据报道，2007年至2009年我国年均秸秆产量为7.35亿t，其中稻草、玉米秸和麦秸的产量分别为1.99、1.49和1.44亿t[1]。农作物秸秆产量巨大，是反刍动物重要的饲料来源之一[1]。农作物秸秆的粗纤维含量高、粗蛋白质含量低、适口性差。使用未经过加工处理的秸秆饲喂反刍动物，秸秆消化率和采食量一般都较低。因此，提高反刍动物对农作物秸秆的采食量和消化率是反刍动物营养研究的重要目标。
很多研究表明，氨化处理能够有效地提高秸秆的粗蛋白质含量、反刍动物的秸秆采食量[2, 3]以及秸秆干物质、有机物、粗蛋白质和酸性洗涤纤维消化率[4]。因此，在牛羊生产中，秸秆氨化技术得到广泛推广应用。一些研究表明,饲料消化率与瘤胃发酵产气量之间存在显著的正相关关系[5, 6, 7]。利用氨化处理技术提高反刍动物对稻草的消化率，也必然提高氨化稻草的瘤胃发酵产气量，而瘤胃发酵产生的气体主要包括甲烷(CH4)和二氧化碳(CO2)。因此,使用氨化稻草饲喂反刍动物有可能增加温室气体排放量，加重地球的温室效应。而使用氨化稻草饲喂反刍动物对温室气体排放的影响程度如何，尚不清楚。本试验拟研究氨化稻草体外瘤胃发酵CH4、CO2和挥发性脂肪酸(VFA)的产生规律，旨在阐明应用氨化稻草饲喂反刍动物对温室气体排放可能造成的影响。
应用2头12月龄，体重为(300±2) kg，装有永久性瘤胃瘘管的西门塔尔去势公牛作为瘤胃液供体。试验牛的日粮由1.2 kg精料混合料(玉米58%、豆粕20%、小麦麸18%、磷酸氢钙2%、食盐1%、微量元素预混料1%)和5.0 kg羊草组成。日粮被分为相等的2份，分别在07:00和17:00 饲喂。自由饮水。
将风干稻草切短至2~3 cm长。分别称取4个水平的尿素，即2%、4%、6%和8%(尿素/稻草,质量比)和占稻草质量80%的蒸馏水。将尿素溶解于蒸馏水中，制备成不同浓度的尿素溶液。将不同浓度的尿素溶液分别均匀地喷洒在存放于不同塑料盆中的稻草中，并翻动稻草，混合均匀。应用容量为1 L的广口玻璃瓶作为对稻草进行氨化处理的容器。每个处理10个重复，每个重复使用1个玻璃瓶。将稻草装入玻璃瓶并填实，将瓶口密封，放置在平均温度为21 ℃的暗室中。对稻草进行氨化处理28 d后，打开玻璃瓶口，将氨化稻草取出，放置在65 ℃的烘箱中，烘干24 h，然后使用饲料粉碎机，通过孔径为1 mm网筛将饲料样品粉碎，放入样品瓶中保存备用。
未处理稻草作为对照(处理Ⅰ)，处理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的尿素水平分别为2%、4%、6%和8%。
按照Menke等[8]的方法配制培养液和进行体外瘤胃发酵。缓冲液混合液的配制方法为：将400 mL蒸馏水、200 mL微量素溶液(5.7 g Na2HPO4、6.2 g KH2PO4、0.6 g MgSO4·7H2O用1 000 mL蒸馏水溶解)、200 mL缓冲液(39.0 g NaHCO3、2.0 g NH4HCO3用1 000 mL 蒸馏水溶解)、0.1 mL微量元素溶液(13.2 g CaCl2·2H2O、10.0 g MnCl2·4H2O、 1.0 g CoCl2·6H2O、8.0 g FeCl3·6H2O用100 mL蒸馏水溶解)和40 mL还原溶液(4 mL 1 mol/L的NaOH、0.625 g Na2S9·H2O,溶解于95 mL蒸馏水中)混合均匀。
在早晨饲喂后2 h，分别从2头牛的瘤胃中抽取250 mL瘤胃液。将2头牛的瘤胃液混合均匀，并通过4层纱布过滤，保存在温度为39 ℃的玻璃瓶中, 然后将600 mL缓冲液和300 mL瘤胃液混合均匀，配制成培养液，保存在39 ℃的恒温水浴中，并持续通入CO2气体。
应用长度为200 mm、内径为32 mm、刻度体积为100 mL的玻璃注射器作为发酵容器，用能够精确控制温度(±0.1 ℃)的恒温水浴进行保温培养。分别称取0.200 0 g稻草样品，放置于每个注射器中。每个注射器抽取30 mL培养液，排除注射器中的气体，将注射器顶部密封。设4个重复，每个注射器作为该饲料样品的1个重复。每批发酵的饲料样品的空白对照设3个重复，每个注射器作为1个重复。将注射器针头朝下，竖放在39 ℃恒温水浴中，开始培养发酵。
有研究表明，在体外瘤胃发酵进行45~52 h时，能够获得秸秆的最大体外消化率[9]。因此，本研究的培养发酵时间设置为48 h。在培养发酵结束时，读取注射器活塞的位置，以计算最大产气量。抽取5 mL气体用于分析CH4和CO2产量。快速测定发酵液的pH。然后将发酵液转移至容积为50 mL的离心管中，并保存在冰水中，终止发酵。使用高速离心机在10 000×g下将培养液离心15 min，取4 mL上清液与1 mL偏磷酸混合均匀，然后将该混合液冷冻保存在-20 ℃的冰柜中，用于测定VFA产量。
将饲料样品放在105 ℃的烘箱中过夜，测定干物质含量。应用凯氏定氮法测定粗蛋白质含量,应用Van Soest等[10]的方法测定中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。
使用气相色谱仪(TP-2060T，北京北分天普仪器有限公司)测定发酵气体中的CH4、CO2和氢气(H2)产量。测定条件为：热导检测器(TCD),TDX-01色谱柱,规格1 m×2 mm×3 mm,柱温70 ℃,检测器温度100 ℃。载气为氩气。标准气体组成为：CH4 26.796%、CO2 65.300%、氧气(O2)0.605%、氮气(N2)7.100%、H2 0.199%。
使用气相色谱仪(TP-2060F，北京北分天普仪器有限公司)测定发酵液中的VFA产量。测定条件为：火焰离子检测器(FID)，PEG-20M+H3PO4玻璃柱，柱温120 ℃，检测器温度220 ℃。载气为氩气、H2，流速分别为30和300 mL/min。取2 μL发酵液样品用于分析测定VFA产量。标准VFA的组成为：乙酸 42.0 mmol/L、丙酸32.1 mmol/L、异丁酸2.0 mmol/L、丁酸14.0 mmol/L、异戊酸7.0 mmol/L、戊酸3.0 mmol/L、2-乙基丁酸4.0 mmol/L。其中2-乙基丁酸用作内标物。
总产气量、CH4、CO2、H2、总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸和丁酸的产量(干物质基础)计算公式为：
Y样品=(Y发酵液-Y空白)/DM；式中：Y样品为样品的气体(mL/g)或VFA (μmol/g)产量，Y发酵液为培养发酵的气体(mL/g)或VFA产量(μmol/g)，Y空白为空白对照的气体(mL/g)或VFA产量(μmol/g)，DM为饲料样品干物质含量(g)。
另外,分别计算不同指标之间的比值，包括乙酸/丙酸、总产气/TVFA、CH4/TVFA、CO2/TVFA、CH4/总产气、CO2/总产气以及CH4/CO2。
应用SAS 9.1对不同处理各个指标的数据进行方差分析。分析比较的模型为:Yi=μ+UREAi+εi,其中Yi=观测值,μ=平均值,UREAi=尿素的作用(i=1~5)，εi为误差。不同处理间的差异P<0.05为显著,P<0.01为极显著，0.05≤P<0.10为有显著趋势。
表1中的结果显示，氨化处理极显著地提高了稻草的粗蛋白质含量(P<0.01)，极显著降低了中性洗涤纤维含量(P<0.01)。氨化处理对稻草酸性洗涤纤维的含量没有显著影响(P>0.05)。
 | 表1 氨化处理对稻草营养成分的影响(干物质基础) Table 1 Effects of ammoniation treatment on nutrient composition of rice straw (DM basis) % |
表2中的结果显示，不同处理间体外培养发酵液pH没有显著差异(P>0.05)。随着尿素水平的提高，总产气量、CH4、CO2、TVFA以及乙酸产量均极显著提高(P<0.01)。不同处理间H2、丙酸和丁酸产量以及乙酸/丙酸没有显著差异(P>0.05)。不同处理各指标之间的比值，包括乙酸/丙酸、总产气/TVFA、CH4/TVFA、CO2/TVFA、CH4/总产气、CO2/总产气以及CH4/CO2也没有显著差异(P>0.05)。
与对照相比,处理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的稻草粗蛋白质含量分别提高了67.3%、101.7%、107.4%和144.4%。这表明在氨化过程中，尿素氮与稻草结合，提高了稻草的粗蛋白质含量。本试验结果与Zorrilla-Rios等[3]的结果一致。处理Ⅲ和Ⅳ的稻草的粗蛋白质含量之间没有显著差异(P>0.05),显示在稻草氨化过程中，可能有部分尿素氮被损失。
与对照相比,处理Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的中性洗涤纤维含量分别下降了3.37%、6.28%、6.37%和6.53%。这显示氨化处理可能分解了稻草的部分中性洗涤纤维。由于本研究中氨化处理没有影响稻草的酸性洗涤纤维含量，因此可以推测，稻草中被分解的中性洗涤纤维可能主要是半纤维素。Selim等[11]报道，氨化处理能够降低稻草的机械阻力，提高稻草的易碎性。Eun等[12]报道，氨化处理能够破坏秸秆的木质素——碳水化合物复合物，因而能够提高反刍动物对秸秆的消化率。本研究的结果与Selim等[11]和Eun等[12]的结果一致。
| 表2 氨化处理对稻草体外培养发酵液pH、气体和VFA产量的影响(干物质基础)
Table 2 Effects of ammoniation treatment on pH in fermentation fluid and production of gas and VFA after in vitro incubation of rice straw (DM basis)
|
本研究的结果还显示，处理Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ之间的中性洗涤纤维含量没有显著差异。这一结果表明，使用占稻草质量4%以上的尿素水平对稻草进行氨化处理并不能够进一步有效地分解稻草的中性洗涤纤维。综合考虑尿素成本和氨化处理的效果，对稻草进行氨化处理的适宜尿素水平为4%~6%。这与Liu等[13]的结果一致。
本研究结果显示，所有处理的体外培养发酵液的pH在6.60~6.64范围内，与正常瘤胃液pH范围一致。在体外瘤胃发酵结束时，取培养发酵液放置在显微镜下进行观察，发现瘤胃微生物活动正常。这表明本研究的体外瘤胃发酵与瘤胃发酵特点相近。
本研究结果显示，随着尿素水平的升高，氨化稻草体外瘤胃发酵的总产气量显著升高。由于总产气量与饲料消化率之间存在正相关关系[4, 5]，因此可以推断，氨化处理提高了稻草的可消化性。本研究结果还显示，随着尿素水平的提高，氨化稻草的中性洗涤纤维含量下降，TVFA和乙酸产量显著升高。这一结果与氨化稻草的总产气量的升高一致。氨化处理提高稻草体外瘤胃发酵总产气量和TVFA产量的原因可能包括以下几个方面：1)氨化处理降低了稻草的机械阻力，提高了稻草的易碎性，使稻草颗粒缩小，扩大了瘤胃微生物与稻草的接触面积，并促进了微生物的生长[14];2)氨化处理破坏了木质素——碳水化合物复合物的结构，降低了稻草中的酚类聚合物含量，因而改善了瘤胃微生物酶对稻草的作用效果[15];3)氨化处理提高了稻草的粗蛋白质含量，为瘤胃微生物增加了可利用氮，因而提高了稻草的发酵效率。由于瘤胃发酵产生的气体主要包括CH4和CO2，因而随着稻草氨化程度的提高，CH4和CO2的产量均相应增加。
本研究结果表明，不同处理间体外瘤胃发酵乙酸/丙酸没有显著差异。这说明氨化处理对稻草的体外瘤胃发酵类型没有造成影响。这一结果与各处理发酵指标之间的比值，包括总产气/TVFA、CH4/TVFA、CO2/TVFA、CH4/总产气、CO2/总产气和CH4/CO2没有显著差异的结果一致。也就是说，氨化处理能够提高稻草的总产气量和TVFA产量，但是并不能改变气体的成分。
一方面，碳水化合物在瘤胃发酵过程中产生VFA；另一方面，碳水化合物在瘤胃发酵过程中产生CO2和H2。瘤胃产CH4菌能够利用CO2和H2合成CH4。VFA是反刍动物的主要能量来源。提高瘤胃发酵的VFA产量，能够增加反刍动物的能量供应量。而瘤胃CH4的产生与释放，不仅造成饲料能量的浪费，而且加重地球的温室效应。本研究的结果显示，氨化处理对稻草体外瘤胃发酵的CH4/TVFA和CO2/TVFA没有影响。这说明，对稻草进行氨化处理虽然能够提高稻草的饲用价值，但是不可避免地会增加瘤胃发酵的CH4和CO2产量。
① 氨化处理能够显著地提高稻草体外瘤胃发酵的总产气量以及CH4、CO2和TVFA产量。使用不同水平的尿素对稻草进行氨化处理，并不能改变CH4/TVFA和CO2/TVFA。也就是说，应用氨化处理提高稻草对反刍动物的饲用价值，将不可避免地提高瘤胃CH4、CO2产量以及总产气量。
② 今后有必要研究在使用氨化稻草饲喂反刍动物条件下，降低瘤胃发酵CH4和CO2产量的技术和产品。
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