动物营养学报  2013, Vol. 25 Issue (7): 1610-1616   PDF (1020KB)    
烟酸对锦江黄牛瘤胃乳酸、挥发性脂肪酸浓度及相关酶活性的影响
杨艳1,2, 瞿明仁1 , 欧阳克蕙1, 赵向辉1, 易中华1, 宋小珍1    
1. 江西农业大学动物科学技术学院, 南昌 330045;
2. 江西省畜牧技术推广站, 南昌 330077
摘要:本试验旨在探讨在高精料饲粮条件下,添加烟酸对锦江黄牛瘤胃乳酸、挥发性脂肪酸浓度及相关酶活性的影响。选用3头平均体重为(275±20) kg、安装有永久性瘤胃瘘管的锦江黄牛,采用精料比例逐步提高来诱导酸中毒的试验方法,试验分4期,每期10 d,第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期依次饲喂精料比例分别为60%、70%、80%的饲粮;第Ⅳ期饲喂精料比例80%+烟酸800 mg/kg的饲粮。结果表明:1)在试验第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期,未添加烟酸条件下,随精料比例的提高,瘤胃pH显著下降(P<0.05);瘤胃中的乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸浓度随着精料比例的提高而提高,60%精料比例与70%和80%精料比例之间差异显著(P<0.05),但70%和80%精料比例之间差异不显著(P>0.05);瘤胃中的丙酮酸、乳酸浓度及乳酸/丙酮酸也随着精料比例的提高而提高,60%与70%精料比例之间差异不显著(P>0.05),80%精料比例与60%、70%精料比例之间差异显著(P<0.05);各精料比例对瘤胃氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)浓度和NADH/NAD+没有显著影响(P>0.05),但NAD+浓度随着精料比例的提高有降低的趋势,而NADH浓度和NADH/NAD+有提高的趋势。2)在试验第Ⅲ、Ⅳ期,精料比例为80%条件下,与未添加烟酸相比,添加烟酸显著提高了瘤胃pH及丙酸、总挥发性脂肪酸浓度(P<0.05),显著降低了丙酮酸、乳酸浓度及乳酸/丙酮酸(P<0.05),而乙酸、丁酸浓度及乙酸/丙酸差异不显著(P>0.05);与未添加烟酸相比,添加烟酸对瘤胃中总脱氢酶活性、NAD+、NADH浓度及NADH/NAD+均无显著影响(P>0.05),但有提高NAD+浓度,降低NADH浓度及NADH/NAD+的趋势。3)第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期瘤胃中均未检出乳酸脱氢酶活性,而在试验第Ⅲ期,精料比例为80%(未添加烟酸)条件下,瘤胃中检出了乳酸脱氢酶,其活性为132.9 U/mL。结果提示,添加烟酸提高了瘤胃NAD+浓度,降低了NADH浓度及NADH/NAD+,抑制了乳酸脱氢酶活性和乳酸产生,从而缓解瘤胃酸应激或酸中毒。
关键词烟酸     高精料     锦江黄牛     乳酸     挥发性脂肪酸         
Effects of Nicotinic Acid on Lactate and Volatile Fatty Acid Concentrations, and Related Enzyme Activities in Rumen of Jinjiang Cattle
YANG Yan1,2, QU Mingren1 , OUYANG Kehui1, ZHAO Xianghui1, YI Zhonghua1, SONG Xiaozhen1    
1. College of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China;
2. Animal Husbandry Technique Promotion Station of Jiangxi Province, Nanchang 330077, China
Abstract:The effects of nicotinic acid (NA) on lactate and volatile fatty acid (VFA) concentrations, and related enzyme activities in rumen of Jinjiang cattle were studied in this experiment. Three healthy Jinjiang cattle with permanent rumen cannulas and an average body weight of (275±20) kg were selected. Using rumen acidism method induced by gradually increasing concentrate ratio, the experiment was divided into four test periods: test periods Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ were fed diets with the concentrate ratios of 60%, 70% and 80%, respectively; test period Ⅳ was fed the diet with 80% concentrate ratio + 800 mg/kg NA, and every test period lasted for 10 days. The results showed as follows: 1) in test periods Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ, under the condition of diets without NA, pH in rumen was significantly decreased with the increase of concentrate ratio (P<0.05); the concentrations of acetate, propionate, butyrate and total VFA were significantly increased with the increase of concentrate ratio (P<0.05), there was significant difference between 60% and 70% or 80% concentrate ratio (P<0.05), but no significant difference was found between 70% and 80% concentrate ratio (P>0.05). Rumen pyruvate and lactate concentrations, and lactate/pyruvate were increased with the increase of concentrate ratio, no significant difference was found between 70% and 60% concentrate ratio (P>0.05), but there was significant difference between 80% and 70% or 60% concentrate ratio (P<0.05). There were no significant differences in the concentrations of oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) and reduced nicotinamide adenine dinucleotide NADH, and NADH/NAD+ in this three test periods (P>0.05), but with the increase of concentrate ratio, NAD+ concentration was reduced, and NADH concentration and NADH/NAD+ were increased. 2) In test periods Ⅲ and Ⅳ, under the condition of 80% concentrate ratio, the supplementation of NA significantly increased rumen pH, propionate and total VFA concentrations (P<0.05), and significantly decreased pyruvate and lactate concentrations, and lactate/pyruvic compared with no NA supplementation (P<0.05), but there were no significant differences in the concentrations of acetate and butyrate, and acetate/propionate (P>0.05). The supplementation of NA did not significantly affect NAD+ and NADH concentrations and lactate dehydrogenase activity compared with no NA supplementation (P>0.05), but there was a trend to increase NAD+ concentration and decrease NADH concentration and lactate dehydrogenase activity (P>0.05). 3) The lactate dehydrogenase activity in rumen was not detected in test periods Ⅰ, Ⅱ and Ⅳ, and only found in the test period Ⅲ of 80% concentrate ratio (without NA), and the activity was 132.9 U/mL. In conclusion, the supplementation of NA can increase NAD+ concentration, decrease NADH concentration and lactate dehydrogenase activity, and inhibit lactate dehydrogenase activity and lactic acid concentration. Therefore, NA may be play a role in alleviate acid shock or acidosis in rumen.
Key wordsnicotinic acid     high concentrate diet     Jingjiang cattle     lactate     VFA     enzyme    

近年来,由于动物生长性能和集约化程度的不断提高,现代反刍动物生产中开始大量使用高比例精料的饲粮,以提高牛、羊生产水平和生产效率,但是,这往往导致动物采食量下降、瘤胃菌群失调、瘤胃酸中毒等。乳酸是瘤胃碳水化合物代谢过程中的一种中间产物,瘤胃内乳酸浓度的高低是瘤胃功能正常与否的一个重要指标。反刍动物瘤胃内乳酸浓度显著升高是导致急性瘤胃酸中毒、瘤胃炎、肝水肿等代谢疾病的直接原因。患急性瘤胃酸中毒的病畜可观察到瘤胃乳酸浓度由小于5 mmol/L急剧上升到50~120 mmol/L[1],严重酸中毒时甚至超过300 mmol/L[2]。烟酸是动物必需营养素之一,是生物细胞氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的合成前体。一般情况下,反刍动物摄入与瘤胃合成的烟酸量足够满足其营养需要,一般不需要额外补充。但随着“高精料短周期”肥育模式的推广,反刍动物对烟酸等B族维生素的需求也越来越大[3, 4]。NAD+是细胞生物化学过程中重要的辅因子,对生物体内多种生物代谢起重要的调控作用。那么在高精料饲粮条件下,精料比及烟酸对锦江黄牛瘤胃酸代谢是否有影响,影响的机制如何,目前尚不清楚,也鲜见报道。因此,本试验对高精料饲粮条件下,添加烟酸对瘤胃乳酸及挥发性脂肪酸产生的影响进行研究,旨在探讨瘤胃酸中毒新的调控思路和方法,减少酸中毒所造成的巨大经济损失,促进反刍动物养殖业的发展。

1 材料与方法
1.1 试验动物、设计及饲粮

选用3头平均体重为(275±20) kg、安装有永久性瘤胃瘘管的锦江黄牛,采用精料比例逐步提高来诱导酸中毒的试验方法。试验分4期,每期10 d,第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期依次饲喂精料比例分别为60%、70%、80%的饲粮,研究不同精料比例对锦江黄牛瘤胃乳酸及挥发性脂肪酸浓度的影响;第Ⅳ期研究在精料比例为80%的饲粮条件下,添加烟酸对瘤胃乳酸及挥发性脂肪酸浓度的影响。试验动物每日饲喂2次(07:00和19:00),自由饮水。

烟酸购于郑州兴禾化工有限公司,食品级,纯度大于98%。烟酸添加量为800 mg/kg(根据欧阳克蕙等[5]研究报道确定)。试验饲粮参照我国肉牛饲养标准(NY/T 815—2004)[6]设计,其组成及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平 Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets %
1.2 样品的采集及预处理

每期最后3 d (13:00)采集样品。分别在瘤胃高、中、低3点采集瘤胃液各50 mL,每头牛分别取样分装。取1 mL瘤胃液,12 000 r/min离心 5 min,去掉上清液,添加300 μL HCl (0.2 mol/L), 萃取NAD+,破坏掉NADH,50 ℃水浴10 min,然后迅速放在冰中冷却至0 ℃,接着逐滴添加300 μL NaOH (0.1 mol/L)进行中和,1 mL枪头反复吹打混匀,12 000 r/min离心10 min,将上清液移至另一管中待用,-80 ℃保存用于NAD+浓度的测定;另取1 mL瘤胃液,12 000 r/min离心5 min,去掉上清液,以300 μL NaOH(0.2 mol/L)萃取NADH,添加300 μL HCl (0.1 mol/L)进行中和,其余步骤同NAD+,-80 ℃保存用于NADH浓度的测定[7]

其余瘤胃液经4层消毒纱布过滤。取100 mL滤液迅速转移至100 mL离心管中,1 500 r/min离心10 min,去除原虫和饲料大颗粒后快速分装,-80 ℃保存,以备测定挥发性脂肪酸、乳酸及丙酮酸浓度;另取10 mL滤液,6 mL立即测定总脱氢酶活性,剩余4 mL滤液4 ℃冷藏,12 h内测定乳酸脱氢酶活性。

1.3 检测指标及方法
1.3.1 pH

瘤胃液采集后,充分混合,采用PHS-320型pH计立即测定pH。

1.3.2 挥发性脂肪酸浓度

采用气相色谱法测定:杭州科晓GC-1690型气相色谱仪,氢火焰离子化(FID)检测器, OV-1701通用型毛细管色谱柱(30 m×0.32 mm× 0.5 μm),2000色谱数据工作站,内标物为巴豆酸。采用程序升温:初温80 ℃,初时3.5 min,升速30 ℃/min,终温180 ℃,终时10 min;进样室温度260 ℃,检测器温度260 ℃;柱前压力0.05 MPa,氮气作为载气。样品进样量1 μL。

1.3.3 丙酮酸、乳酸浓度及乳酸脱氢酶活性

采用TU-1810D型紫外可见分光光度计检测,试剂盒购自南京建成生物工程研究所,按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 NAD+、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)浓度

参照李骆冰等[8]的方法。反应混合液:0.1 mol/L Bicine buffer(pH 8.0)2 mL、无水乙醇75 μL、12 mmol/L噻唑蓝(MTT)100 μL、16.6 mmol/L乙硫吩嗪(PES) 200 μL混合,30 ℃水浴10 min。反应体系:依次添加50 μL样品、2 mL的反应混合液和20 μL的乙醇脱氢酶(500 U/mL),迅速混匀,测定。

标准曲线的制作:利用紫外可见分光光度计测定并得到标样反应液在570 nm吸光度(A570 nm)随时间变化曲线,15 min内吸光度变化与时间成正比。试验中取测定时间为7 min。绘制5个已知浓度标样的A570 nm随时间变化曲线斜率图,对每个标样试验点进行线性拟合,得到该标准浓度下A570 nm随时间变化曲线的斜率。以A570 nm随时间变化曲线斜率为横坐标,以标准样品浓度为纵坐标作图,得到NAD+(或NADH)的标准曲线图。

样品测定:将样品的A570 nm随时间变化曲线的斜率值代入标准曲线,得出相应的浓度值。

1.3.5 总脱氢酶活性

参照哈兹耶夫[9]的方法。对照管首先加入5 mL异丙醇,然后在对照管和样品管各加入100目尼龙布过滤的新鲜瘤胃液2 mL及0.2 mL 1.5%的氯化三苯四氮唑(TTC)混匀。混匀后立即将对照管和样品管放在厌氧条件下恒温39 ℃水浴中准确反应10 min。样品管迅速加入5 mL异丙醇终止反应。3 min后将对照管和样品管的反应液以4 000 r/min离心10 min。上清液稀释15倍,于紫外可见分光光度计在485 nm处比色测吸光度(A485 nm) 。将在38.5 ℃、pH 6.8条件下,每分钟引起测定液吸光度上升0.1的酶量定义为1个酶活单位。

活力单位(U/mL)=(样品A485 nm/min-

对照A485 nm/min)×15。

1.4 统计分析

试验数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),Duncan氏法进行多重比较,结果以平均值±标准误表示,P<0.05为差异显著。

2 结果与分析
2.1 烟酸对瘤胃酸代谢的影响

由表2可知,在试验第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期,未添加烟酸的情况下,随着精料比例的提高,瘤胃pH显著下降(P<0.05);瘤胃中的乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸浓度随着精料比例的提高而提高,70%、80%精料比例与60%精料比例之间差异显著(P<0.05),但70%和80%精料比例之间差异不显著(P>0.05);而瘤胃中的丙酮酸、乳酸浓度及乳酸/丙酮酸也随着精料比例的提高而提高,60%与70%精料比例之间差异不显著(P>0.05),80%精料比例与60%、70%精料比例之间差异显著(P<0.05)。

在试验第Ⅲ、Ⅳ期,精料比例为80%条件下,与未添加烟酸相比,添加烟酸显著提高了瘤胃pH及丙酸、总挥发性脂肪酸浓度(P<0.05),显著降低了丙酮酸、乳酸浓度及乳酸/丙酮酸(P<0.05),而乙酸、丁酸浓度及乙酸/丙酸差异不显著(P>0.05)。

表2 烟酸对瘤胃酸代谢的影响 Table 2 Effects of nicotinic acid on acid metabolism of rumen
2.2 烟酸对瘤胃中NAD+(H)浓度及与酸代谢有关酶活性的影响

由表3可知,在试验第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期,未添加烟酸的情况下,各精料比例对瘤胃中NAD+浓度无显著差异(P>0.05),但有随着精料比例的提高而降低的趋势;总脱氢酶活性随着精料比例的提高而显著降低(P<0.05)。各精料比例对瘤胃中NADH浓度、NADH/NAD+无显著影响(P>0.05),但有随着精料比例的提高而提高的趋势。

在试验第Ⅲ、Ⅳ期,精料比例为80%条件下,与未添加烟酸相比,添加烟酸对瘤胃中NAD+、NADH浓度、NADH/NAD+、总脱氢酶活性均无显著影响(P>0.05),但有提高NAD+浓度,降低NADH浓度及NADH/NAD+的趋势。

第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期瘤胃中均未检出乳酸脱氢酶活性,而在试验第Ⅲ期,精料比例为80%(未添加烟酸)条件下,瘤胃中检出了乳酸脱氢酶,其活性为132.9 U/mL。

3 讨 论
3.1 精料比例对瘤胃酸代谢的影响

在试验第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期,未添加烟酸的情况下,随着精料比例的提高,瘤胃pH显著下降;瘤胃中的乙酸、丙酸、丁酸、总挥发性脂肪酸浓度随着精料比例的提高而提高,70%、80%精料比例与60%精料比例之间差异显著,但70%和80%精料比例之间差异不显著。而瘤胃中的乳酸浓度及乳酸/丙酮酸也随着精料比例的提高而提高,60%与70%精料比例之间差异不显著,80%精料比例与60%、70%精料比例之间差异显著。可见,瘤胃pH的显著下降,主要是由于乳酸大量产生而导致的。同时,随着精料比例的提高,60%、70%和80%精料比例使瘤胃中NADH浓度、NADH/NAD+有提高的趋势,NAD+浓度有降低的趋势。这可能是因为随着精料比例的提高,饲粮中丰富的淀粉和糖类被瘤胃内各种微生物所降解,生成葡萄糖、果糖、木糖等己糖和戊糖,然后经酵解转化为丙酮酸,同时大量的NAD+还原成NADH,NADH/NAD+升高,促使了瘤胃乳酸产量的增加和乳酸/丙酮酸升高,这也说明了乳酸是瘤胃pH显著下降的主要原因。因此,高精料饲粮对瘤胃酸代谢具有显著影响,主要是使乳酸大量产生。如果长时间使用高精料饲粮具有酸中毒的危险。

表3 烟酸对瘤胃中NAD+(H)浓度及与酸代谢有关酶活性的影响Table 3 Effects of nicotinic acid on NAD+(H) concentrations and acid metabolism-related enzyme activities in rumen
3.2 烟酸对瘤胃酸代谢的影响

烟酸是动物必需营养素之一。一般情况下,反刍动物摄入与瘤胃合成的烟酸量足够满足其营养需要,不需要额外补充。但随着动物生产性能的提高和饲粮结构的改变,对烟酸等B族维生素的需求也越来越大。有研究认为,烟酸有利于缓解反刍动物的高精料应激[3, 4]。本研究结果表明,80%精料比例条件下,与未添加烟酸相比,添加烟酸显著提高瘤胃pH,抑制了因精料比例提高而pH进一步下降,使瘤胃pH保持在正常范围内。乳酸的酸度比挥发性脂肪酸高数十倍[10],乳酸浓度升高可导致瘤胃pH迅速降低,本试验条件下,添加烟酸使乳酸浓度、乳酸/丙酮酸显著降低。因此,添加烟酸具有缓解瘤胃酸应激的作用。Brent等[3]报道,补饲烟酸有益于受到应激刺激的公牛,尤其是那些采食高精料饲粮有不良应激反应的公牛。Byers等[4]总结了14个试验,发现肉牛饲粮中添加50~250 mg/kg烟酸可促进育肥家畜尽快适应育肥期饲粮,显著提高平均日增重与饲料利用率。Niehoff等[11]研究表明烟酸的使用效果和基础饲粮中精料比例有关。当基础饲粮中精料比例为80%时,添加烟酸才有效。当饲粮中粗饲料含量达到50%时,添加烟酸效果不佳。这可能与低精料比例饲粮条件下,乳酸产生量小有关。

3.3 烟酸对瘤胃NAD+(H)浓度及乳酸脱氢酶活性的影响

烟酸是动物体内NAD+的直接前体,与碳水化合物代谢和乳酸的产生密切相关。乳酸脱氢酶是催化生成乳酸的关键酶,瘤胃内乳酸脱氢酶的活性反映了瘤胃的乳酸产生能力。NAD+是NADH的竞争性抑制剂,对乳酸脱氢酶有抑制作用。本研究结果表明,当未添加烟酸的情况下,由于饲粮精料比例的提高,消耗NAD+,使瘤胃中NAD+浓度下降,NADH浓度提高,而添加烟酸后则相反,NAD+浓度提高,NADH浓度下降。值得注意的是试验第Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期均未检出乳酸脱氢酶,原因可能是检测方法不够灵敏,但不代表这3个试验期瘤胃中没有乳酸脱氢酶,而在试验第Ⅲ期,精料比例为80%(未添加烟酸)的条件下,瘤胃中检出了乳酸脱氢酶,其活性为132.9 U/mL,同时,其乳酸浓度也是4个试验期中最大的,为1.184 mmol/L。这可能是在精料比例80%没有添加烟酸时,NAD+浓度下降,降低其对乳酸脱氢酶的抑制作用,使乳酸脱氢酶活性大幅度升高,达到了本方法检测的灵敏度。本研究结果与Krause等[12]、Russell等[13]研究结果相似。

4 结 论

添加烟酸提高了瘤胃NAD+浓度,降低了NADH浓度及NADH/NAD+,抑制了乳酸脱氢酶活性和乳酸产生,从而缓解瘤胃酸应激或酸中毒。

参考文献
[1]NAGARAJA T G,TITGEMEYER E C.Ruminal acidosis in beef cattle:the current microbiological and nutritional outlook[J].Journal of Dairy Science,2007,90:17-38.[本文引用:1]
[2]MOLLER P D,DIERNAES L,SHESTED J,et al.Absorption and fate of L- and D-lactic acid in ruminants[J].Comparative Biochemistry and Physiology,1997,118:387-388.[本文引用:1]
[3]BRENT B E,BARTLEY E E.Thiamin and niacin in the rumen[J].Journal of Animal Science,1984,59:813.[本文引用:3]
[4]BYERS F M.Another look at niacin[J].Animal Nutrition Health,1981,36(6):36.[本文引用:3]
[5]欧阳克蕙,鲁友友,瞿明仁,等.烟酸对高精料饲粮肥育肉牛生长性能及血清生化指标的影响[J].动物营养学报,2012,24(9):1764-1769.[本文引用:1]
[6]中华人民共和国农业部.NY/T 815—2004 肉牛饲养标准[S].北京:中国农业出版社,2004.[本文引用:1]
[7]李建,陈可泉,黄秀梅,等.厌氧发酵有机酸体系中NAD+和NADH测定方法的建立[J].食品科技,2008,33(12):254-257.[本文引用:1]
[8]李骆冰,王永红,庄英萍,等.乙醇发酵中酿酒酵母辅酶NAD+及NADH测定方法[J].食品与生物技术学报,2011,30(2):287-294.[本文引用:1]
[9]哈兹耶夫.土壤酶活性[M].郑洪元,译.北京:科学出版社,1980.[本文引用:1]
[10]NAGARAJA T G,TITGEMEYER E C.Ruminal acidosis in beef cattle:the current microbiological and nutritional outlook[J].Journal of Dairy Science,2007,90:17-38.[本文引用:1]
[11]NIEHOFF I D,HUTHER L,LEBZIEN P.Niacin for dairy cattle:a review[J].British Journal of Nutrition.2009,101(1):5-19.[本文引用:1]
[12]KRAUSE K M,OETZEL G R.Understanding and preventing subacute ruminal acidosis in dairy herds:a review[J].Animal Feed Science and Technology,2006,126:215-236.[本文引用:1]
[13]RUSSELL J B,HINO T.Regulation of lactate production in Streptococcus bovis:a spiraling effect that contributes to rumen acidosis[J].Journal of Dairy Science,1985,68:1712-1721.[本文引用:1]