肠上皮由不同种类的柱状细胞组成，其中分散着很多杯状细胞。这些杯状细胞可以持续地表达一种糖蛋白——黏蛋白^[7]。细胞合成黏蛋白后将其转运或分泌到细胞外，随后黏蛋白聚合在一起，形成具有屏障功能的黏液层。黏液层能有效地把外源病原微生物、毒素等有害物质隔绝在细胞外^[8]。

黏蛋白中有富含苏氨酸、脯氨酸和丝氨酸的串联重复序列，不同来源的黏蛋白具有不同的糖基化模式。通常寡糖链占成熟黏蛋白干重的50%~80%。由于有多个不同的连接位点，寡糖链的结构差异非常大，而黏蛋白的生化和生理特性也很大程度上取决于糖基化程度。有人认为黏蛋白可以为肠道中共生微生物提供寡糖^[9]，这些宿主为特定的微生物提供特定的寡糖会为某些种类的微生物在肠道定植提供了竞争优势。同时宿主黏蛋白中寡糖组成也与肠道的微生物区系一同进化，这些为宿主提供最大的生长优势^{[10, 11]}。

研究益生菌能否黏附在肠道黏液层的最简单模型就是采用商品化的黏蛋白。人们把黏蛋白以10 mg/mL的浓度溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中，并在聚乙烯微量滴定板上固定过夜。随后将培养的微生物的光密度(OD)值调整到0.1左右，微生物加入聚乙烯微量滴定板后在37 ℃温育1 h。之后用PBS洗涤除去未黏附在滴定板的微生物。最后可以通过细菌计数或荧光定量PCR等多种定性或者定量的方法检测黏附到黏蛋白上的微生物数量^{[12, 13, 14]}。

Jonsson等^[12]发现在固体培养基中加入黏蛋白可以提高微生物的黏附能力，而加入蛋白酶处理之后，这种黏附能力则大大降低。这些结果显示与黏蛋白相互作用的蛋白质可能位于微生物表面。随后，人们分别用这种方法鉴定了发酵乳杆菌、罗伊乳杆菌、嗜酸乳杆菌和格氏链球菌细胞表面的黏蛋白结合蛋白^{[15, 16, 17, 18]}。

这种模型的优点是可以检测到菌株和已知的特定黏蛋白的相互作用，并且排除了细胞表面其他物质的干扰，而缺点是模型过于简化，没有考虑到机体内相互作用的复杂性，无法将微生物的疏水性蛋白质的相互连接以及同黏膜层的特异性连接区分开来^[19]。

人们常常用分离得到的肠上皮细胞系来作为研究肠道作用机制的体外模型，在益生菌的黏附过程研究中，人们同样采用了多种不同的细胞系进行研究。比如在猪小肠上皮IPEC-1细胞系的研究中，将IPEC-1细胞以10⁶ 个/孔的浓度接种到Transwell培养皿上，使其分化14 d，即形成完整的细胞连接和微绒毛。然后，将微生物在培养基中培养过夜后按1∶ 50的比例接种到DMEM-F12培养基中静置培养3 h，随后按照细菌∶ 细胞数(50~100)∶ 1的比例加至细胞培养瓶中，1~3 h之后收获细胞进行分析。通过这种细胞与微生物的共培养技术，人们可以深入研究微生物与上皮细胞的相互作用以及引起的细胞信号通路的变化。

在Caco-2细胞系中，人们通过这种模型获得了很多在体内试验无法获得的数据。Caco-2和HT29同样是该模型中最常用的肠细胞系，这2种细胞可以分化成单层膜来模拟肠道上皮。最初，这种模型用于研究肠道癌。人们也用这个模型对黏蛋白黏附模型的研究结果进行了验证，结果显示采用2个模型取得的研究结果稍有不同^{[20, 21]}。

使用氨甲喋呤处理HT29细胞后，可以使HT29细胞分化成可以分泌黏蛋白的分泌细胞，细菌对氨甲喋呤处理后的HT29细胞的黏附性则有明显增加。正常的肠上皮由一定比例的肠上皮细胞和杯状细胞组成，而氨甲喋呤处理后的HT29细胞主要是杯状细胞，因而这种模型尽管可以形成单层膜来模拟肠上皮，模拟的肠上皮与肠道上皮的正常的细胞组成相比还是有所差异的，得到的结果可能也与机体内的结果有所不同^[22]。为了避免上述因素的影响，人们按照肠上皮细胞的比率发展出了Caco-2和HT29的共培养体系^{[23, 24]}。然而在这个模型中，HT29分泌的MUC5A和MUC5B占绝对优势，而在结肠中，MUC2的含量较高。从目前的研究来看，这种模型是广泛采用的研究手段^{[25, 26]}。

在肠产毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)的研究中，人们通过这种模型发现ETEC的感染能降低跨膜电阻，可能的机制是通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路引起紧密连接复合体，包括封闭蛋白(claudin)、闭锁蛋白(occludin)和闭锁小带蛋白(zonula occudin，ZO，如ZO-1等)的错位，破坏紧密链接的结构^{[27, 28]}。此外，ETEC能够激活MAPK信号通路，包括p38 MAPK、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化，激活的MAPK信号通路又促进了ETEC黏附到细胞上^{[29, 30]}。

此外，在细胞培养模型中，研究者也可以加入2种微生物以研究他们的竞争或调控关系，这种方法通常用在研究益生菌与病原菌的相互作用上。Qin等^[31]研究了乳酸菌对肠上皮细胞侵袭性大肠杆菌(enteroinvasive Escherichia coli,EIEC)损伤的保护作用，发现肠上皮Caco-2在EIEC感染后,细胞骨架F-actin遭到破坏,Caco-2细胞间紧密连接结构遭到破坏,紧密连接蛋白(claudin-1、occludin和ZO-1)的合成量亦减少,而植物乳杆菌处理后细胞F-actin的合成量明显增多，由此指出植物乳杆菌可以减轻EIEC引起的紧密结构受损,紧密连接蛋白的合成量也因此增加。

上述研究模型的主要缺点就是它们无法模拟正常肠道的微生物区系情况，无法研究肠道的共生微生物和外来微生物的竞争关系。因而，人们试图采用肠道片段来研究微生物与肠道的相互作用^[32]。

在断奶仔猪腹泻的研究中，Nabuurs等^[33]建立了原位小肠结节灌注(small intestinal segment perfusion)技术。该技术可通过手术在仔猪的空肠部位建立10个同样的空肠手术段，并上下两端插入导管进行灌注和收集样品^[33]。应用该技术，人们可以通过采集不同时间点小肠黏膜样本来研究不同的益生菌菌株灌注之后菌株对小肠的黏附能力，也可以研究宿主基因和蛋白质表达的变化、转录组学变化以及免疫系统的反应等^{[34, 35, 36]}。

Niewold等^[34]结合基因芯片技术研究了ETEC感染仔猪后空肠基因表达的变化情况，Veldhuizen等^[37]通过该技术研究了鼠伤寒沙门氏菌感染仔猪后空肠和回肠的形态变化。随后Gross等^[38]通过小肠结节灌注技术研究了植物乳杆菌的野生菌株和甘露糖特异性黏附素突变菌株对小肠黏膜黏附的影响，在8 h的作用下，植物乳杆菌甘露糖特异性黏附素基因缺失的菌株将会部分失去对肠上皮细胞黏附的能力，导致在感染情况下小肠电解质净流量的提高，腹泻几率的上升。因此以小肠结节灌注技术为基础的试验可以研究微生物与肠道的相互作用，验证相关基因的功能，这将会为改造益生菌从而提供机体抵抗力提供重要的理论基础^{[39, 40]}。

尽管获得这些试验用的健康肠段需要较高的手术水平，但是这种研究模型能更准确地模拟出正常机体情况下微生物进入体内所发生的变化。手术的肠道片段可以短时间存活并且保持相应的功能，因而，很多益生菌和病原菌的研究都采用了这种模型对微生物与肠道的相互作用进行评估。

尽管对肠道和肠道菌群间相互作用仍不完全清楚，但是随着肠道微生物领域新的研究体外模型和技术手段的应用，各种微生物在各种生理、病理条件下的作用机制逐渐被揭开，这些体外研究模型和技术手段必然会给动物营养学及其相关领域的研究带来新气象。