试验采用完全随机试验设计设置4个组，分别为低蛋白质饲粮条件下血液氨基酸模式组(LPBP)^[12]、全乳蛋白氨基酸模式组(MP)^[13]、80%酪蛋白+20%乳清蛋白氨基酸模式组(CLP)^[14]、酪蛋白氨基酸模式组(CP)^[14]，每个组3个重复，并重复试验3次。4种氨基酸模式组的氨基酸配比见表1。试验开始前，分别配制4种氨基酸模式的培养基，配制方法参考DMEM/F12培养基配方，各培养基中总氨基酸浓度均为1 070 mg/L，配制完成后调整培养基pH在7.0～7.4之间。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同氨基酸模式组的氨基酸配比 Table 1 Percentage of amino acids in groups of different amino acid patterns % 氨基酸 Amino acids 不同氨基酸模式组 Groups of different amino acid patterns LPBP MP CLP CP L-酪氨酸 L-Tyr 2.18 5.67 6.30 6.63 L-丙氨酸 L-Ala 11.66 3.78 2.91 2.77 L-甘氨酸 L-Gly 29.77 2.27 0.40 0.48 L-谷氨酸 L-Glu 10.50 29.30 25.00 26.40 L-丝氨酸 L-Ser 8.31 6.05 5.93 6.03 L-半胱氨酸 L-Cys 4.15 0.76 1.16 0.48 L-苯丙氨酸 L-Phe 2.29 6.05 6.54 6.63 L-亮氨酸 L-Leu 5.75 10.97 18.52 17.37 L-异亮氨酸 L-lle 3.94 5.30 6.17 6.27 L-组氨酸 L-His 1.28 3.78 2.32 2.41 L-赖氨酸 L-Lys 2.72 10.21 7.46 7.24 L-苏氨酸 L-Thr 6.76 5.67 5.60 5.55 L-蛋氨酸 L-Met 0.80 2.27 3.65 3.74 L-色氨酸 L-Try 1.65 1.89 1.80 1.57 L-缬氨酸 L-Val 8.25 6.05 6.22 6.39

表1 不同氨基酸模式组的氨基酸配比 Table 1 Percentage of amino acids in groups of different amino acid patterns %

乳腺上皮细胞培养方法参照Miranda等^[15]略有修改。选取泌乳中期的健康中国荷斯坦奶牛，采集乳腺深层组织(注意避开结缔组织和脂肪组织)适量，放入含有双抗(Gibco，美国)的DMEM/F12培养基中，置于保温盒中迅速带回实验室。在超净台中用含有3倍双抗的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS，Hyclone，美国)冲洗乳腺组织块3遍，再放入75%的乙醇溶液中浸泡30 s，再用含有1倍双抗的DPBS冲洗至清澈。在培养皿中使用眼科剪刀和镊子精细选取腺泡组织，放入5 mL细胞冻存管中，再次使用眼科剪刀将其剪碎，放入等体积0.05% Ⅱ型胶原酶(Gibco，美国)溶液，放置于37 ℃、5% CO₂培养箱消化90 min，期间每隔20 min震荡1次。取出已消化完成的溶液，使用80目网筛过滤，将滤液移入15 mL离心管中，以1 500 r/min离心3 min，弃去上清液，加入培养基后重新悬浮，接种于25 cm²细胞培养瓶中，放入37 ℃、5% CO₂培养箱内培养。待细胞铺满瓶底后，进行传代与纯化。选取纯化后的第3代形态稳定的乳腺上皮细胞用胰蛋白酶消化后以3×10⁵个/mL的密度接种于6孔板上，待细胞铺满以后再做处理。在正式试验前，将细胞置于无血清的培养基中空白处理24 h，以消除血清中未知因子对试验处理的影响，之后再换成不同氨基酸模式的培养基处理48 h。

处理后的乳腺上皮细胞用TIANGEN总RNA提取试剂盒(DP430)提取细胞总RNA后立即用TaKaRa反转录试剂盒(DRR036A)反转录成cDNA，然后使用实时定量PCR仪(Bio-Rad，美国)，选用磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)为内参基因，应用TaKaRa SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ(DRR081)试剂盒进行CSN1S1、CSN3基因mRNA表达量的定量分析。RT-qPCR引物信息及反应条件见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 RT-qPCR引物信息及反应条件 Table 2 Primer information and reaction condition for RT-qPCR 基因 Genes 引物序列 Primer sequences (5′—3′) GenBank登录号 GenBank accession No. 产物大小 Product size/bp 退火温度 Tm/℃ αs1-酪蛋白 CSN1S1 上游:AATCCATGCCCAACAGAAAG 下游:TCAGAGCCAATGGGATTAGG BC109618 189 59 κ-酪蛋白 CSN3 上游:CCAGGAGCAAAACCAAGAAC 下游:TGCAACTGGTTTCTGTTGGT NM_174294 148 56 磷酸甘油醛脱氢酶 GAPDH 上游:GGGTCATCATCTCTGCACCT 下游:GGTCATAAGTCCCTCCACGA XM_001252479 177 59

表2 RT-qPCR引物信息及反应条件 Table 2 Primer information and reaction condition for RT-qPCR

处理后的乳腺上皮细胞应用天净沙细胞裂解液(80807B-50)进行处理。首先去除细胞培养基，用预冷的DPBS洗2遍，将6孔板放置在冰上，每孔加入100 μL细胞裂解液，冰上放置15 min后，将细胞培养板倾斜使上清液汇集在一起，并将其全部转移到1个新的1.5 mL塑料离心管中，以15 000×g于4 ℃离心10 min，将上清液转移到1个新的1.5 mL离心管中，放置冰上待用。采用R & D公司的牛α_s-酪蛋白ELISA检测试剂盒测定各个组的α_s-酪蛋白合成量。此试剂盒检测原理是采用双抗一步夹心ELISA，往预先包被α_s-酪蛋白抗体的包被孔中一次加入标本、标准品、辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的α_s-酪蛋白合成量呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光值(OD)，计算样品浓度。线性回归方程为：

试验原始数据使用Excel 2007进行计算和整理，基因表达数据采用2^-△△Ct法进行计算,所得整理后试验数据采用SAS 9.0软件的ANOVA过程进行单因子方差分析，多重比较采用Duncan氏法，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

由图1可知，不同氨基酸模式对CSN1S1基因mRNA表达量有显著影响(P<0.05)，MP组CSN1S1基因mRNA表达量显著高于其他各组(P<0.05)，其他各组间差异不显著(P>0.05)。CSN3基因mRNA表达量也有相同的结果，MP组CSN3基因mRNA表达量极显著高于LPBP组(P<0.01)，CLP和CP组显著高于LPBP组(P<0.05)。