分光光度法是通过测定ROS与显色剂发生反应，在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度或发光强度的变化，对该ROS进行定性和定量分析的方法。由于分光光度法操作简单、价格便宜，在实验室中受到广泛的应用。目前，ROS分光光度法测定中最常用的为细胞色素C(cytochrome C)还原法和硝基四氮唑蓝(nitro blue tetrazolium，NBT)还原法。

细胞色素C还原法指高铁细胞色素C能同氧自由基发生氧化还原反应，高铁细胞色素C被还原为亚铁细胞色素C，在分光光度计550 nm处吸光度增加，由此确定待测样品中ROS的水平^[11]。细胞色素C还原法虽然是一种有效的ROS测定方法，但是易受到细胞内氧化酶和还原酶的影响^[12]。当测定ROS产生较低的血管平滑肌细胞和内皮细胞时，吸光度的测定、重量的称取以及加样量多少等误差的存在，均可以放大结果的差异性，造成测定结果准确性降低^[13]。此外，由于细胞色素C具有能被细胞内氧化酶氧化以及分子质量大不易于进入细胞的特点，也限制了细胞色素C还原法在细胞试验中的应用^[13]。

NBT还原法是指NBT在O^-₂·的作用下，还原生成深蓝色的不溶性沉淀二甲替(diformazan)，在530～630 nm处有最大吸收波长^[14]。此前，NBT还原法已被运用于白细胞^[15]、精子和精液^[16]中ROS的检测。但是，由于二甲替不溶于水，长时间放置会出现沉淀现象，难以用于检测细胞或者水溶液体系中随时间推移O^-₂·水平的变化。另外，NBT能与体内多种氧化还原酶发生反应，产生ROS，因此准确性较低^[17]。

化学发光法指在没有任何光、电、热的作用下，基态分子吸收化学反应放出的化学能跃迁到激发态，处于激发态的分子以光辐射的形式返回基态，产生化学发光。ROS是一类不稳定的化合物，且具有很高的氧化活性，能够与多种化合物发生氧化还原反应。当其同化学发光试剂反应时，发光试剂会迅速分解释放光子，可以根据由此产生的化学发光强度对ROS进行定量或者定性分析^[10]。化学发光法由于具有敏感、测定范围广泛、简单、廉价、安全和可控的特点，是目前运用最为广泛的ROS测定方法。在一定条件下，ROS能和鲁米诺(luminol；5-amino-2,3-dihydrophthalazine-1,4-dione)、光泽精(lueigenin；N,N’-dimethyl-9,9’-diacridinum)和肠腔素｛coelenterazine；2-(4-hydroxybenzyl)-6-(4-hydroxyphenyl)-8-benzyl-3,7-dihydroimi-dazo pyrazin-3-one｝及其类似物等化学发光试剂反应，产生不同强度、不同发射波长的化学发光辐射。下面将分别介绍不同发光剂在ROS定量和定性分析研究中的应用进展。

鲁米诺是化学发光研究中最常用的试剂之一，由于其具有灵敏、方便、操作简单的特点，对鲁米诺的研究与应用都很广泛。在碱性环境中，鲁米诺在催化剂(酶、过渡金属离子或金属络合物)的催化下可与·OH、O^-₂·、¹O₂以及H₂O₂等发生化学反应，迅速分解发光，其发光强度可由化学发光分析仪检测。因此，鲁米诺化学发光法可以应用于·OH、O^-₂·、¹O₂和H₂O₂等ROS的测定^[17]。利用鲁米诺化学发光法对ROS进行检测具有以下几个优势：1)鲁米诺能够与体内多种ROS发生反应，没有选择特异性；2)鲁米诺作为一种发光剂，可同时用于细胞内和细胞外ROS水平的检测；3)由于体内多种关键自由基，如·OH、O^-₂·的半衰期非常短，而鲁米诺能够与其迅速反应^[18]。目前鲁米诺化学发光法已被用于精子与精清^[19]、血液与组织匀浆上清液^[20]、细胞^[21]等样品中ROS的检测。然而，由于·OH、O^-₂·、¹O₂和H₂O₂这些ROS物质均能够氧化鲁米诺产生化学发光，很难用于其中单一ROS物质的直接测定^[22]。因此，在很多情况下，ROS的鲁米诺化学发光法只能作为定量或者定性分析的辅助手段。

光泽精同鲁米诺一样，也是一种广泛使用的化学发光剂。1935年，Glue等^[23]最先报道了有关光泽精化学发光的文章。与鲁米诺相比，光泽精具有以下优点：1)光泽精的发光体N-甲基叮淀酮比鲁米诺的发光体3-氨基邻苯二甲酸发光更强、发光效率更高。2)光泽精的化学发光对某些还原剂非常敏感。3)含α-羟羰基的化合物与光泽精会发生强烈的化学反应^[24]。4)光泽精化学发光法只对O^-₂·和H₂O₂敏感，特异性相对比较高。而当只存在·OH时，其并不能够激发光泽精发光^[25]。但是光泽精自身能够与氧气(O₂)发生氧化还原反应，产生自由基O^-₂·，当生物体系统O^-₂·水平很低，而光泽精浓度较高时，由光泽精氧化还原反应产生O^-₂·的比例可能要大于生物所含有的O^-₂·，影响光泽精化学发光法测定ROS的准确度^{[26, 27]}。此外，光泽精主要用于胞外自由基的检测^[28]。

由于鲁米诺和光泽精都不是特异性的化学发光剂，均能与多种ROS发生反应。而另一种亲脂性化学发光剂肠腔素及其类似物CLA(2-methyl-6-phenyl-3,7-dihydroimidazo -pyrazin-3-one)和MCLA｛2-methyl-6-(4-methoxyphenyl)-3,7-dihydroimidazo pyrazin-3-one｝开始运用于O^-₂·的测定。肠腔素是从肠腔类水生动物体内分离出来的一种亲脂性发光基团，在ROS中，其对O^-₂·具有特异性^[29]，O^-₂·能够氧化肠腔素中的乙酰氨基吡啶阴离子，分解释放出光子^[30]。由于肠腔素发光体乙酰氨基吡啶比光泽精和鲁米诺的发光更强，并且不会同O₂发生氧化还原反应^[31]，稳定性和准确性更高。因此，依赖于肠腔素的化学发光法已经被研究者运用于培养的细胞^[32]、嗜中性粒细胞^[33]、血管组织^[30]和线粒体^[34]中O^-₂·的测定。CLA和MCLA作为肠腔素的类似物，具有相似的化学结构，同样对于O^-₂·具有特异性和敏感性，已经被用于不同样品中O^-₂·的测定，包括嗜中性粒细胞以及巨噬细胞^[35]、内皮细胞^[36]和血管组织^[37]等。值得注意的是，MCLA作为一种化学发光试剂，在对肝脏^[38]、肠道^[39]、心脏^[40]、肺脏^[33]和血管组织^[41]等机体组织表面ROS水平的测定已有报道。虽然肠腔素对于O^-₂·具有特异性，但是过氧亚硝酸阴离子(ONOO^-)同样能够诱导肠腔素化学发光^[34]。因此，在特异性鉴定O^-₂·的时候，活性氮抑制剂的选择，如ONOO^-清除剂的应用，可以减少由于ONOO^-对总化学发光的影响所产生的误差，增加测定结果的准确性。不同化学发光剂的作用特点见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同化学发光剂的作用特点 Table 2 Action characteristic of different chemiluminescence agents 化学发光剂 Chemiluminescence agents 检测种类 Detection species 应用 Application 特点 Characteristics 鲁米诺 Luminol O-2·、H2O2、·OH、1O2[17] 检测血液、精液、组织和 细胞中ROS水平[19, 20, 21] 适用范围广泛，敏感性高， 稳定性低，无特异性[4] 光泽精 Lueigenin O-2·、H2O2[25] 检测细胞外O-2·水平[26] 发光强度大，准确度受自氧化和 底物中氧化剂的影响[26] 肠腔素及其衍生物 Coelenterazine and its derivatives O-2·、ONOO-[30] 检测细胞和组织表面 O-2·水平[32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40] 准确度受活性氮的影响，无自 氧化作用，稳定性好，具有特异性[4]

表2 不同化学发光剂的作用特点 Table 2 Action characteristic of different chemiluminescence agents

荧光光度法是通过合适的荧光探针作用于细胞，在与ROS发生反应后，探针的化学结构发生变化，生成具有强荧光的产物，通过检测反应产物的荧光强度可在一定程度上反映ROS水平。荧光光度法由于其具有高细胞膜穿透性、高分辨率、高灵敏度、可提供细胞内靶分子时空信息的特点，在ROS的测定中得到广泛应用^{[42, 43]}。不同的荧光探针，根据其作用特异性对象的不同和激发波长及发射波长的不同，可测定不同的ROS水平(图3)。目前应用最广泛的荧光探针主要有二氯荧光素(2,7-dichlorodihydrofluorescein，DCFH)、二氢罗丹明123(dihydrorhodamine 123，DHR)和氢化乙啡啶(hydroethidine，HE)等。

DCFH能够氧化生成强荧光化合物二氯荧光黄(2,7-dichlorofluorescein，DCF)，其双乙酸盐形式2,7-二氯荧光黄双乙酸盐(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)是一种激发波长为498 nm，发射波长为522 nm的荧光染料。由于DCFH-DA极易透过细胞膜进入细胞内^[44]，在细胞内被酯酶水解为水溶性的DCFH，该物质能够被·OH、ROOH·、O^-₂·、H₂O₂和NO·等多种ROS所氧化，因此被广泛的运用于细胞内ROS的测定^{[45, 46]}。虽然，DCFH法能够准确、方便地测定总ROS的水平，但是其特异性较差。有研究者发现使用DCFH对细胞内ROS进行测定时，DCFH有可能被机体内的高铁离子、细胞色素C、腺嘌呤氧化酶所氧化，致使DCF的含量增加而影响试验结果的准确性^{[47, 48]}。此外，高浓度的DCFH可产生细胞毒性，影响测定结果^[49]。

HE作为一种特异性的荧光染料，能够被O^-₂·特异性氧化生成荧光产物胡米胺(ethidium，E⁺)，其激发波长为520 nm，发射波长为610 nm，被用于测定细胞内O^-₂·的水平^[50]，且E⁺能够与细胞内DNA结合，增加发光强度^{[51, 52]}。虽然HE不能被其他的ROS所氧化，具有很好的特异性，但是HE荧光染料在对O^-₂·定量的测定上受到多个因素的限制。第一，细胞内的细胞色素C能够氧化HE，当细胞中含有大量的细胞色素C时，影响测定结果。第二，高浓度的HE致使细胞内不依赖于O^-₂·的荧光产物E⁺增加，其与细胞核DNA连接，导致荧光强度不断增加。第三，HE具有增加O^-₂·转化为H₂O₂比例的作用，影响测定结果的准确性^{[8, 51]}。

DHR是一种非荧光分子，DHR与ROS反应后生成具有荧光的脂溶性探针罗丹明123，其激发波长为505 nm，发射波长为529 nm，由于DHR具有亲脂性，其极易扩散进入细胞膜^[53]。虽然DHR主要用于测定细胞内H₂O₂的水平，但是其特异性较低，能够被多种ROS和氧化物如ONOO^-、高铁离子、细胞色素C、次氯酸(HClO)和腺嘌呤氧化酶所氧化^{[45, 48]}。

不同荧光探针的作用特点见表3。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同荧光探针的作用特点 Table 3 Action characteristic of different fluorescence probes 荧光探针 Fluorescence probes 检测种类 Detection species 应用 Application 特点 Characteristics 二氯荧光素 DCFH ·OH、ROOH·、H2O2[45, 46] 检测细胞的氧化状态[42] 易发生自氧化作用，背景荧光高， 准确性低，无特异性[42] 氢化乙啡啶 HE O-2·[50] 检测细胞内突发性氧化作用[42] 高浓度时背景荧光高，准确度低， 对O-2·具有特异性[43] 二氢罗丹明123 DHR H2O2[45] 检测细胞中H2O2、HClO、 ONOO-水平[42] 易受胞内氧化还原酶的影响， 对H2O2具有特异性[53]

表3 不同荧光探针的作用特点 Table 3 Action characteristic of different fluorescence probes

ESR是指由于不同自由基结构具有特定的核自旋能量，其在稳定的磁场作用下，同电磁辐射能相互作用而产生的共振吸收现象。通过对共振谱线的研究可以获得对自由基未偶电子的状态及其周围环境方面的信息，从而得到有关物质结构和化学键的信息，以此来鉴定不同自由基的种类和水平^[54]。ESR法虽然是目前ROS测定的最直接和有效的方法，但是其应用依然受到几个方面的限制，其中最主要的限制因素是由于ESR每次扫描都需要几秒的时间，而主要的ROS如O^-₂·和·OH等，由于其在生物体系中有浓度低且存活时间短的特点，因而不易被ESR法所测定^[27]。因此，应用ESR法测定存活时间短的ROS时，可以通过电子自旋共振探针试剂与ROS的相互作用，捕捉ROS，通过二级产物来间接测定^{[55, 56]}。电子自旋共振试剂苯基-叔丁基硝酸(PBN)和5,5-二甲基吡咯啉-N-氧化物(DMPO)能够同ROS发生反应，生成包含亚硝基或硝酮的稳定化合物，而引起信号的变化，以此来测定ROS的种类和水平^{[57, 58]}。但是，电子顺磁共振谱仪是相当昂贵且对实验室环境要求严格的试验仪器，限制了ESR法在普通实验室的应用性。

由于ROS在现代医学和分子生物学领域的重要性，根据特定的试验目的选择灵敏、准确、特异性高、稳定性好和操作简单的ROS测定方法，在现代自由基生物学研究中具有重要的意义。但是ROS由于其反应活性高、寿命短、积累水平低，加之种类较多的特点，很难被直接准确测定。化学反应法作为目前应用最为广泛的ROS检测方法，主要有化学发光法、分光光度法、荧光光度法和ESR法这4个体系。研究者针对不同的ROS和不同的样品时，都可以从化学反应法中选出适宜的方法进行测定。但化学反应法由于受化学反应物理化特性的影响，大多特异性较低、易受环境影响、稳定性较差。因此，在对ROS进行测定时，需通过对待测样品的性质、类型以及ROS的种类进行判断，选择适宜的测定方法，以利于得出准确的结果。此外，毒性低、稳定性好、特异性高的新型化合物的发现及合成也为未来化学发光法更广泛的应用和发展提供了基础和方向。