挑选健康、规格相同、平均体重为(15.80±0.02) g的罗非鱼300尾，随机分配到12个水族箱内。试验分为4个组，每个组设3个重复(3个水族箱)，每个重复25尾鱼。基础饲料组成及营养水平见表1。以酵母铬(纯度为99.7%)为铬源，在基础饲料中的添加水平分别为0(对照组)、0.2、0.4、0.8 mg/kg(以Cr³⁺浓度计算)，配制4种饲料。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 豆粕 Soybean meal 30.00 鱼粉 Fish meal 16.00 小麦粉 Wheat flour 50.00 玉米油 Corn oil 2.00 磷酸氢钙 CaHPO4 1.50 氯化胆碱 Choline chloride 0.20 预混料 Premix1) 0.30 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels 粗蛋白质 CP 30.74 粗脂肪 EE 3.53 水分 Moisture 12.82 预混料为每千克饲料提供The premix provided the following per kg of the diet：VA 12 000 IU，VD3 3 000 IU，VE 80 mg，VK 7 mg，VB1 20 mg，VB2 40 mg，VB6 20 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 60 mg，生物素 biotin 3.0 mg，叶酸 folic acid 10 mg，VB12 0.8 mg，VC 1 000 mg，Fe 20 mg，Cu 5 mg，Mn 20 mg，I 0.4 mg，Mg 0.9 g。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

饲养试验在山东农业大学动物科技学院水产养殖基地的循环水养殖系统中进行，试验期为50 d。每天人工投喂3次(08:00、12:00、17:00)，采用饱食投喂的方式。投喂时，投料速度先快后慢，当大部分鱼不再游到水表层觅食时，视为表观饱食状态。水温控制在(27.0±1.0) ℃，pH保持在7.0左右；增氧机24 h供氧(除投饲期间)，溶氧在5.0 mg/L以上。

试验结束时，停饲24 h，计数后称量每箱鱼的总重，并统计总采食量，计算终末均重、增重率、特定生长率以及饲料系数；从每箱中随机选取5尾鱼，立即用MS-222(化学名为间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)麻醉，保存到-20 ℃冰箱中，用于鱼体营养成分分析；从每箱中再随机选取5尾鱼，麻醉后，用医疗注射器从尾静脉采血至5 mL离心管，血样在4 ℃下静置2 h，然后使用离心机3 000 r/min离心15 min，取上层血清，保存于-20 ℃冰箱中，用于血液生化指标的测定；将采血后的罗非鱼迅速放置在冰盘上，取其肝脏及肌肉组织，投入液氮中，再转移到-80 ℃冰箱中保存，用于糖代谢相关基因表达分析。

取保存的肝脏或肌肉组织各50 mg，剪碎后放入盛有1 mL Trizol(Invitrogen Reagent)的离心管中，按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA。将提取的总RNA沉淀用焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液溶解后，在紫外分光光度计下测定其在的260和280 nm下的吸光度(OD)值，OD_{260 nm}/OD_{280 nm}的值在1.8～2.0之间，说明提取的总RNA质量较好。将提取的总RNA放入-80 ℃冰箱中保存备用。

总RNA用DNase Ⅰ去除基因组DNA后，取1 μg总RNA使用PrimeScript^TM RT Reagent Kit (Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa)反转录为cDNA，cDNA保存于-20 ℃冰箱中备用。

本实验室前期关于尼罗罗非鱼IR和GLUT基因的研究中发现，GLUT基因在罗非鱼不同组织中表达的优势亚型不同，其中GLUT2基因在肝脏中高表达，而GLUT4基因在肌肉中高表达。为检测不同添加水平的酵母铬对尼罗罗非鱼IR和GLUT基因表达的影响，以尼罗罗非鱼β-肌动蛋白(β-actin)为看家基因，利用qRT-PCR分别检测肝脏中IR和GLUT2以及肌肉中IR和GLUT4基因的表达量。查询NCBI上GenBank数据库中已报道的尼罗罗非鱼GLUT2(GenBank登录号：XM003442884)和β-actin(GenBank登录号：AB037865)的cDNA序列，以及由本实验室克隆出来的尼罗罗非鱼IR(GenBank登录号：JN967750)和GLUT4(GenBank登录号：JN900493)的cDNA序列设计引物，引物由上海生物工程有限公司负责合成，引物序列如表2所示。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 qRT-PCR的引物序列 Table 2 Primer sequences for qRT-PCR 基因 Genes 上游引物 Forward primer 下游引物 Reverse primer 胰岛素受体 IR 5′-TCAAGACGGTCAACGAAT-3′ 5′-TCATCAGCTCCATCACTAC-3′ 葡萄糖转运蛋白2 GLUT2 5′-GGCATGGTATCCTCCTTCTTG-3′ 5′-CCCAAAGATAACACCAGACTGC-3′ 葡萄糖转运蛋白 GLUT4 5′-CATCATCATCGCCATCCT-3′ 5′-ATTCCACCAAGTCCTAACAT-3′ β-肌动蛋白 β-actin 5′-GGTGGGTATGGGTCAGAAAG-3′ 5′-CTCCTCAGGGGCAACTCTC-3′

表2 qRT-PCR的引物序列 Table 2 Primer sequences for qRT-PCR

qRT-PCR采用SYBR Green染色法，选用SYBR PrimeScript^TM RT-PCR Kit试剂盒(TaKaRa)在ABI 7500 Real-time System(Bio-Rad)系统下进行。PCR反应体系为：SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)10.0 μL，PCR 上游引物 (10 μmol/L) 0.4 μL，PCR 下游引物 (10 μmol/L) 0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL，DNA模板(cDNA)2.0 μL，dH₂O 6.8 μL。反应程序为：95 ℃预变性10 s，40个PCR循环(95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s)，收集荧光信号。每个样品重复3次，目的基因的相对表达量以2^-△△Ct法进行分析^[23]。

试验数据采用SPSS 13.0软件的单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较进行统计分析，显著性水平为P<0.05，结果用平均值±标准差表示。

由表3可知，饲料中添加不同水平的酵母铬对尼罗罗非鱼的终末均重、增重率、特定生长率及饲料系数均无显著影响(P＞0.05)，但0.2和0.4 mg/kg组鱼体的增重率比对照组分别提高了5.4%和6.6%。

由表4可知，饲料中添加不同水平的酵母铬对尼罗罗非鱼的血清总蛋白、总胆固醇、甘油三酯、尿素氮、葡萄糖浓度以及谷丙转氨酶活性均无显著影响(P＞0.05)，但血糖(血清葡萄糖)浓度随酵母铬添加水平的升高(由0.2 mg/kg 升高到0.8 mg/kg)而下降。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 酵母铬对尼罗罗非鱼生长性能的影响 Table 3 Effects of chromium yeast on growth performance of Nile tilapia 项目 Items 酵母铬添加水平 Chromium yeast supplemental level/(mg/kg) 0 0.2 0.4 0.8 初始均重 IMW/g 15.79±0.09 15.76±0.04 15.80±0.04 15.76±0.01 终末均重 FMW/g 88.37±4.48 92.19±2.23 93.28±1.31 86.73±3.67 增重率 WGR/% 459.99±28.96 484.94±0.13 490.37±0.07 450.34±0.23 特定生长率 SGR/(%/d) 3.44±0.01 3.53±0.04 3.55±0.02 3.40±0.08 饲料系数 FCR 1.09±0.01 1.10±0.01 1.14±0.01 1.14±0.01 同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row, values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表3 酵母铬对尼罗罗非鱼生长性能的影响 Table 3 Effects of chromium yeast on growth performance of Nile tilapia

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 酵母铬对尼罗罗非鱼血液生化指标的影响 Table 4 Effects of chromium yeast on blood biochemical indices of Nile tilapia 项目 Items 酵母铬添加水平 Chromium yeast supplemental level/(mg/kg) 0 0.2 0.4 0.8 总蛋白 TP/(g/L) 35.20±2.04 35.82±0.62 36.32±0.96 35.06±0.71 总胆固醇 TC/(mmol/L) 3.85±0.42 3.86±0.12 4.38±0.10 4.04±0.29 甘油三酯 TG/(mmol/L) 2.51±0.07 2.58±0.47 2.89±0.39 2.72±0.16 尿素氮 UN/(mmol/L) 0.26±0.04 0.25±0.03 0.27±0.04 0.25±0.04 谷丙转氨酶 GPT/(U/L) 22.11±6.79 15.50±3.33 16.33±3.84 16.83±4.70 葡萄糖 GLU/(mmol/L) 5.13±0.26 5.45±1.15 4.37±0.80 3.75±0.50

表4 酵母铬对尼罗罗非鱼血液生化指标的影响 Table 4 Effects of chromium yeast on blood biochemical indices of Nile tilapia

由表5可知，尼罗罗非鱼鱼体的水分、粗蛋白质以及粗脂肪含量在各组间均无显著差异(P>0.05)，但各酵母铬添加组罗非鱼鱼体的粗脂肪含量均比对照组低，而且粗脂肪的含量随着酵母铬添加水平的升高(由0.2 mg/kg 升高到0.8 mg/kg)呈上升趋势。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 酵母铬对尼罗罗非鱼鱼体营养组成的影响 Table 5 Effects of chromium yeast on body nutrient composition of Nile tilapia % 项目 Items 酵母铬添加水平 Chromium yeast supplemental level/(mg/kg) 0 0.2 0.4 0.8 水分 Moisture 68.10±0.35 68.95±0.54 68.19±0.34 68.78±0.52 粗蛋白质 CP 15.86±0.31 15.55±0.17 15.83±0.27 15.85±0.20 粗脂肪 EE 9.51±0.29 8.91±0.40 9.09±0.26 9.23±0.14

表5 酵母铬对尼罗罗非鱼鱼体营养组成的影响 Table 5 Effects of chromium yeast on body nutrient composition of Nile tilapia %

由图1可以看出，酵母铬添加水平对尼罗罗非鱼肝脏和肌肉中IR基因的表达量影响不显著(P＞0.05)，对尼罗罗非鱼肌肉中GLUT4基因的表达量影响也不显著(P＞0.05)，但对肝脏中GLUT2基因的表达量有显著影响(P<0.05)，其中0.8 mg/kg组肝脏中GLUT2基因的表达量显著高于对照组和0.2 mg/kg组(P<0.05)。