国产饲料级改性蒙脱石，纯度≥99%，钠基改性。

以鱼粉、豆粕和谷朊粉为主要蛋白质源，大豆油、鱼油和磷脂油为脂肪源，新鲜面粉和次粉为碳水化合物源配制基础饲料，基础饲料本底AFB₁含量<10.00 μg/kg。在基础饲料中分别添加0(对照)、0.5%、1.0%、2.5%和5.0%的蒙脱石替代等量的次粉，配制成5种试验饲料。其中，1.0%为企业最高推荐添加剂量，最高剂量组为最高推荐添加剂量的5倍。试验饲料组成及营养水平见表1。所有饲料原料过60目筛粉碎，混合均匀后用硬颗粒机压制成直径为2.0 mm的饲料，风干冷却后装入密封袋至-20 ℃冰箱保存待用。

试验在中国农业科学院饲料研究所国家水产饲料安全评价基地进行。试验动物选用杂交鲟幼鱼购自北京市水产科学研究所十渡鲟鱼良种场，初始平均体重为(45.10±0.12) g。试验开始前禁食24 h，挑选健康杂交鲟600尾，随机分成5组，每组6个重复，每个重复20尾，以重复为单位饲养于半流水养殖桶(直径80 cm，容积0.26 m³)内。每日表观饱食投喂3次(09：00、16：00、20：00)，观察鱼的健康状况，记录投喂量，摄食40 min后收集残饵，烘干后精确计算摄食量。

试验期间记录各组的摄食、增重及死亡情况，养殖周期为70 d。试验期间水温在18～20 ℃，pH在8.0左右，溶氧＞7.0 mg/L，氨氮＜0.5 mg/L；每天光照12 h。

生长试验结束时禁食24 h后统计每桶杂交鲟的成活率，称量每桶鱼去水后的总重。之后，每桶随机取4尾鱼，用三氯叔丁醇麻醉，测量每条鱼的体长和体重，尾静脉取血后，一部分用于测定全血指标，血液样品收集管中不添加抗凝剂且24 h内完成测定；另一部分用于测定血浆指标，血液样品采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集，经过3 000 r/min冷冻离心10 min，分离取上层血浆，放入-20 ℃冰箱待测。随后解剖，分离内脏团，移取肝脏并称重，然后将部分肝脏置于冻存管中放入-20 ℃冰箱备用，另取一小块肝脏和后肠组织用10%福尔马林固定液固定后进行石蜡包埋切片，苏木精-伊红(HE)染色。

饲料中的水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分和总能分别采用105 ℃常压干燥法、凯氏定氮法、酸水解全脂肪测定法、550 ℃灼烧法和氧弹仪燃烧法测定。饲料中AFB₁采用GB/T 8381—2008中的半定量薄层色谱法测定(检出限<10.00 μg/kg)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验饲料组成及营养水平 Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets % 项目 Items 蒙脱石添加水平 Montmorillonite supplemental level/% 0 0.5 1.0 2.5 5.0 原料(风干基础) Ingredients (air-dry basis) 秘鲁鱼粉 Peru fish meal 26.00 26.00 26.00 26.00 26.00 大豆粕 Soybean meal 25.00 25.00 25.00 25.00 25.00 谷朊粉 Wheat gluten meal 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 乌贼内脏粉 Squid liver powder 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 面粉 Wheat flour 22.00 22.00 22.00 22.00 22.00 大豆油 Soybean oil 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 鱼油 Fish oil 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 磷脂油 Lecithin oil 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 氯化胆碱 Choline chloride 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 预混料 Premix 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 次粉 Wheat middlings 9.60 9.10 8.60 7.10 4.60 蒙脱石 Montmorillonite 0.50 1.00 2.50 5.00 合计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平(干物质基础) Nutrient levels (DM basis) 粗蛋白质 Crude protein 43.3 43.62 43.44 43.02 42.68 粗脂肪 Crude lipid 11.39 11.54 11.38 10.81 11.01 粗灰分 Ash 8.23 8.80 9.21 10.53 12.72 总能 Gross energy/(MJ/kg) 19.54 19.67 19.70 18.97 18.59 黄曲霉毒素B1 AFB1/(μg/kg) <10.00 <10.00 <10.00 <10.00 <10.00 预混料可为每千克饲料提供The premix provides the following per kg of diets：VA 20 mg，VB1 10 mg，VB2 15 mg，VB6 15 mg，VB12 8 mg，烟酸胺 nicotinamide 100 mg，抗坏血酸多聚磷酸酯钠 ascorbic acid 2-phosphate sodium ester 1 000 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 40 mg，生物素 biotin 2 mg，肌醇 inositol 200 mg，叶酸 folic acid 10 mg，VE 400 mg，VK3 20 mg，VD3 10 mg，玉米蛋白粉 corn gluten meal 150 mg，FeSO4 450 mg，ZnSO4·H2O 150 mg，MnSO4·H2O 37.5 mg，CuSO4·5H2O 15 mg，KI (10%) 4.5 mg，Na2SeO3 7.5 mg，CoCl2 (10%) 7.5 mg，NaCl 828 mg。

表1 试验饲料组成及营养水平 Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets %

血液肝功能和肾功能指标，如血浆谷丙转氨酶(ALT)活性、谷草转氨酶(AST)活性、碱性磷酸酶(AKP)活性、总蛋白(TP)含量、白蛋白(ALB)含量、肌酐(CRE)含量、葡萄糖(GLU)含量，血液非特异性免疫与抗氧化指标，如全血呼吸爆发 水平以及血浆髓过氧化物酶(MPO)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。

成活率(survival rate,SR,%)=100×终末鱼数量/初始鱼数量；

特定生长率(specific growth rate，SGR，%/d)=100×[ln终末鱼重-ln初始鱼重]/试验天数；

饲料系数(feed conversion ratio，FCR)=摄食量／(终末鱼重+死亡鱼重-初始鱼重)；

摄食率(feeding rate，FR，%)=100×摄食量/[(终末鱼重+死亡鱼重-初始鱼重)/2]/试验天数；

蛋白质沉积率(protein deposition rate,PDR,%)=100×鱼体蛋白质增加值/摄入蛋白质值；

能量沉积率(Energy deposition rate,EDR,%)=100×鱼体能量增加值/摄入能量值；

肥满度(condition factor,CF,g/cm³)=平均体重／(平均体长)³；

肝体比(hepatosomatic index，HSI,%)=100×肝脏重／鱼体重；

脏体比(viscerasomatic index，VSI，%)=100×内脏重/鱼体重。

试验结果用平均值±标准误表示。使用STATISTICA 6.0软件对数据进行统计分析，先对数据做单因素方差分析(one-way ANOVA)，对差异显著者进行Duncan氏法多重比较，显著水平以P＜0.05计。

各组杂交鲟的生长性能结果见表2。试验中未观察到明显营养缺乏症的鱼，各组试验鱼的成活率均为100%，但生长性能有所起伏。其中，终末体重和特定生长率呈“W”状走势，0.5%、2.5%组显著低于对照组(P<0.05)，而1.0%和5.0%组与对照组则无显著差异(P>0.05)；肝体比以5.0%组最高，显著高于对照组和1.0%组(P<0.05)，其他各组间无显著变化(P>0.05)。各组试验鱼的摄食率、饲料系数、脏体比、肥满度以及蛋白质和能量沉积率均无显著差异(P>0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 饲料中蒙脱石添加水平对杂交鲟生长性能的影响 Table 2 Effects of montmorillonite supplemental level on growth performance of hybrid sturgeon 项目 Items 蒙脱石添加水平 Montmorillonite supplemental level/% 0 0.5 1.0 2.5 5.0 初始体重 IBW/g 45.10±0.12 45.10±0.15 45.10±0.13 45.10±0.12 45.10±0.08 终末体重 FBW/g 195.96±2.61a 188.71±1.93b 201.27±2.17a 185.06±1.38b 199.01±2.48a 特定生长率 SGR/(%/d) 2.10±0.02a 2.05±0.02b 2.14±0.02a 2.02±0.01b 2.12±0.02a 摄食率 FR/% 1.67±0.01 1.67±0.01 1.70±0.03 1.70±0.01 1.70±0.02 饲料系数 FCR 0.93±0.01 0.95±0.01 0.93±0.01 0.98±0.01 0.94±0.01 肝体比 HSI/% 2.01±0.07a 1.97±0.09a 2.17±0.07ab 2.09±0.09ab 2.31±0.06b 脏体比 VSI/% 6.92±0.18 6.96±0.15 7.03±0.13 6.92±0.13 7.10±0.16 肥满度 CF/(g/cm3) 0.56±0.01 0.56±0.01 0.55±0.01 0.55±0.01 0.57±0.01 蛋白质沉积率PDR/% 36.85±0.70 35.55±0.19 35.85±1.24 34.25±1.00 37.84±0.99 能量沉积率EDR/% 35.43±1.63 32.33±0.73 34.29±1.79 33.45±1.39 36.23±1.25 成活率 SR/% 100 100 100 100 100 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下表同。 In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with different capital letter superscripts mean significant difference (P<0.01). The same as below.

表2 饲料中蒙脱石添加水平对杂交鲟生长性能的影响 Table 2 Effects of montmorillonite supplemental level on growth performance of hybrid sturgeon

各组杂交鲟的体成分结果见表3。各组试验鱼鱼体的水分含量均在80%左右，组间无显著差异(P>0.05)；粗灰分含量以5.0%组为最高，达到(3.14±0.09)%，这可能主要是由于该组饲料中蒙脱石添加水平高达5.0%引起，但统计分析结果显示各组之间并无显著差异(P>0.05)，粗蛋白质、粗脂肪及总能含量都在正常值范围，且组间无显著差异(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲料中蒙脱石添加水平对杂交鲟体成分的影响(鲜重基础) Table 3 Effects of montmorillonite supplemental level on body composition of hybrid sturgeon (fresh weight basis) 项目 Items 蒙脱石添加水平 Montmorillonite supplemental level/% 0 0.5 1.0 2.5 5.0 水分 Moisture/% 79.58±0.50 80.62±0.34 80.29±0.56 79.27±0.32 79.71±0.69 粗灰分 Ash/% 3.03±0.12 3.05±0.07 2.97±0.09 3.02±0.07 3.14±0.09 粗蛋白质 Crude protein/% 13.31±0.21 12.92±0.22 13.01±0.30 13.55±0.21 13.05±0.35 粗脂肪 Crude lipid/% 3.84±0.53 2.76±0.16 3.50±0.57 3.49±0.43 3.96±0.32 总能 Gross energy/(MJ/kg) 4.56±0.21 4.21±0.09 4.51±2.42 4.37±1.46 4.72±1.44

表3 饲料中蒙脱石添加水平对杂交鲟体成分的影响(鲜重基础) Table 3 Effects of montmorillonite supplemental level on body composition of hybrid sturgeon (fresh weight basis)

各组杂交鲟的血液肝功能与肾功能指标结果见表4。随着蒙脱石添加水平的提高，血浆AST活性不断升高，除0.5%组与对照组差异不显著(P>0.05)外，其他3组均显著高于对照组(P<0.05)，且最高剂量组(5.0%组)较对照组提高了1倍左右，即从(55.12±7.13) U/L上升到(105.59±4.14) U/L；其他肝功能和肾功能指标包括血浆AKP活性、TP含量、ALB含量、GLU含量、CRE含量和ALT活性均无显著变化(P>0.05)。通过计算可知，随着蒙脱石添加水平的升高，血浆AST与ALT比值持续走高，由1.09上升到2.00。

各组杂交鲟的血液非特异性免疫与抗氧化指标结果见表4。各组鲟鱼血浆NO含量、MPO活性和SOD活性均无显著差异(P>0.05)。全血RB水平以1.0%组为最高，显著高于其他各组(P<0.05)，但0.5%、2.5%和5.0%组与对照组无显著差异(P>0.05)。1.0%和5.0%组血浆MDA含量显著高于对照组和2.5%组(P<0.05)，略高于0.5%组(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲料中蒙脱石添加水平对杂交鲟血液生理生化指标的影响 Table 4 Effects of montmorillonite supplemental level on physiological and biochemical indexes of hybrid sturgeon 项目 Items 蒙脱石添加水平 Montmorillonite supplemental level/% 0 0.5 1.0 2.5 5.0 肝功能与肾功能指标 Liver function and kidney function indexes 碱性磷酸酶 AKP/(U/g prot) 16.74±1.08 14.28±1.02 15.02±1.02 15.92±0.72 16.32±1.43 总蛋白 TP/(g/L) 18.05±1.12 19.09±0.65 18.21±0.37 18.23±0.58 18.15±0.74 白蛋白 ALB/(μmol/L) 9.44±0.59 8.95±0.66 8.45±0.68 8.26±0.48 9.54±0.42 葡萄糖 GLU/(mmol/L) 4.87±0.19 5.06±0.17 4.64±0.21 4.95±0.12 5.02±0.21 肌酐 CRE/(μmol/L) 39.63±3.40 35.97±3.30 43.19±4.30 38.74±4.44 41.63±4.31 谷丙转氨酶 ALT/(U/L) 50.51±5.71 52.25±3.66 48.48±3.04 55.90±5.98 52.79±4.18 谷草转氨酶 AST/(U/L) 55.12±7.13a 75.15±9.91ab 87.19±7.00bc 96.89±7.77bc 105.59±4.14c 非特异性免疫与抗氧化指标 Non-specific immune and antioxidant indexes 一氧化氮 NO/(μmol/L) 8.60±0.61 7.15±0.63 9.37±1.35 8.02±0.95 8.31±1.11 髓过氧化物酶(吸光度值) MPO(OD value) 2.26±0.31 1.63±0.20 2.11±0.47 1.91±0.32 1.71±0.40 呼吸爆发(吸光度值) RB (OD value) 0.20±0.04a 0.15±0.04a 0.31±0.02b 0.12±0.04a 0.16±0.03a 超氧化物歧化酶 SOD/(U/mL) 90.24±4.63 93.74±7.21 85.76±3.57 90.39±3.96 85.37±4.46 丙二醛 MDA/(nmol/L) 2.63±0.24a 3.84±1.36abc 5.03±0.48c 2.78±0.17a 4.81±0.37bc

表4 饲料中蒙脱石添加水平对杂交鲟血液生理生化指标的影响 Table 4 Effects of montmorillonite supplemental level on physiological and biochemical indexes of hybrid sturgeon

各组鲟鱼肠道组织学结果见图1。由图可知，对照组和0.5%组杂交鲟的肠道绒毛结构完整清晰，上皮细胞排列整齐，吸收细胞的吸收空泡丰富，大小均匀，杯状细胞排列致密；1.0%和2.5%组杂交鲟的肠道绒毛结构完整清晰，上皮细胞排列整齐，吸收细胞的吸收空泡丰富，大小均匀，但杯状细胞数量减少，呈稀疏分布；5.0%组显示肠道组织中有明显的囊泡性病变，肠道绒毛结构部分融合，上皮细胞排列不整齐，杯状细胞数量较少，呈稀疏分布。上述结果说明随着饲料中蒙脱石添加水平的升高，对杂交鲟肠道组织逐渐产生损伤，添加5.0%蒙脱石对杂交鲟肠道组织有较严重的损伤。

各组鲟鱼肝脏组织学结果见图2。由图可知，对照组以及0.5%和1.0%组杂交鲟的肝脏组织未见异常；2.5%和5.0%组杂交鲟的肝脏组织均显示肝血窦腔隙明显增大，肝脏实质组织有溶解的趋势。上述结果说明蒙脱石添加水平≥2.5%时对杂交鲟肝脏组织有较严重的损伤。

图1(Figure 1)

Fig. 1

图1 各组杂交鲟的肠道组织切片(横切，HE染色) Fig.1 Tissue sections of intestine of hybrid sturgeon in different groups (crosscutting, HE staining)

图2(Figure 2)

Fig. 2

图2 各组杂交鲟的肝脏组织切片(横切，HE染色) Fig.2 Tissue sections of liver of hybrid sturgeon in different groups (crosscutting, HE staining)

本试验所用蒙脱石产品的有效成分钠基改性蒙脱石含量高达99%，蒙脱石对动物本并没有能量供给，随着添加水平的升高，饲料所提供给杂交鲟的总能逐渐降低。最适觅食理论(optimal foraging theory)假设：鱼类在觅食过程中的一系列形态、感觉、行为、生态和生理特性等，均为保证鱼类具有最大的摄食生态适应性，而这种适应总是倾向于使鱼类获得最大的净能收益(net energy gain)^{[13, 14]}。本试验中各组杂交鲟的摄食率虽无统计学显著变化，但随着饲料总能的下降，1.0%、2.5%和5.0%组杂交鲟的摄食率较对照组均有所提高，对生长可能具有一定补偿作用。但2.5%组杂交鲟较低的生长性能和蛋白质沉积率可能与摄食率无直接关系，其可能与机体生理状态有关，有待进一步研究。

饲料中添加蒙脱石可能存在对营养素的吸附问题。夏明亮^[15]研究发现，在仔鸡饲粮中添加0.5％Cu-MMT(一种改性蒙脱石)显著降低了胫骨铁、锌和磷含量，饲粮中添加0.5％DODMAB-MMT(一种改性蒙脱石)也有降低胫骨铁和胫骨磷含量的趋势。陈翠珍等^[16]报道，蒙脱石对人体内有机磷有吸附作用。王峰等^[17]报道，在水环境中，与蒙脱石同属铝硅酸盐类的天然蛭石对Cu²⁺和Zn²⁺的吸附量分别为3 945.9和3 498.3 mg/kg。本试验中，0.5%组生长性能下降可能是由于蒙脱石对氨基酸和矿物元素的吸附导致，但是本组试验鱼并没有发现明显的营养缺乏症状，可能由于改性过的蒙脱石对氨基酸和矿物元素的吸附有所下降。齐德生^[18]发现，经过季铵盐改性之后蒙脱石对赖氨酸、维生素B₂等营养物质的吸附量会降低。此外，蒙脱石会影响动物对赖氨酸、维生素B₂的吸收，因而会降低赖氨酸和维生素B₂的有效性，在饲料中应用蒙脱石时应注意补充赖氨酸和维生素B₂^[15]。本试验中，各组鱼体成分没有显著差异，同时，鲟鱼属于快速生长鱼类，在70 d内各组均未发现明显的营养缺乏症状，因此本试验不能说明2.5%组的生长性能降低与营养素缺乏有关。此外，本试验中5.0%组相对2.5%组部分生长指标有所上升，但蒙脱石具有黏性，对鲟鱼的膨化颗粒料加工工艺影响较大，本试验制粒时发现，5.0%组颗粒成形度相对其他组饲料受到明显影响，颗粒并不呈现圆柱体，多为不规则球体状。因此，从加工角度，鲟鱼饲料中蒙脱石添加量不宜过高。由于蒙脱石具有吸湿性，能吸附8～15倍于自身体积的水量，吸水后能膨胀，膨胀倍数是自身体积的30余倍^[19]，不利于鱼体顺畅排出，肠道切片观察到有明显的囊泡性病变，肠道绒毛结构部分融合，上皮细胞排列不整齐，杯状细胞数量较少，呈稀疏分布。蒙脱石本身具备黏滞性，有研究表明，同类的铝硅酸盐类复合物麦饭石能增加食物在水产动物消化道内的滞留时间^[20]，同样的，蒙脱石本身也会在动物体内滞留延长，高剂量的蒙脱石吸水膨胀后更不易排出，所以5.0%组的生长指标有所上升可能与食物滞留时间延长有关，但长期饲喂对肠道造成的损伤会进一步加重。

目前评估血液中的ALT和AST活性变化被广泛用于哺乳动物的肝脏组织病理检查^[21]，在临床医学研究中AST与ALT比值常作为肝病诊断和预后判断的重要指标，AST与ALT比值升高与肝细胞损伤相关，肝病缓解时AST与ALT比值会逐渐变小^[22]。Vaglio等^[23]进行的金头鲷对镉的暴露试验，de la Torre等^[24]进行的鲤鱼幼鱼对镉的暴露试验以及侯俊利等^[25]进行的中华鲟幼鱼对铅的暴露试验中血液中AST与ALT比值在鱼体受到重金属刺激后都有明显的上升。血液中AST与ALT比值在评价鱼类组织损伤中也具有重要意义，且若AST活性长期升高很可能标志着病情转入慢性发展阶段。本试验结果表明，随着蒙脱石添加水平的升高，血浆AST与ALT比值持续走高，从1.09上升到2.00，说明蒙脱石对杂交鲟肝脏组织造成负面影响加重，肝脏组织切片结果也说明了高剂量(2.5%和5.0%)的蒙脱石对肝脏存在损害作用，同时肝体比结果与AST结果存在一致性，即随着蒙脱石添加水平的升高，肝体比增大，肝脏肿大。通过对肝脏组织切片的观察发现，当添加水平为2.5%时，肝脏组织肿大、损伤，当添加水平达到5.0%时，肝脏组织损害更加严重。

应激包括警告期、适应或补偿期、衰竭期3个阶段。Selye^[26]认为应激是具有适应意义的生理反应，目的是维持内稳态。当机体不能很好适应时，内稳态就被破坏，从而导致各种病变，当长期处于高水平应激状态，内稳态不再平衡，生长、免疫性能下降，过强的或过长的应激反应会对机体产生危害，导致生长发育缓慢、繁殖能力下降、免疫机能低下及发病率和死亡率提高等^[27]。血液非特异性免疫与抗氧化指标结果中，1.0%组的血液RB水平达到最高，显著高于其他各组，说明蒙脱石添加水平为1.0%时，杂交鲟机体的免疫水平高于其他各组，很可能已处于机体能够承受的最大水平(对本试验而言)；当添加水平超过1.0%时，RB水平不升反而下降，可能是由于超过机体正常的承受范围。虽然蒙脱石本身不具备营养功能，但饲料中添加蒙脱石仍然会通过其他途径影响营养物质吸收和机体免疫水平，这也与高水平添加所导致的肝脏和肠道损伤有关。同时，血浆MDA结果也显示了相同的趋势，即1.0%组的血浆MDA含量最高，达(5.03±0.48) nmol/L，唯一不同的是5.0%组的结果显著高于2.5%组，呈现异常的上升趋势，没有出现因为免疫力下降而下降的趋势，这很可能是由于5.0%组的肝脏和肠道组织损伤较2.5%组更为严重，一部分细胞破裂溶解，导致血浆中MDA含量相对2.5%组上升。

蒙脱石添加水平过高导致肝脏在非特异性免疫调节过程中负担过重，而出现损伤。赵灏等^[28]发现，肝脏功能受损会导致肠黏膜通透性改变，加重胃肠道损伤。倪若愚等^[29]研究发现，慢性肝炎伴肝硬化病人的结肠黏膜上皮细胞发生变性，微绒毛排列呈紊乱状态，紧密连接大部分松懈，细胞内线粒体肿胀、数目减少，肠黏膜屏障受到很严重破坏。本试验中，2.5%和5.0%组肠道和肝脏不同程度受损，很可能是由于作为异物进入鱼体的蒙脱石首先对肝脏造成过重的负担，并发导致肠道组织出现损伤。非特异性免疫过程伴随着脂质过氧化产物MDA的产生，也会对组织造成一定的脂质过氧化损伤。另外，也可能是由于添加水平过高，蒙脱石吸水后数10倍膨胀，在鱼体肠道滞留没有完全排出体外所致^[20]。