动物营养学报  2013, Vol. 25 Issue (8): 1854-1859   PDF (957KB)    
引用本文
林鑫, 毛述宏, 杨阳, 林仕梅, 罗琳. 饲料中添加抗菌肽对锦鲤生长、非特异性免疫力和抗病力的影响[J]. 动物营养学报, 2013, 25(8): 1854-1859.  
LIN Xin, MAO Shuhong, YANG Yang, LIN Shimei, LUO Lin. Effects of Antimicrobial Peptides Supplementation on Growth, Non-Specific Immunity and Disease Resistance of Koi (Cyprinus carpio koi)[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2013, 25(8): 1854-1859.  
饲料中添加抗菌肽对锦鲤生长、非特异性免疫力和抗病力的影响
林鑫1,2, 毛述宏1,2, 杨阳1,2, 林仕梅1,2 , 罗琳3    
1. 西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室,重庆 400716;
2. 西南大学动物科技学院, 重庆 400716;
3. 北京市水产科学研究所,北京 100068
收稿日期：2013-05-06
基金项目：北京市科学技术委员会项目(项目编号:D09060500430000)
作者简介：林 鑫(1989—),女,山东烟台人,硕士研究生,从事水产动物营养与饲料研究.E-mail: lxily_521@126.com
通讯作者：林仕梅,副教授,硕士生导师,E-mail: linsm198@163.com
摘要：本试验旨在研究饲料中添加抗菌肽对锦鲤生长、非特异性免疫力和抗病力的影响.在基础饲粮中分别添加0(对照)、75、150和225 mg/kg的天蚕素抗菌肽,配制成4种等氮(粗蛋白质32%)等能(总能14.8 MJ/kg)的试验饲料,并分别饲喂平均体重为(10.30±0.01) g的锦鲤8周.每组设4个重复,每个重复35尾鱼.结果表明:150 mg/kg组锦鲤的末重和特定生长率(SGR)均显著高于对照组和225 mg/kg组(P<0.05),而与75 mg/kg组差异不显著(P>0.05).锦鲤的饲料系数(FCR)、蛋白质效率(PER)和摄食量(FI)组间差异不显著(P>0.05).225 mg/kg组锦鲤的血清过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和碱性磷酸酶(AKP)活性显著高于对照组和75 mg/kg组(P<0.05),与150 mg/kg组差异不显著(P>0.05).各组锦鲤的血清溶菌酶(LZM)活性无显著差异(P>0.05).用维氏气单胞菌攻毒后,各抗菌肽添加组锦鲤的累积死亡率显著低于对照组(P<0.05).由此可见,饲料中添加抗菌肽可以增强锦鲤的非特异性免疫力和抗病力,进而促进其生长;锦鲤饲料中天蚕素抗菌肽的适宜添加量为150 mg/kg.
关键词： 抗菌肽     锦鲤     生长     非特异性免疫力     抗病力    
Effects of Antimicrobial Peptides Supplementation on Growth, Non-Specific Immunity and Disease Resistance of Koi (Cyprinus carpio koi)
LIN Xin1,2, MAO Shuhong1,2, YANG Yang1,2, LIN Shimei1,2 , LUO Lin3    
1. Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development, Ministry of Education, Chongqing 400716, China;
2. College of Animal Science and Technology, Southwest University, Chongqing 400716, China;
3. Beijing Fisheries Research Institute, Beijing 100086, China
Abstract: This experiment was conducted to evaluate the effects of antimicrobial peptides (ABPs) supplementation on growth, non-specific immunity and disease resistance of koi (Cyprinus carpio koi). Four isonitrogenous (crude protein level was 32%) and isoenergetic (gross energy was 14.8 MJ/kg) experimental diets were formulated by supplementing with 0 (control), 75, 150 and 225 mg/kg ABPs—cecropin, respectively. Each diet was randomly fed one group of fish with an initial average weight of (10.30±0.01) g for 8 weeks. Each group had 4 replicates with 35 fish per replicate. The results showed as follows: the final body weight, specific growth rate (SGR) of koi in 150 mg/kg group were significantly higher than those in control group and 225 mg/kg group (P<0.05), whereas there were no differences between 75 and 150 mg/kg groups (P>0.05). No significant differences were found in feed conversion ratio (FCR), protein efficiency ratio (PER) and feed intake (FI) of koi among all groups (P>0.05). Serum alkaline phosphatase (AKP), catalase (CAT) and superoxide dismutase (T-SOD) activities in 225 mg/kg group were significantly higher than those in control group and 75 mg/kg group (P<0.05), whereas there were no differences between 150 and 225 mg/kg groups (P>0.05). There was no difference in serum lysozyme (LZM) activity of koi among all groups (P>0.05). Moreover, the ABPs supplementation groups also exhibited a significant decrease in cumulative mortality compared with control group when challenged with Aeromonas veronii (P<0.05). It is concluded that ABPs supplementation can enhance the non-specific immunity and disease resistance, and then promote the growth of koi. And the optimum supplemental level of cecropin in the diet of koi is 150 mg/kg.
Key words: ABPs     koi (Cyprinus carpio koi)     growth     non-specific immunity     disease resistance    

锦鲤(Cyprinus carpio koi)是深受人们喜爱的观赏鱼之一，在我国养殖规模逐年扩大，但病害的频发制约了观赏鱼养殖产业的发展[1]。为防治病害，养殖中通常使用抗生素、疫苗或免疫增强剂，由于抗生素的耐药性以及疫苗的价格和使用不便等因素致使其应用受限[2, 3]，免疫增强剂因使用方便、价格合理而成为目前有效控制鱼病的一种重要手段。抗菌肽(antimicrobial peptides， ABPs)作为一种新型免疫增强剂，不仅具有广谱的抗细菌活性，还具有高效的抗真菌、病毒和原虫的活性，其抗菌机理独特，不易产生耐药性，同时能提高机体的免疫力[4, 5]。目前，有关抗菌肽的应用研究主要集中在畜[6]、禽[7, 8]和对虾[9]养殖中，而应用于鱼类养殖的研究[10, 11]较少。为此，本试验以锦鲤为试验对象，在实用饲料配方的基础上添加不同剂量的天蚕素抗菌肽(cecropin)，研究其对锦鲤生长性能和免疫相关酶活性的影响，并确定饲料中抗菌肽的最适添加量，为抗菌肽在锦鲤饲料中的合理应用提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

以鱼粉(含粗蛋白质645 g/kg)、豆粕(含粗蛋白质430 g/kg，浸提法制备)、菜籽粕(含粗蛋白质370 g/kg，浸提法制备)和棉籽粕(含粗蛋白质420 g/kg，浸提法制备)作为蛋白质源，以豆油和米糠作为脂肪源，配制基础饲料，在此基础上分别添加0(对照)、75、150和225 mg/kg天蚕素抗菌肽(由国家饲料工程技术研究中心研制，北京中农颖泰生物技术有限公司生产)配制成4种试验饲料。各饲料原料粉碎过40目筛，采取逐级稀释法混合均匀，制成粒径为2.0 mm的硬颗粒饲料，风干后放入4 ℃冰箱中保存备用。

表1 基础饲料组成及营养水平

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet g/kg


1.2 饲养管理

试验鱼选用当年培育的锦鲤，取自重庆北碚区鱼种场，驯食适应环境10 d后，选取体质健壮、规格整齐的锦鲤 560尾，随机分成4组，每组设4个重复，每个重复35尾鱼。每组试验鱼随机投喂1种试验饲料，在室内淡水循环玻璃水族缸(有效体积为300 L)中饲养8周，日投喂率为体重的4%～6%，每天08：30、12：30和17：30各投喂1次。养殖水源为曝气自来水，试验期间定时对水质进行监控，养殖全程水温为(27.6±2.2) ℃，pH为7.2±0.4，溶解氧>6.3 mg/L，氨氮<0.48 mg/L，亚硝酸盐氮<0.06 mg/L。

1.3 样品采集与制备

饲养试验结束后，禁食24 h后称重并计数。每缸随机取5尾鱼于尾静脉取血，将血液样品置4 ℃冰箱过夜，于4 ℃条件下以6 000 r/min离心10 min，收集血清，-20 ℃保存备用。

1.4 攻毒试验

取样后，使试验鱼稳定7 d(期间各组仍投喂对应试验饲料)后，每缸随机取8尾鱼(每组32尾)进行维氏气单胞菌攻毒试验。攻毒期间各组均投喂基础饲料。将培养好的维氏气单胞菌稀释到6×108 CFU/mL，按照每尾注射0.6 mL的剂量将维氏气单胞菌注射到锦鲤的背鳍基部。注射24 h后开始记录死亡鱼的数量和时间，共10 d，计算累积死亡率。攻毒试验期间，记录死亡和未死亡鱼的病症。

1.5 指标测定

血清溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定。LZM的活性单位定义为每分钟吸光值减少0.001所需血清的量为1个活性单位(U)；AKP的活性单位定义为100 mL血清在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg酚为1个金氏单位；CAT的活性单位定义为每毫升血清每秒钟分解1 μmol过氧化氢(H2O2)的量为1个活性单位(U)；T-SOD的活性单位定义为每毫升反应液中超氧化物歧化酶(SOD)抑制率大50%时所对应的SOD量为1个活性单位(U)。

1.6 计算公式

特定生长率(specific growth rate,SGR,%/d)=100×[ln末重(g)-ln初重(g)]/试验天数(d)；

饲料系数(feed conversion ratio,FCR)=总干物质摄食量(g)/鱼体总增重(g)；

蛋白质效率(protein efficiency rate,PER,%)=100×[末重(g)-初重(g)]/[总干物质摄食量(g)×蛋白质含量]；

摄食率(feed intake,FI,102 g/d)=100×总干物质摄食量(g)×2/{[末重(g)+初重(g)]×试验天数(d)}；

成活率(survival ratio,SR,%)=100×终末鱼尾数(尾)/初始鱼尾数(尾)。

1.7 数据处理与分析

数据均以平均值和标准误表示，采用SPSS 17.0对所得数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若差异达到显著性水平，则进行Tukey多重比较，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析
2.1 饲料中添加抗菌肽对锦鲤生长的影响

由表2可知，150 mg/kg组锦鲤的末重和SGR均显著高于对照组和225 mg/kg组(P＜0.05)，与75 mg/kg组差异不显著(P>0.05)。各组锦鲤的FCR、PER和FI无显著差异(P>0.05)。试验期间，各组锦鲤的成活率均为100%。

表2 饲料中添加抗菌肽对锦鲤生长性能的影响

Table 2 Effects of ABPs supplementation on growth performance of koi (Cyprinus carpio koi)


2.2 饲料中添加抗菌肽对锦鲤非特异性免疫力的 影响

由表3可知，150、225 mg/kg组锦鲤的血清CAT和T-SOD活性显著高于对照组和75 mg/kg组(P<0.05)。225 mg/kg组锦鲤的血清AKP活性显著高于对照组和75 mg/kg组(P<0.05)，而与150 mg/kg组差异不显著(P>0.05)。各组锦鲤的血清LZM活性无显著差异(P>0.05)。

表3 饲料中添加抗菌肽对锦鲤血清非特异性免疫指标的影响

Table 3 Effects of ABPs supplementation on serum non-specific immune indices of koi (Cyprinus carpio koi)


2.3 饲料中添加抗菌肽对锦鲤抗病力的影响

由表4可知，维氏气单胞菌攻毒后，对照组锦鲤的累积死亡率为68.7%，显著高于75(50.3%)、150(47.5%)和225 mg/kg组(44.8%) (P<0.05)，而75、150和225 mg/kg组间累积死亡率无显著差异(P>0.05)。

表4 维氏气单胞菌攻毒后锦鲤的累积死亡率

Table 4 Cumulative mortality of koi (Cyprinus carpio koi) after challenged with Aeromonas veronii


3 讨 论
3.1 饲料中添加抗菌肽对锦鲤生长的影响

本试验结果表明，在饲料中添加抗菌肽能够促进锦鲤的生长，这与在罗非鱼[10]、鲤鱼[11]上的研究结果一致。同样，在饲料中添加抗菌肽也能够改善家禽、家畜的生长效果。研究认为，抗菌肽能够提高肉鸭血清胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)的水平[8]，抑制肉鸡肠道有害菌的生长，改善肠道黏膜的形态结构，提高养分利用率[12]，从而促进动物的生长；复合抗菌肽牛乳铁蛋白活性肽(bovine lactoferricin-lactoferrampin)还能提高仔猪血清免疫球蛋白(Ig)A、IgG和IgM的水平，减少仔猪腹泻的发生，继而提高仔猪的日增重[13]。但也有研究发现抗菌肽对花鲈没有促生长作用[14]。以上结果表明抗菌肽的促生长作用机制因动物品种差异而有所不同。本试验结果还表明，饲料中添加150 mg/kg天蚕素抗菌肽对锦鲤的促生长效果最佳，这与在罗非鱼[10]、鲤鱼[11]上得出的适宜添加量有较大差异，说明动物品种以及抗菌肽的种类也会影响抗菌肽的适宜添加量。关于抗菌肽对锦鲤的促生长作用机理还有待进一步探讨。

3.2 饲料中添加抗菌肽对锦鲤非特异性免疫力的 影响

非特异性免疫系统是鱼类的基本防御机制，在抗病力上比特异性免疫系统更为重要[15]。LZM是鱼体内重要的非特异性免疫因子，是鱼体生理防御水平的重要标志[16]。鱼体内有天然的抗氧化系统去除自由基，以维持正常的生理功能，其中就包括CAT、T-SOD等抗氧化酶[17]。LZM与抗氧化酶作为机体免疫系统的组成部分，其活性的高低直接反映了机体的非特异性免疫防御能力。本试验结果表明，饲料中添加抗菌肽能够提高锦鲤血清LZM、CAT、T-SOD和AKP活性。已有的研究也证实，抗菌肽能提高鲤鱼血清LZM和补体旁路的活性[11]，增强罗非鱼血清LZM以及肝脏CAT、SOD活性[10]。在饲料中添加抗菌肽同样能提高凡纳滨对虾血清中酚氧化酶(PO)、过氧化物酶(POD)、LZM和AKP的活性和总抗氧化能力(T-AOC)[9]。这些研究表明抗菌肽能提高水产动物机体的非特异性免疫力。在畜禽动物上的研究也发现，抗菌肽可以提高蛋用仔公鸡血液中IgA、IgG、补体3(C3)水平及LZM活性[18]，增强肉兔血清中IgM和C3水平[19]，增强断乳仔猪血清中IgA、IgG水平，同时显著升高血清炎症细胞因子白细胞介素(IL)-1Β和IL-6含量[6]。由此可见，饲料中添加抗菌肽能够改善锦鲤的生长性能可能与增强锦鲤的非特异性免疫力有关，其免疫作用机理还有待深入研究。

3.3 饲料中添加抗菌肽对锦鲤抗病力的影响

鱼类感染致病菌后的死亡率高低可以综合反映鱼类的抗病力及免疫力[20]。大量研究表明，抗菌肽能够有效提高动物对病原菌的抵抗力 。本试验结果发现，饲喂添加抗菌肽饲料的锦鲤感染维氏气单胞菌10 d后的累积死亡率显著降低，充分证实口服抗菌肽可以显著提高锦鲤的抗病能力。目前，水产动物抗菌肽的研究主要集中在分离纯化及抗菌活性等方面[20]，应用于鱼类养殖的研究较少且不深入[10, 14]。研究表明，将重组天蚕素抗菌肽B和天蚕素抗菌肽P1单细胞克隆入契努克鲑鱼(Chinook salmon)胚胎细胞(CHSE-214)中，CHSE-214表达出来的天蚕素抗菌肽对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌和安圭拉弧菌等3种鱼类病原菌有很强的抑制作用[21]。已有研究指出，抗菌肽可以直接作用于病原体的某些成分引起膜破裂[22]，也可以通过调节适应性免疫应答发挥功能[23]，或作为其他效应细胞的趋化因子起作用[24]，继而起到抑菌抗病的作用。目前研究表明，抗菌肽在体内除了能直接杀死病原菌外，还可作为免疫效应因子提高养殖动物的免疫功能[20]。饲料中添加抗菌肽能够显著增强锦鲤的抗病力，这可能与抗菌肽提高LZM和抗氧化酶活性，继而增强锦鲤的非特异性免疫力有关。有关抗菌肽对鱼类的抗病作用机制有待进一步研究。

4 结 论

① 饲料中添加抗菌肽可以增强锦鲤的其非特异性免疫力和抗病力，进而促进其生长。

② 锦鲤饲料中天蚕素抗菌肽的适宜添加量为150 mg/kg。

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