动物营养学报  2013, Vol. 25 Issue (8): 1845-1853   PDF (973KB)    
引用本文
鞠九洲, 郭艳丽, 何玉鹏, 秦士贞, 郑琛. 应用Rusitec系统研究壳聚糖对体外瘤胃发酵特性的影响[J]. 动物营养学报, 2013, 25(8): 1845-1853.  
JU Jiuzhou, GUO Yanli, HE Yupeng, QIN Shizhen, ZHENG Chen. Effects of Chitosan on Rumen Fermentation Characteristics: An in Vitro Study Using Rusitec System[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2013, 25(8): 1845-1853.  
应用Rusitec系统研究壳聚糖对体外瘤胃发酵特性的影响
鞠九洲, 郭艳丽 , 何玉鹏, 秦士贞, 郑琛    
甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃省草食动物生物技术重点实验室,兰州 730070
收稿日期：2013-02-18
基金项目：甘肃省草食动物生物技术重点试验室开放基金(GKLAB201002);甘肃农业大学创新基金(GAU-CX1039);甘肃省农业科技创新项目(GNCX-012-44)
作者简介：鞠九洲(1986—),男,辽宁沈阳人,硕士研究生,动物营养与饲料科学专业.E-mail: jujiuzhou@yeah.net
通讯作者：郭艳丽,教授,博士生导师,E-mail: guoyl@gsau.edu.cn
摘要：本试验应用Rusitec系统研究壳聚糖对体外瘤胃发酵特性的影响.发酵体系由400 mL瘤胃液、400 mL缓冲液、70 g瘤胃内容物和20 g饲粮(装于尼龙袋内,精粗比为40:60)组成,采用单因子完全随机设计将Rusitec系统的发酵罐分为4个处理,壳聚糖的添加量分别为0(对照组)、500、1 000、1 500 mg,每个添加量2个罐,重复进行2期试验,即每个处理4个重复,每个重复1个罐,每期预试期7 d,正试期2 d.检测甲烷产量、产气量、挥发性脂肪酸浓度及养分降解率的变化.结果表明:1)与对照组相比,500、1 000、1 500 mg组甲烷产量分别降低了17.71%、31.67%、50.37%,差异显著(P<0.05).2)添加壳聚糖显著降低了各时间点乙酸和丁酸浓度以及乙酸/丙酸(P<0.05),显著提高了丙酸浓度(P<0.05);添加壳聚糖显著降低了总氮、氨态氮、尿素氮浓度(P<0.05),显著提高了微生物氮浓度(P<0.05).3)1 000、1 500 mg组粗蛋白质降解率显著低于对照组(P<0.05).4)甲烷产量,总氮、氨态氮、尿素氮、微生物氮、乙酸、丙酸和丁酸的浓度,乙酸/丙酸以及粗蛋白质降解率与壳聚糖添加量间呈显著的线性关系(P<0.05).由此可知,壳聚糖能改变瘤胃微生物发酵模式,提高发酵液丙酸浓度,降低乙酸浓度,减少甲烷生成,提高能量利用,同时减少蛋白质在瘤胃中的降解.
关键词： Rusitec系统     壳聚糖     甲烷     瘤胃发酵    
Effects of Chitosan on Rumen Fermentation Characteristics: An in Vitro Study Using Rusitec System
JU Jiuzhou, GUO Yanli , HE Yupeng, QIN Shizhen, ZHENG Chen    
College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Gansu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology, Lanzhou 730070, China
Abstract: This experiment was conducted to study the effects of chitosan on in vitro rumen fermentation characteristics using Rusitec system. The fermentation system consisted of 400 mL rumen fluid, 400 mL buffer, 70 g rumen content and 10 g diet (concentrate:roughage=40:60). Fermenters were divided into four treatments by a single-factor completely randomized design, and chitosan supplemental levels of the four treatments were 0 (control group), 500, 1 000 and 1 500 mg, respectively. Two fermenters were used for each chitosan supplemental level, and the experiment consisted of two repeated trials, i.e., and there were four replicates in each treatment and one fermenter per replicate. After a 7-day pre-trial period, fermentation parameters including methane yield, gas production, volatile fatty acid concentration and nutrient degradation rates were determined in a 2-day trial period. The results showed as follows: 1) compared with control group, methane yield in 500, 1 000 and 1 500 mg groups was significantly decreased by 17.71%, 31.67% and 50.37%, respectively (P<0.05). 2) The supplementation of chitosan significantly decreased the concentrations of acetic acid and butyric acid, and acetic acid to acrylic acid ratio (P<0.05), but significantly increased propionic acid concentration (P<0.05); the supplementation of chitosan significantly decreased the concentrations of total nitrogen, ammonia nitrogen and urea nitrogen (P<0.05), but significantly increased microbe nitrogen concentration (P<0.05). 3) Compared with control group, crude protein degradation rate in 1 000 and 1 500 mg groups was significantly decreased (P<0.05). 4) Methane yield, the concentrations of total nitrogen, ammonia nitrogen, urea nitrogen, microbe nitrogen, acetic acid, propionic acid and butyric acid, acetic acid to propionic acid ratio, and crude protein degradation rate were significantly linearly correlated with chitosan supplemental level (P<0.05). In conclusion, chitosan can modify rumen microorganism fermentation pattern, improve propionic acid concentration in fermentation fluid, reduce acetic acid concentration and methane yield, improve energy utilization, and abate degradation of protein in rumen.
Key words: Rusitec system     chitosan     methane     rumen fermentation    

反刍动物瘤胃发酵过程中产生了大量甲烷，在造成饲料能量损失的同时也促进了全球气候变暖。所以，减少反刍动物甲烷的产生和排放对动物生产和环境保护具有双重意义。目前，在反刍动物生产中，被普遍采用的有效的甲烷抑制剂是离子载体，包括莫能菌素、拉沙里霉素和泰勒菌素等，其中使用最广泛的是莫能菌素。然而,随着抗生素在动物生产中所造成的不良影响越来越被人们所重视，其在生产中的应用已日益受到限制,因此,研究和开发具有抑制甲烷产生的绿色饲料添加剂就非常必要。壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基后生成的一种天然来源的碱性多糖,主要来自海生动物，如虾、蟹等的外壳。壳聚糖作为饲料添加剂，在单胃动物上的研究和应用较多，且被证实可提高猪和鸡的生长性能[1]、养分代谢[2, 3]、抗氧化能力[4]、胃肠道环境和免疫功能[2]等，是一种安全、无毒的饲料添加剂。相对而言，有关壳聚糖对反刍动物作用的研究较少。已有的研究结果表明，壳聚糖可促进瘤胃发酵向能量发酵的类型转变,使丙酸浓度增加,乙酸浓度减少,甲烷产量减少[5]，微生物蛋白质的合成和纤维的分解增加[6]，改变瘤胃内菌群结构[7]，提高奶牛生产性能、免疫功能、抗氧化能力，改善后肠道菌群结构[8]，以上研究多采用短期人工瘤胃系统，而采用体外研究长期系统研究壳聚糖对绵羊瘤胃发酵的较少。

所以，本试验采用Rusitec系统(体外研究长期系统)，旨在研究壳聚糖添加量对绵羊体外瘤胃发酵特性的影响,为开发其作为具有降低瘤胃甲烷产量、调控瘤胃内环境的绿色饲料添加剂提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 壳聚糖

壳聚糖:脱乙酰度≥91%，分子式为(C6H11NO4)n，购自上海中秦化学试剂有限公司。

1.2 试验设计

试验采用单因子完全随机设计，Rusitec系统的8个罐分为4个处理，壳聚糖的添加量分别为0(对照组)、500、1 000和1 500 mg，每个处理2个罐，重复进行2期试验，即每个处理4个重复，每个重复1个罐。

1.3 人工瘤胃装置及条件

采用Rusitec人工瘤胃模拟装置(R-S，Shinagawa，日本)。

缓冲液组成为：NaHCO3 9.8 g、Na2HPO4·12H2O 9.3 g、NaCl 0.47 g、KCl 0.57 g、MgSO4·2H2O 0.12 g、CaC12·2H2O 0.04 g，用蒸馏水定容至1 000 mL。

瘤胃液采自6只装有永久性瘤胃瘘管的萨福克和小尾寒羊杂交羯羊,饲粮精粗比为40∶ 60，粗饲料包括苜蓿和小麦秸，精饲料包括玉米、豆粕。基础饲粮组成及营养水平见表1。同时从瘤胃不同部位采集瘤胃内容物。瘤胃液用4层纱布过滤，边过滤边通入CO2，过滤后将所有瘤胃液混合，然后迅速加入事先装有400 mL缓冲液的发酵罐中(每个罐中的有效体积为800 mL)。

瘤胃内容物用尼龙袋分装，每个尼龙袋中装70 g，投入已经将瘤胃液与缓冲液按1∶ 1混合好的8个发酵罐内，整个操作在30 min内完成。

对饲粮(组成与绵羊基础饲粮相同)进行粉碎，过1 mm筛。每个尼龙袋(规格7 cm×13 cm、孔径100 μm)装10 g。于预试期第1天09:00在每个发酵罐中同时投入2袋(即每罐中投入20 g)，然后每48 h更换1袋。

工作条件：缓冲液流量为0.39 mL/min，流出液口筛网孔径为1.2 mm，搅拌机搅拌频率为每分钟4~5次，发酵罐内温度为39 ℃，通入CO2至厌氧环境，参照McDougall[9]的配方，缓冲液与瘤胃液按1∶ 1(各400 mL)添加[10]。

每期试验包括7 d预试期和2 d正试期。于正试期第1天用集气袋收集24 h的产气，记录产气量后转移部分气体到采气袋中以备测定甲烷产量。第2天，于发酵后0、3、6、9、12 h经取样口采集发酵液，装入加有1滴饱和HgCl2溶液的样品管中，立即测定pH，然后于-20 ℃冷冻保存，以备其他发酵产物的测定。收集发酵罐内尼龙袋食糜，于65 ℃烘箱烘干，粉碎，待测粗蛋白质降解率和中性洗涤纤维降解率。

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (air-dry basis) %
1.4 测定指标及方法

产气量：用气体流量计(DC-1，Shinagawa，日本)测定。

甲烷产量：用气相色谱仪测定(6890N，Agilent，美国)。色谱柱：AT.SE-30毛细管柱(中国科学院兰州化学物理研究所)。色谱条件：进样口温度100 ℃，氮气流量1.7 mL/min，分流比为15∶ 1，进样量2 μL，恒温模式(100 ℃ 3 min)，离子火焰检测器(FID)250 ℃，FID空气、氢气和氮气流量分别为450、40、45 mL/min。

挥发性脂肪酸(VFA)用气相色谱仪测定(6890N，Agilent，美国)。色谱柱为HP19091N-213毛细管柱(Agilent，美国)。色谱条件：进样口温度220 ℃，氮气流量2.0 mL/min，分流比为40∶ 1，进样量0.6 μL，程序升温模式(120 ℃，3 min然后10 ℃/min至180 ℃，保持1 min)，FID 250 ℃，FID空气、氢气和氮气流量分别为450、40、45 mL/min。

pH：用酸度计(pHS-3C，上海雷磁仪器厂)测定。

总氮：用凯氏定氮法测定[11]。

氨态氮(NH3-N)：按冯宗慈等[12]改进的比色法测定。

尿素氮：用二乙酰-肟法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

微生物氮计算公式如下：

微生物氮浓度(mg/dL)=总氮浓度(mg/dL)-氨态氮浓度(mg/dL)-尿素氮浓度(mg/dL)。

饲粮及残渣中粗蛋白质和中性洗涤纤维含量分别按照杨胜[11]和Van Soest等[13]的方法测定。然后按下式计算粗蛋白质和中性洗涤纤维降解率:

养分降解率(%)=[(饲粮养分含量-瘤胃食糜养分含量)/饲粮养分含量]×100。

1.5 数据统计分析

试验数据采用Excel进行整理，然后采用SPSS 16.0统计软件的one-way ANOVA进行单因素方差分析，显著性水平为0.05，差异显著时用Duncan氏法进行多重比较。

2 结 果
2.1 壳聚糖添加量对体外瘤胃发酵甲烷产量的影响

由表2可见，添加壳聚糖显著降低了发酵的甲烷产量(P<0.05)，3个壳聚糖组分别比对照组降低了17.71%、31.67%、50.37%，且1 500 mg组比500、1 000 mg组有进一步降低，差异显著(P>0.05)；随壳聚糖添加量增加，甲烷产量呈显著的线性降低(P<0.05)。添加壳聚糖对产气量无显著影响(P>0.05)。

表2 壳聚糖添加量对体外瘤胃发酵甲烷产量的影响

Table 2 Effects of chitosan supplemental level on methane production after rumen fermentation in vitro mL/g


2.2 壳聚糖添加量对体外瘤胃发酵特性的影响

由表3可见，壳聚糖添加量对发酵液pH无显著影响(P＞0.05)。

由表4可见，与对照组相比，添加壳聚糖显著降低了不同时间点乙酸浓度(P<0.05)；且在3、6、9、12 h均为1 000、1 500 mg组比500 mg组进一步显著降低(P<0.05)，而1 000和1 500 mg组间无显著差异(P>0.05)。添加壳聚糖显著提高了不同时间点丙酸浓度(P<0.05)；在0、3、6、9 h，1 000和1 500 mg组均显著高于对照组(P<0.05)；在12 h，1 500 mg组显著高于500和1 000组(P<0.05)，对照组、500和1 000 mg组间无显著差异(P<0.05)。添加壳聚糖显著降低了0、6、9 h的乙酸/丙酸(P<0.05)；在0 h，1 500 mg组显著低于对照组(P<0.05)；在6、9 h，1 000、1 500 mg组均显著低于对照组(P<0.05)，而与500 mg组无显著差异(P>0.05)。添加壳聚糖显著降低了丁酸浓度(P<0.05)；在0、9 h，500 mg组显著低于对照组(P<0.05)，500和1 000 mg组无显著差异(P>0.05)，1 500 mg组比500和1 000 mg组进一步显著降低(P<0.05)；在3、6、12 h，1 000 mg组显著低于对照组和500 mg组(P<0.05)，1 500 mg组较1 000 mg组进一步显著降低(P<0.05)。总挥发性脂肪酸除了1 000 mg组在9 h显著低于对照组(P<0.05)外，其余各壳聚糖组在各时间点与对照组均无显著差异(P＞0.05)。

乙酸、丙酸、丁酸浓度及乙酸/丙酸与壳聚糖添加量间均呈显著的线性关系(P<0.05)。


表3 壳聚糖添加量对体外瘤胃发酵发酵液pH的影响

Table 3 Effects of chitosan supplemental level on fermentation fluid pH after rumen fermentation in vitro


表4 壳聚糖添加量对体外瘤胃发酵挥发性脂肪酸浓度的影响

Table 4 Effects of chitosan supplemental level on VFA concentrations after rumen fermentation in vitro



由表5可见，各时间点，各壳聚糖组总氮、氨态氮和尿素氮浓度均低于对照组，微生物氮浓度均高于对照组。总氮浓度随壳聚糖添加量增加而降低，除6 h 500 mg组与对照组差异不显著(P>0.05)外，其他各时间点，各壳聚糖组均显著低于对照组(P<0.05)。氨态氮浓度变化趋势与总氮浓度相似。尿素氮浓度随壳聚糖添加量增加而降低，在0、3、6和9 h，各壳聚糖组均显著低于对照组(P<0.05)，1 000和1 500 mg组在6、9 h较500 mg组进一步显著降低(P<0.05)，1500 mg组在3 h显著低于500 mg组(P<0.05)。微生物氮浓度随壳聚糖添加量增加而升高，不同时间点均为1 000和1 500 mg组显著高于对照组(P<0.05)，1 500 mg组在9 h较1 000 mg组进一步显著提高(P<0.05)。

总氮、氨态氮、尿素氮和微生物氮浓度均与壳聚糖添加量间呈显著的线性关系(P<0.05)。

2.3 壳聚糖添加量对体外瘤胃发酵养分降解率的影响

由表6可见，添加壳聚糖显著降低了粗蛋白质降解率(P<0.05)，对中性洗涤纤维降解率没有显著影响(P＞0.05)。就粗蛋白质降解率而言，1 000和1 500 mg组显著低于与对照组(P<0.05)，1 500 mg组较1 000 mg组进一步显著降低(P<0.05)。

粗蛋白质降解率与壳聚糖添加量间呈显著的线性关系(P<0.05)。

3 讨 论

相对于体外产气法等短期人工瘤胃系统，Rusitec系统可以使发酵在比较长的时间(几周)内维持稳定状态，以研究添加剂对瘤胃发酵的长期影响[14]，从而更接近于体内试验，更能说明问题。

反刍动物瘤胃发酵产生大量的甲烷，同时产生大量的挥发性脂肪酸，瘤胃中乙酸与丙酸浓度是影响甲烷产量的主要因素。当瘤胃发酵有高比例乙酸产生时，甲烷产量随之提高；而当丙酸比例增高时，甲烷产量降低[15]。本试验发酵液中乙酸、丙酸浓度，乙酸/丙酸比以及甲烷产量的结果符合上述一般理论。同时也从长期体外试验的结果说明，壳聚糖有利于饲粮朝着丙酸发酵型进行，从而提高饲料的能量利用效率，减少能量损失和改善环境污染。与Goiri等 的结果相似。丁酸发酵也产生氢，也是产生甲烷的前体，但其量少于乙酸[15]。本试验中丁酸浓度在各组间的变化与以上理论一致。另外，本试验中1 500 mg组甲烷产量、乙酸和丁酸浓度显著低于500和1 000 mg组，丙酸浓度显著高于500、1 000 mg组，说明在有利于能量发酵和利用方面添加1 500 mg效果最好。综合本试验与Goiri等[17]的长期人工瘤胃系统试验的结果似乎可以说明，壳聚糖对瘤胃甲烷和挥发性脂肪酸的影响趋势不受饲粮精粗比(本试验为40∶ 60，Goiri等[17]的试验为50∶ 50)、饲粮组成(本试验精饲料为玉米和豆粕，粗饲料为苜蓿干草和小麦秸；Goiri等[17]的试验精饲料为小麦、玉米、玉米粉、小麦干酒糟及其可溶物、豆粕、甜菜糖蜜等，粗饲料未苜蓿干草)及瘤胃液来源(不同的绵羊品种，粗饲料为苜蓿干草)的影响。但确切结论还需要做更多、更有针对性的研究才能得出。


表5 壳聚糖添加量对体外瘤胃发酵氮浓度的影响

Table 5 Effects of chitosan supplemental level on nitrogen concentration after rumen fermentation in vitro mg/dL



表6 壳聚糖添加量对体外瘤胃发酵养分降解率的影响

Table 6 Effects of chitosan supplemental level on nutrient degradation rates after rumen fermentation in vitro %



产气量是反映饲料可发酵程度的指标，是瘤胃微生物对饲料养分降解活动的总体表现。产气量越大，瘤胃微生物的活性越高[18]。有关壳聚糖对瘤胃产气量的研究结果不一致。本试验中添加壳聚糖后产气量没有显著变化。与田雨佳等[19]用体外批次培养法研究壳聚糖对奶牛瘤胃发酵的结果一致。而Goiri等[17]用同样的系统却得出壳聚糖显著降低了发酵液的产气量。李魏等[6]用体外产气法研究了壳聚糖对山羊瘤胃发酵的影响，得出饲粮中添加0.09%和0.12%的壳聚糖显著提高了24 h的累积产气量。这些不同可能与人工瘤胃系统、壳聚糖来源、壳聚糖的添加方法、瘤胃液来源、精粗比或饲粮组成等不同有关，具体原因还需要进一步研究。

评定瘤胃液pH是否正常通常是从是否有利于瘤胃内纤维素分解菌的活动来考虑，纤维素分解菌降解纤维类物质的适宜pH一般大于6.3，当瘤胃液pH低于6.3时，能部分抑制纤维素分解菌的作用；而当pH进一步下降至6.0以下时，能完全抑制纤维素分解菌的活力[20]。本试验中各组发酵液的pH在6.79～6.92之间波动，均有利于纤维素分解菌的正常活动。各组间没有显著差异的结果同时也说明，壳聚糖对瘤胃微生物尤其是纤维素分解菌的活动环境没有不利影响，与产气量的结果一致。与Goiri等[17]、田雨佳等[19]、任海军[21]的结果相似。

瘤胃液总氮主要包括饲粮中粗蛋白质降解和再循环进入的氨态氮、尿素氮和微生物氮等。本试验中，随壳聚糖添加量的增加，发酵液总氮和氨态氮浓度显著降低，可能是壳聚糖抑制了蛋白质的降解所致，本试验中粗蛋白质降解率随壳聚糖添加而降低的结果支持了这一论点。这一结果同时也说明，壳聚糖在一定程度上对饲料中的蛋白质起到了保护作用，同时也避免了瘤胃微生物对蛋白质的降解和微生物蛋白质合成过程中的能量消耗。本试验设计3个不同添加量的结果说明，在保护饲粮蛋白质上，1 500 mg组的效果最好。Goiri等[17]用同样的系统得到了类似结果，但在他们的试验结果中高、低添加量之间没有显著差异。而田雨佳等[19]、任海军[21]、国林等[22]却得出壳聚糖对发酵液氨态氮浓度没有影响。所以，壳聚糖对饲粮蛋白质所发挥的保护作用以及发挥作用的最适添加量尚需进行更多的研究。

据报道，瘤胃中尿素酶的活性很高，对尿素的降解能力是微生物利用氨能力的4倍，故瘤胃中尿素氮的浓度较低[23]。本试验中各组瘤胃液尿素氮浓度均较低，变化范围为0.22～0.37 mg/dL，且随着壳聚糖添加量的增大尿素氮浓度显著降低，这一结果是否为壳聚糖促进了尿素酶的活性所致，由于未见到相关报道，而本试验中也没有进行尿素酶活性的测定，所以不能做确切定论。

本试验中，微生物氮是按照经计算得出的。添加壳聚糖后对总氮的降低没有氨态氮和尿素氮的降低幅度大，从而造成微生物氮的浓度显著提高。当然，也可能是由于壳聚糖促进了瘤胃微生物的生长所致。李魏等[6]等也得出壳聚糖提高了瘤胃微生物氮的相似结果。

在进行瘤胃甲烷调控剂的研究时，往往同时考虑的是其不能够降低瘤胃微生物对纤维的降解率，否则就影响了该种添加剂的应用效果和应用前景。本试验中，添加2种添加量的壳聚糖对中性洗涤纤维降解率没有显著影响的结果说明，壳聚糖可以作为一种有效的瘤胃甲烷抑制剂使用。但其他相关研究得出了不同的结果。Goiri等[17]用同样的人工瘤胃系统得出，添加1 500 mg的壳聚糖降低了中性洗涤纤维降解率。而李魏等[6]等用体外产气法却得出饲料中添加0.12%的壳聚糖显著提高了中性洗涤纤维降解率。所以，确切的结论还需做进一步的研究，尤其是从瘤胃微生物的角度进行。

综合本试验各指标的统计结果，添加1 500 mg的壳聚糖效果最好。但因为试验中未设更高的添加量，所以，发挥最佳效果的壳聚糖添加量还需做更多的研究才能确定。

4 结 论

壳聚糖能改变瘤胃微生物发酵模式，提高发酵液丙酸浓度，降低乙酸浓度，减少甲烷生成，提高能量利用，同时减少蛋白质在瘤胃中的降解。

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