近几年来，反刍动物甲烷(CH4)排放问题已引起社会的广泛关注，成为动物营养领域研究的热点问题之一。有研究表明，在反刍动物瘤胃发酵过程中，有2%~12%的能量以CH4的形式损失，这不仅造成了能量的浪费，还污染了大气环境[1]。反刍动物CH4排放量占大气总排放量的15%左右[2]。因此，抑制反刍动物CH4排放对保护人类赖以生存的自然环境、减少饲料能量损失、提高饲料利用率等具有非常重要的研究意义。
稻草是我国丰富的秸秆资源之一，主要作为反刍动物的常用粗料，其纤维素含量高、粗蛋白质(crude protein,CP)含量低、适口性差、反刍动物的采食量和消化率低[3]。尿素氨化处理是常用的加工处理方法，氨化处理能够提高稻草的CP含量，改善适口性，同时提高反刍动物的采食量和消化率[4, 5]。李兵[6]研究显示，随着尿素氨化处理水平的提高，总挥发性脂肪酸(total volatile fatty acids,TVFA)产量增加，这说明氨化处理对稻草的微生物发酵是有益的，但CH4产量也相应增加，并且CH4/TVFA保持不变。这些结果表明，氨化处理提高稻草消化率的同时也增加CH4的产量。但是，在实际生产中，氨化稻草一般都是以一定比例与精料混合饲喂的。因此，有必要研究不同氨化稻草水平及精料/粗料对CH4和VFA产量的影响，以探讨提高反刍动物消化率的同时减少CH4排放的措施，为反刍动物生产中更好地利用氨化稻草提供理论依据。
本试验选用2头体况良好、年龄为1.5岁、平均体重为380 kg、安装有永久性瘤胃瘘管的西门塔尔牛去势公牛作为瘤胃液供体。试验牛拴系饲养，每天07:00和17:00分2次饲喂，自由饮水。瘤胃液供体牛的日粮组成为：精料混合料2.0 kg/d和粗料6.0 kg/d。其中精料混合料组成为：玉米58%、豆粕20%、小麦麸18%、磷酸氢钙2%、食盐1%、微量元素预混料1%，粗料为干羊草。试验牛预饲15 d后，第16天开始采集瘤胃液。
本试验以未氨化稻草、4%尿素氨化稻草和6%尿素氨化稻草作为粗饲料。以4%尿素氨化稻草组为例，具体氨化操作步骤为：称取5 g尿素(分析纯)，完全溶解于100 mL蒸馏水中，制备成质量浓度为5%的尿素溶液。称取100 g风干稻草，切短至2~3 cm，放入盆中。取80 mL尿素溶液，均匀地喷洒在稻草上，并反复翻动，使尿素溶液与稻草充分接触；将稻草装入广口瓶中，密封瓶口，保存在避光处，每个处理设置10个广口瓶。氨化时间为28 d，平均温度为21.4 ℃，最低温度为7.8 ℃，最高温度为31.3 ℃[6]。氨化处理后的稻草质地变软，颜色呈棕黄色或浅褐色，有刺鼻的氨味，释放余氨后气味糊香。
精料混合料由玉米55%、麸皮18%、豆粕15%和菜籽粕12%组成。将饲料样品进行风干处理后，粉碎过1 mm网筛备用。
本试验采用双因素试验设计，分别使用未氨化稻草、4%尿素氨化稻草、6%尿素氨化稻草与精料混合料以6种比例混合，其中精料∶ 粗料为：0∶ 100、20∶ 80、40∶ 60、60∶ 40、80∶ 20、100∶ 0，配制成试验日粮，其营养水平见表1。每种日粮设置12个重复，同时设置3个空白。
按照Menke等[7]的方法进行体外培养。使用内径为32 mm、长为200 mm、最大刻度为100 mL的玻璃注射器作为发酵容器，以能够精确控温(±0.05 ℃)的水浴锅作为控温装置。准确称取0.200 0 g饲料样品送入玻璃注射器前端。每种饲料样品使用10支注射器作为平行，每批发酵饲料样品设置3个不加饲料样品的注射器作为空白对照。瘤胃液供体牛在进行预饲15 d以后，于早晨饲喂后2 h，分别从2头牛瘤胃中采集250 mL瘤胃液，经4层纱布过滤，置于保温瓶中，并且混合均匀。量取600 mL人工唾液与300 mL瘤胃液以2∶ 1的体积比混合，然后置于39 ℃水浴锅中保温， 并持续通入二氧化碳气体。每支注射器吸取30 mL混合液，并置于39 ℃水浴锅中培养发酵48 h。
培养发酵至48 h后，记录玻璃注射器活塞所在位置读数，并收集5 mL气体样品用于分析CH4产量，同时迅速将发酵液完全转移到50 mL的离心管中，用pH计测定发酵液的pH，然后将离心管放于冰水中终止发酵。将发酵液在3 500×g下离心15 min，取4 mL上清液与1 mL质量浓度为25%的偏磷酸溶液，混合均匀后冷冻保存，用于测定VFA产量，上机测定前需解冻后将样品再次离心(5 000×g，15 min)。
应用气相色谱仪(TP-2060T，北京北分天普仪器技术有限公司)测定气体成分浓度。色谱条件为：TCD检测器，TDX-01填充柱，1 m×3 mm×2 mm，柱温70 ℃，检测器温度100 ℃，载气为氩气，载气流速为30 mL/min，进样量1 mL。标准气体组成为：26.796%CH4，65.300% 二氧化碳，0.605%氧气，7.100%氮气，0.199%氢气。发酵液中VFA的浓度用气相色谱仪(TP-2060F，北京北分天普仪器技术有限公司)测定。色谱条件：FID检测器，PEG-20M+H3PO4玻璃填充柱，柱温120 ℃，检测器温度220 ℃，以氩气作为载气，流速30 mL/min，由氢气发生器提供氢气，流速30 mL/min，空气流速300 mL/min，进样量2 μL。VFA标准液组成为：乙酸42.0 mmol/L，丙酸32.1 mmol/L，异丁酸2.0 mmol/L，丁酸 14.0 mmol/L，异戊酸7.0 mmol/L，戊酸3.0 mmol/L， 2-乙基丁酸4.0 mmol/L。
 | 表1 试验日粮的营养水平(干物质基础)
Table 1 Nutrient levels of experimental rations (DM basis) %
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各组总产气量及CH4、TVFA、乙酸、丙酸和丁酸产量按以下公式计算：
Y样品=(Y培养液-Y空白)/DM。式中：Y样品为样品48 h产气量(mL/g DM)或TVFA产量(μmol/g DM)；Y培养液为培养液48 h产气量(mL/g DM)或TVFA产量(μmol/g DM)；Y空白为空白组48 h产气量(mL/g DM)或TVFA产量(μmol/g DM)；DM为饲料样品干物质含量(g)。
日粮组合效应值的估算方法参照Zhao等[8]，计算公式如下：
组合效应=实测值-加权估算值；
加权估算值= [稻草实测值×稻草配比(%)]+[精料混合料实测值×精料混合料配比(%)]。
式中：实测值为实际测定的混合料培养发酵指标。
采用Excel 2003软件对试验数据进行整理与初步统计，应用SAS 9.1统计分析软件中的Factorial ANOVA对各组处理数据进行方差分析和Duncan氏法多重比较，对组合效应估算值进行t检验，其中方差分析中因子是氨化稻草水平和日粮精料/粗料，水平分别为稻草的3个尿素氨化水平和6种日粮精料/粗料。统计分析模型为：
Yij=μ+αi+βj+εij。式中：Yij表示观测值；μ表示所有观测值的平均值；αi表示尿素氨化稻草第i水平的处理效果(i=1,2,3)；βj表示日粮精料/粗料第j水平的处理效果(j=1,2,3,4,5,6)；εij表示随机误差。
从表2可以看出，当日粮精料/粗料为0∶ 100时，4%尿素氨化稻草组和6%尿素氨化稻草组TVFA、乙酸和丁酸的产量均显著高于未氨化稻草组(P＜0.05)。当日粮精料/粗料为60∶ 40时，4%尿素氨化稻草组和6%尿素氨化稻草组乙酸产量显著高于未氨化稻草组(P＜0.05)，4%尿素氨化稻草组丙酸产量显著高于6%尿素氨化稻草组和未氨化稻草组(P＜0.05)。TVFA、乙酸和丙酸产量随着日粮中精料比例增加而显著增加(P＜0.05)，乙酸/TVFA和乙酸/丙酸都随着日粮精料比例增加而显著下降(P＜0.05)。
由表3可知，当日粮精料/粗料为0∶ 100时，4%尿素氨化稻草组和6%尿素氨化稻草组48 h总产气量显著高于未氨化稻草组(P＜0.05)，当日粮精料/粗料为40∶ 60时，4%尿素氨化稻草组48 h总产气量显著高于未氨化稻草组(P＜0.05)，6%尿素氨化稻草组48 h总产气量在一定程度上高于未氨化稻草组(P＞0.05)，总产气量随着精料比例增加而显著增加(P＜0.05)。当精料/粗料为40∶ 60时，4%尿素氨化稻草组和6%尿素氨化稻草组CH4产量显著高于未氨化稻草组(P＜0.05)，且4%尿素氨化稻草组CH4产量在一定程度上高于6%尿素氨化稻草组(P＞0.05)，CH4产量随着精料比例增加而显著增加(P＜0.05)。CH4/总产气量在各试验组间差异均不显著(P＞0.05)。当日粮精料/粗料为0∶ 100时， 未氨化稻草组总产气量/TVFA和CH4/TVFA均显著高于4%尿素氨化稻草组和6%尿素氨化稻草组(P＜0.05)。精料/粗料为100∶ 0组pH显著低于0∶ 100组(P＜0.05)。
从表4可以看出，总产气量的组合效应值在4%尿素氨化稻草组精料/粗料为40∶ 60时最高。当日粮精料/粗料为40∶ 60时，4%尿素氨化稻草组CH4产量组合效应值显著高于未氨化稻草组(P＜0.05)，并在一定程度上高于6%尿素氨化稻草组(P＞0.05)。CH4/总产气量的组合效应值在精料/粗料为40∶ 60时变化规律与CH4产量的组合效应值相似。4%尿素氨化稻草组总产气量/TVFA和CH4/TVFA产生负的组合效应。
| 表2 不同尿素氨化水平的稻草及精料/粗料对体外培养VFA成分的影响
Table 2 Effects of different urea ammoniation levels of rice straw and concentrate to roughage ratios on VFA composition in in vitro incubation
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| 表3 不同尿素氨化水平的稻草及精料/粗料对体外培养气体成分的影响
Table 3 Effects of different urea ammoniation levels of rice straw and concentrate to roughage ratios on gas composition in in vitro incubation
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反刍动物瘤胃发酵所产生的VFA约占进入机体代谢的碳流量的2/3，是反刍动物赖以生存，保持正常生长、泌乳和繁殖的主要能源，可提供反刍动物总能量需要量的70%~80%[9]。因此，VFA产量是瘤胃发酵的主要指标之一。瘤胃发酵类型及VFA产量与日粮精料/粗料有关。高精料日粮中淀粉含量高，瘤胃淀粉分解菌占优势，丙酸和乳酸产量提高，形成丙酸发酵，乙酸/丙酸比值降低[9]。随着精料比例增加，本试验3种尿素水平氨化稻草组的TVFA产量逐渐增加。这可能是因为随着混合日粮中精料比例的增加，精料的非结构性碳水化合物比稻草的结构性碳水化合物含量高，前者更容易被发酵，所以TVFA产量上升[10]。本试验中乙酸和丙酸产量均随着日粮精料比例增加而逐渐增加，但乙酸/丙酸下降。这表明丙酸增加量要高于乙酸增加量，这与大部分研究结果[11, 12]一致。并且随着日粮中氨化稻草水平的提高，乙酸/丙酸增加，乙酸、丙酸和TVFA产量也增加，这说明氨化处理可以提高稻草干物质的降解率，有效提高稻草的可利用性[5, 6]。
体外发酵产气量是评定反刍动物瘤胃发酵的重要指标，它可综合反映饲料的可发酵程度,代表了瘤胃微生物活动的总体趋势，是反映饲料可利用性的综合指标之一。本试验结果表明，48 h总产气量氨化组高于未氨化组，这可能是因为尿素氨化处理破坏了稻草细胞壁的内外结构，从而提高了稻草的消化性[13]。本试验中随着日粮中精料比例的提高，总产气量也随之增加。这可能是因为精料中易发酵的碳水化合物含量较高，提供了瘤胃微生物发酵所需的可利用能，促进了瘤胃微生物的繁殖[10]。
反刍动物瘤胃中的CH4是由产甲烷菌利用二氧化碳、氢气和乙酸等为底物，经一系列酶促反应合成的产物。瘤胃发酵过程中，生成丙酸需要消耗氢气，而生成乙酸会产生氢气，因此，乙酸的生成会增加CH4的产量，这说明CH4的排放量与乙酸/丙酸呈反比[14]，而VFA的产生与日粮精料/粗料有关，一般而言，纤维分解菌易于产生乙酸，而淀粉分解菌更易产生丙酸[2]。由本试验结果可以看出，3种尿素氨化组间，CH4产量随着日粮中精料比例增加而逐渐增加，Romos等[15]和Martinez等[16]也得出了相似的结论。这与先前一些体内试验的研究[17, 18]相反。一般来说，日粮精料比例增加导致CH4产量下降主要是因为瘤胃发酵环境的改变和pH的降低，当体外发酵液pH低于6.3时，产甲烷菌的活性显著降低，CH4产量会急剧下降[19]。本试验各组48 h发酵液pH都高于6.3，这有利于产甲烷菌的生长，并且日粮中一定量的精料有利于瘤胃微生物的繁殖，随着培养底物中有利于产甲烷菌生长的营养物质的增加，产甲烷菌的数量迅速增多[10]，因此CH4产量也随之上升。而随着精料比例增加pH下降不明显，可能是因为混合培养日粮能降低瘤胃pH的变化[16]。
| 表4 不同尿素氨化水平的稻草及精料/粗料对体外培养气体成分和VFA产量组合效应的影响
Table 4 Effects of different urea ammoniation levels of rice straw and concentrate to roughage ratios on associative effects of gas composition and VFA production in in vitro incubation
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本试验中CH4占总产气量的比例相对稳定，这说明随着日粮精料比例增加，气体各成分含量相对增加，但气体占总产气量的相对比例变化不大。而单位VFA产量中的CH4比例(CH4/TVFA)随着精料增加而下降，说明日粮精料比例增加能提高饲料整体的消化能，但相对而言甲烷能的损失量下降。当日粮精料/粗料为0∶ 100时，4%尿素氨化稻草组和6%尿素氨化稻草组CH4产量在一定程度上高于未氨化稻草组，但未氨化稻草组CH4/TVFA显著高于4%尿素氨化稻草组和6%尿素氨化稻草组。这说明尿素氨化处理能提高CH4产量，这与李兵[6]的研究结果一致，但氨化处理后CH4占TVFA的比例下降，说明氨化处理提高饲料整体消化率的同时能相对降低甲烷能的损失。
自Menke等[7]发现气体产量与有机物消化率高度相关以来，体外产气法被众多学者应用于不同种类的饲料间组合效应的研究[20, 21]。Sandoval-Castro等[21]用体外产气法研究了2种粗饲料(L. leucocephala和L. latisiliquum)与精料或干草之间的组合效应，以总产气量为衡量指标，结果表明粗饲料与精料间存在正的组合效应，这与本试验结果相似。本试验中，在未氨化稻草、4%尿素氨化稻草和6%尿素氨化稻草基础料中添加不同比例精料混合料均产生了正的组合效应，即各组的48 h总产气量实测值要高于各组成成分的加权值，并且随着精料比例增加，日粮组合效应不明显，甚至出现抑制情况。这说明日粮精料/粗料对组合效应有显著影响，精料比例较低时可有效提高粗饲料的利用率，但饲喂大量精料会抑制粗饲料的利用，这是因为随着日粮中精料水平提高，快速可发酵碳水化合物数量增加，粗饲料细胞壁成分的消化速率下降，从而使得各种纤维组分(纤维素、半纤维素等)的消化被全面抑制[22]。而且多数学者认为，当日粮中可发酵碳水化合物含量上升时，可致使瘤胃液pH急剧下降，由于底物竞争的影响，纤维分解菌数量下降，它产生的纤维分解酶的数量和活性都会下降，导致了纤维消化水平降低[23]。本试验中，高精料组对48 h总产气量没有负组合效应发生，各组合在经过48 h的培养后pH没有显著变化，可能是由于本研究所使用的体外培养体系的缓冲液缓冲能力较强，培养液中的微生物仍处于最适pH环境下，纤维利用率没有受到影响[24]。各组48 h的CH4产量都产生了正组合效应，并且组合效应值随着精料增加先增加后降低。这可能是因为精料有利于产甲烷菌的生长繁殖，精料比例增加会影响瘤胃pH，降低产甲烷菌活性，从而影响CH4产量[9]。但氨化组中CH4/TVFA均出现负组合效应，这说明氨化处理后CH4占饲料总能的比例下降。
① 4%尿素氨化稻草组和6%尿素氨化稻草组的总产气量、CH4和VFA产量均不同程度地高于未氨化稻草组，并且48 h总产气量、CH4和VFA产量随着日粮精料比例增加而增加。
② 当日粮精料/粗料为40∶ 60时，4%尿素氨化稻草组的可消化性最好，CH4和VFA产量最高，CH4/TVFA最低。
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