，饲粮中添加复合乳酸杆菌制剂对蛋种鸡平均日采食量无显著影响；料蛋比有所降低，但与对照组差异不显著；产蛋率有不同程度提高，其中0.05%乳酸杆菌添加组达到显著水平；日均产蛋重有所提高，但也与对照组差异不显著。乳酸菌制剂作为饲料添加剂对蛋鸡生产性能的促进作用被广泛认同，张志焱等[8]在蛋鸡基础饲粮中添加植物乳杆菌冻干菌粉后发现，其可显著降低料蛋比，但对蛋重影响不显著。李玉清等[9]将含乳酸杆菌的微生态制剂添加到罗曼褐蛋鸡的饲粮中，结果表明，乳酸杆菌能够显著提高种蛋合格率；林冬梅等[10]报道，饲粮添加乳酸菌制剂能够显著提高蛋种鸡的受精率，并有降低死胚率的趋势，在产蛋后期表现尤为显著。
本试验中，乳酸杆菌对蛋种鸡产蛋性能的促进，可能是由于随着复合乳酸杆菌的摄入，其改善了机体的微生态区系，抑制了有害菌群的滋生，维持了较为健康的细菌区系，进而使得机体产蛋性能有所提高[11]。本试验中蛋鸡的产蛋性能并没有随着乳酸杆菌添加量的提高而不断地增高，这可能因为适宜的乳酸杆菌数量能够使肠道的菌群维持在正常状态，但一旦乳酸杆菌的量增加到一定的程度，也会抑制其他种类肠道固有菌类的定植和存活，这并不利于肠道维持最佳的平衡和健康状态，进而会降低产蛋性能。从本试验结果来看，添加复合乳酸杆菌制剂对蛋种鸡的产蛋率影响显著，以0.05%添加水平最好，而其他产蛋性能指标各组间均差异不显著，说明蛋种鸡饲粮中添加0.05%的复合乳酸杆菌制剂作用效果较好。
乳酸菌能分解蛋白质、糖类，并能合成维生素，对脂肪也有微弱的分解能力，能提高营养物质消化率，促进吸收[12]。同时，乳酸菌在肠道内可以产生多种消化酶，而肠道可以通过对酶活性和酶含量的调节来调控营养物质的代谢速率和转化率，这对促进肠道内营养物质的消化吸收、提高饲料的转化效率有直接的促进作用[13]。
本试验结果表明，饲用乳酸杆菌制剂后，蛋种鸡对粗蛋白质的表观消化率显著提高，且以0.05%添加水平最好，但对钙和磷的表观消化率无显著影响。林冬梅等[10]在产蛋鸡基础饲粮中添加0.05%土霉素、0.10%和0.20%的乳酸杆菌，结果表明添加乳酸杆菌组的蛋白质表观消化率与对照组差异显著，而且0.02%乳酸杆菌组的蛋白质表观消化率最高，钙与磷的表观消化率与对照组无显著差异，这与本试验得出的结果基本一致。李笑樱等[14]研究表明，0.01%粪肠球菌+0.02%芽孢杆菌复合的微生态制剂可以显著提高精氨酸、亮氨酸、半胱氨酸等氨基酸的表观消化率。郭元晟等[15]在肉鸡饲粮中分别添加2×105、2×106和1×107 CFU/mL发酵乳酸杆菌，结果表明，添加该种乳酸菌显著提高了肉鸡回肠蛋白质和能量的表观消化率。
乳酸杆菌一方面能明显激活巨噬细胞的吞噬作用，另一方面由于它能在肠道内定植，相当于天然自动免疫，所以能增强机体的非特异性和特异性免疫反应，提高机体的抗病能力。当异物侵入机体时，乳酸菌可以提高外周血液中T淋巴细胞的增殖反应，激活免疫细胞，提高全身的细胞免疫水平[16]。阿木尔吉日嘎拉等[17]将乳酸杆菌L. casei Zhang制成乳酸菌液和发酵乳灌服雏鸡，检测新城疫血凝抑制效价后发现，与对照组相比，试验组抗体水平可提高1.00～1.77(log2)，试验结果与本试验吻合。易力等[18]研究显示，乳酸菌制剂对鸡胸腺、脾脏、法氏囊发育有良好的促进作用，并可一定程度上提高淋巴细胞转化率，而且在试验期内鸡血液中新城疫抗体效价持续高于对照组。本试验中，添加0.05%复合乳酸杆菌制剂显著提高了蛋种鸡禽流感抗体效价，0.10%复合乳酸杆菌制剂显著提高了胸腺指数和法氏囊指数，但不同水平复合乳酸杆菌制剂均对脾脏指数没有显著影响。这表明添加复合乳酸杆菌制剂对蛋种鸡的免疫机能产生了一定影响。
本试验中，乳酸杆菌的添加显著提高了蛋种鸡盲肠内有益菌乳酸菌和双歧杆菌的数量，显著降低了大肠杆菌和产气荚膜杆菌的数量，优化了肠道微生物区系。胥清富等[19]将含有乳酸杆菌的复合活菌剂添加到海赛克斯褐蛋鸡基础饲粮中，结果表明鸡盲肠内大肠杆菌数量显著减少，芽孢杆菌的数量显著增加，而且厌氧乳杆菌和双歧杆菌数量均增多，达到极显著水平。冯华等[20]将未包埋的乳酸菌和包埋乳酸菌分别添加到蛋鸡饲粮中，与不添加乳酸菌的对照组比较，添加乳酸菌的鸡胃中大肠杆菌皆受到不同程度的抑制作用，未包埋乳酸菌效果更好，其可使小肠、大肠和盲肠部位的大肠杆菌数量显著降低。这些研究结果均与本试验结果相近，说明乳酸杆菌对肠道有益菌的增殖、有害菌的抑制、保证肠道微生态健康有重要意义。
肠道菌群在宿主动物的消化道中处在动态的变化和平衡中，细菌数量受饲粮和环境等因素的影响而发生变化[21]，理想状态是使有益菌处于优势地位并长期地平衡，但在正常动物体内，添加的乳酸菌并不会永久定植在宿主(不包括无菌动物)体内[22]，所以添加外源性的乳酸菌的作用是积极的。有害菌，如大肠杆菌在消化道pH为6~7范围内最适于生长，而乳酸菌可以使简单的碳水化合物产生大量乳酸，从而降低消化道内pH，使之不利于大肠杆菌等有害菌的生长，从而促进消化吸收和预防细菌性腹泻[23]。乳酸菌作为肠道的优势菌群可以产生特殊酶系，同时能合成维生素、有机酸等，显著提高食物消化率和生物价[24]。由本试验可以看出，复合乳酸杆菌制剂的添加对蛋种鸡盲肠微生物区系有积极影响，显著提高了乳酸菌和双歧杆菌这2种有益菌的数量，并且对大肠杆菌和产气荚膜梭菌的数量有显著的抑制作用。
① 在蛋种鸡产蛋期饲粮中添加0.05%复合乳杆酸菌制剂可以提高蛋种鸡的产蛋率和对饲粮中粗蛋白质的表观消化率。
② 在蛋种鸡饲粮中添加复合乳酸杆菌制剂可以在一定程度上改善免疫机能。
③ 在蛋种鸡饲粮中添加复合乳酸杆菌制剂可以显著降低盲肠中大肠杆菌和产气荚膜杆菌的数量，显著提高乳酸菌和双歧杆菌的数量。
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