动物营养学报  2013, Vol. 25 Issue (10): 2337-2344   PDF (1051 KB)    
引用本文
敬婷, 罗莉, 白富瑾, 钱前, 孙玉轩, 石亚庆, 李赞. L-苹果酸对湘云鲫生长性能、体组成、消化和抗氧化能力的影响[J]. 动物营养学报, 2013, 25(10): 2337-2344.  
JING Ting, LUO Li, BAI Fujin, QIAN Qian, SUN Yuxuan, SHI Yaqin, LI Zan. Effects of L-Malic Acid on Growth Performance, Body Composition, Digestion and Antioxidant Capacity of Triploid Cucian Carp (Carassius auratus)[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2013, 25(10): 2337-2344.  
L-苹果酸对湘云鲫生长性能、体组成、消化和抗氧化能力的影响
敬婷, 罗莉 , 白富瑾, 钱前, 孙玉轩, 石亚庆, 李赞    
西南大学动物科技学院, 淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室, 水产科学重庆市市级重点实验室, 重庆 400715
收稿日期：2013-6-21
基金项目：国家自然科学基金(31101909);中央高校基本科研业务费专项资金资助(XDJK2011C019);重庆市自然科学基金(cstc2011jjA1570)
作者简介：敬 婷(1990- ),女,四川南充人,硕士研究生,从事水产动物营养与饲料研究。E-mail: jtxndx@163.com
通讯作者：罗 莉,副教授,硕士生导师,E-mail: luoli1972@163.com
摘要：本试验旨在研究L-苹果酸对湘云鲫生长性能、体组成、消化和抗氧化能力的影响。选取均重为(16.25±0.03) g的湘云鲫450尾,随机分为6组(每组3个重复,每个重复25尾),分别饲喂在基础饲料中添加0(对照组)、1、2、4、8和16 g/kg L-苹果酸的试验饲料,试验期90 d。结果表明:饲料中添加L-苹果酸可显著降低饲料pH和系酸力(P<0.05)。饲料中添加L-苹果酸可提高湘云鲫的摄食量和增重率,降低饲料系数,并在添加水平为4 g/kg时达到最佳生长性能。饲料中L-苹果酸添加水平为0~8 g/kg时,全鱼水分含量逐渐下降,粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量逐渐增加,且4和8 g/kg组均与对照组差异显著(P<0.05)。饲料蛋白质沉积率在4 g/kg组达到最高,脂肪和灰分沉积率则在8 g/kg组最高,并均与对照组差异显著(P<0.05)。肠道淀粉酶活性在4 g/kg组达到最高,脂肪酶、胰蛋白酶和Na+/K+-ATP酶活性均在8 g/kg组达到最高,并均与对照组差异显著(P<0.05)。饲料中添加L-苹果酸可提高肝脏超氧化物歧化酶和苹果酸脱氢酶活性,降低丙二醛含量,且上述指标均在4 g/kg组达到最佳值,并与对照组差异显著(P<0.05)。由此得出,饲料中适量添加L-苹果酸可促进湘云鲫的生长,降低饲料系数,增加鱼体营养物质沉积,提高消化和抗氧化能力;L-苹果酸在湘云鲫饲料中的适宜添加量为4~8 g/kg。
关键词： L-苹果酸     湘云鲫     生长性能     体组成     消化酶     抗氧化能力    
Effects of L-Malic Acid on Growth Performance, Body Composition, Digestion and Antioxidant Capacity of Triploid Cucian Carp (Carassius auratus)
JING Ting, LUO Li , BAI Fujin, QIAN Qian, SUN Yuxuan, SHI Yaqin, LI Zan    
Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development of Ministry of Education, College of Animal Science and Technology, Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: This experiment was conducted to investigate the effects of L-malic acid on growth performance, body composition, digestion and antioxidant capacity of triploid cucian carp (Carassius auratus). A total of 450 triploid cucian carp with an average body weight of (16.24±0.06) g were randomly divided into 6 groups with 3 replicates in each group and 25 fish in each replicate. The fish in the 6 groups were fed experimental diets supplemented with 0 (control group), 1, 2, 4, 8 and 16 g/kg of L-malic acid for 90 d, respectively. The results showed as follows: L-malic acid supplementation could significantly reduce the pH and acid-binding acidity of diets (P<0.05). L-malic acid supplementation could significantly increase the feed intake (FI) and weight gain rate (WGR) as well as reduce the feed conversation rate (FCR), and the best growth performance was found in the 4 g/kg group. When the supplemental level of L-malic acid was from 0 to 8 g/kg, the moisture content in whole body was gradually reduced, while the crude protein, crude lipid and ash contents were gradually increased, and those indices in the 4 and 8 g/kg groups had significant differences compared with the control group (P<0.05). The highest dietary protein retention ratio was found in the 4 g/kg group and the highest dietary lipid retention ratio and ash retention ratio were found in the 8 g/kg group, and had significant differences compared with the control group (P<0.05). The highest amylase activity in intestine was found in the 4 g/kg group and the highest activities of lipase, trypsin and Na+/K+-ATPase in intestine were found in the 8 g/kg group, and had significant differences compared with the control group (P<0.05). L-malic acid supplementation could significantly increase the activities of superoxide dismutase (SOD) and maltate dehydrogenase (MDH) and decrease maleic dialdehyde (MDA) content in liver; meanwhile, the best values of them were all found in the 4 g/kg group and had significant differences compared with the control group (P<0.05). In conclusion, supplementing appropriate amount of L-malic acid can promote the growth, reduce the FCR, increase the body nutrient deposition, and improve the digestion and antioxidant capacity of triploid cucian carp. The optimal supplemental level of L-malic acid in the triploid cucian carp diet is 4 to 8 g/kg. [Chinese Journal of Animal Nutrition, 2013, 25(10):2337-2344]
Key words: L-malic acid     triploid cucian carp (Carassius auratus)     growth performance     body composition     digestive enzyme     antioxidant capacity    

L-苹果酸是生物体代谢过程中产生的重要有机酸，是三羧酸循环(TCA)的中间代谢产物，可直接参与线粒体能量代谢[1]。同时，它又是苹果酸-天冬氨酸穿梭的组成部分，对胞液和线粒体之间还原当量的转移起着重要的作用[2]。L-苹果酸在饲料添加剂方面的研究主要集中在反刍动物上，它可作为酸味剂提高饲料的适口性，降低饲料的pH，促进小肠的消化吸收，也可作为能量物质直接被机体使用[3]。杨威等[4]报道反刍动物饲喂苹果酸可以提高饲料的转化率，提高动物的生长性能。而L-苹果酸在水产动物中的研究仅见Hossain等[5]对真鲷(sea bream)的研究，研究发现饲料中添加1%苹果酸对生长性能无显著影响，但是可以增加磷的利用率，以及Michael等[6]对吉富罗非鱼的研究，研究认为饲料中添加0.01 mol/L苹果酸并不能刺激进食行为。而相近的研究则表明酸化剂能够促进罗非鱼[7]、草鱼[8]、鲤鱼[9]、湘云鲫[10]和虹鳟[11]等鱼类的生长。本试验以湘云鲫为研究对象，拟探讨L-苹果酸对其生长性能、体组成、消化和抗氧化能力的影响，并确定L-苹果酸在其饲料中的适宜添加量，以期为湘云鲫饲料生产中合理应用苹果酸提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验饲料

根据湘云鲫的营养需求，以秘鲁鱼粉、大豆粕(去皮膨化)、棉籽粕、菜籽粕等为主要原料配制基础饲料，其组成及营养水平见表1。在基础饲料中分别添加0(对照)、1、2、4、8和16 g/kg的L-苹果酸(购自Sigma公司)，配制成6种试验饲料。各试验饲料制成粒径为2.0 mm的颗粒饲料，60 ℃烘干后，置-20 ℃冰箱保存备用。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础)

Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %


1.2 试验鱼与饲养管理

试验用鱼为湘云鲫，购自重庆大足渔场。试验鱼先经浓度3%的食盐溶液消毒后，暂养于水族缸中，以基础饲料驯化10 d。正式试验开始前，选择健康、均重为(16.25±0.03) g湘云鲫450尾，随机分为6组，每组3个重复，每个重复25尾鱼。养殖容器为180 L玻璃水族缸，水源为曝气后的自来水，每天按体重的2%~3%分4次投喂(08:00、11:00、14:00、17:00)，手动小心投饲直至鱼不再摄食为止。每天18:00换水1次，换水量为100%，以保证水质清新。试验期90 d，试验期间水温22~30 ℃，pH 6.6~7.0，溶氧浓度大于5 mg/L，氨氮浓度小于0.05 mg/L。

1.3 样品采集与指标测定
1.3.1 饲料pH和系酸力的测定

饲料pH采用Radecki等[12]推荐的方法：称取20 g饲料放入烧杯中，分别加入40、60、80 mL去离子水，用玻璃棒稍用力搅拌至呈浆状液后，用pHS-25(数显)pH计测定不同稀释率下的pH。饲料系酸力采用Bolduna等[13]推荐的方法测定：称取100 g风干饲料(全部通过60目标准筛)放入烧杯中，加入200 mL去离子水，在恒温水浴锅中加热至37 ℃左右，取下放在磁力搅拌器上搅拌并插入温度计，将温度控制在(37±1) ℃。将pH计电极插入溶液中，用1 mol/L的盐酸逐步进行滴定至pH=4.0时所用盐酸的毫升数即为该饲料的系酸力。

1.3.2 生长性能指标的测定

试验结束时试验鱼饥饿24 h后准确称鱼体和饲料重，测定其摄食量(feed intake,FI)、增重率(weight gain rate,WGR)和饲料系数(feed conversion ratio,FCR)，计算公式如下：

摄食量(g/尾)=总摄食量／尾数；

增重率(%)=100×(终末尾均重-初始尾均重)／初始尾均重］；

饲料系数=摄食量／(终末尾均重-初始尾均重)。

1.3.3 全鱼体组成和饲料营养成分沉积率的测定

试验前取5尾鱼作为初始样本，试验结束后每重复随机取5尾作为终末样本，根据《饲料标准资料汇编》中的方法测定鱼体以及饲料中水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分的含量，再计算饲料的蛋白质沉积率(protein retention ratio，PRR)、脂肪沉积率(lipid retention ratio，LRR)和灰分沉积率(ash retention ratio，ARR)，计算公式如下：

蛋白质、脂肪或灰分沉积率(%)=100×(终末鱼体蛋白质、脂肪或灰分含量×终末鱼体重-初始鱼体蛋白质、脂肪或灰分含量×初始鱼体重)/(饲料蛋白质、脂肪或灰分含量×摄食量)[14]。

1.3.4 消化和抗氧化指标的测定

养殖试验结束称重后，每组随机取15尾鱼，在冰盘中解剖，取出肠道和肝脏(剥除多余的脂肪和结缔组织)，用生理盐水(4 ℃)冲净消化道内容物，并用滤纸吸干水分后称重，称重后剪碎混匀，按1∶ 9(质量体积比，g/mL)加入生理盐水(4 ℃)，迅速转入玻璃匀浆器匀浆(匀浆过程在冰浴环境中进行)，然后将匀浆液离心(4 ℃，3 500 r/min)10 min，取上清液制得粗酶液。将粗酶液置于-80 ℃超低温冰箱中冷藏保存，用于肠道和肝脏各指标的测定。

肠道消化酶(淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶)和Na+/K+-ATP酶活性以及肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、苹果酸脱氢酶(MDH)活性与丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。淀粉酶活性单位定义为:在37 ℃条件下，每毫克组织蛋白质与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个酶活性单位。脂肪酶活性单位定义为:在37 ℃条件下，每克组织蛋白质在本反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为1个酶活性单位。胰蛋白酶活性单位定义为:在pH 8.0、37 ℃条件下，每毫克组织蛋白质中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.003即为1个酶活性单位。Na+/K+-ATP酶活性单位定义为：每小时每毫克组织蛋白质中ATP酶分解ATP产生1 μmol无机磷的量为1个酶活性单位。组织中蛋白质含量以牛血清蛋白为标准，用考马斯亮蓝法测定。

1.4 数据处理与计算公式

采用SPSS 17.0统计软件进行单因子方差分析(one-way ANOVA)，同时采样Duncan氏法进行多重比较，P<0.05为差异显著。所有数据均以“平均值±标准差”表示。

2 结 果
2.1 L-苹果酸对饲料pH和系酸力的影响

由表2可知，饲料中添加L-苹果酸对饲料pH和系酸力有显著影响(P＜0.05)。随着L-苹果酸添加水平的提高，饲料pH和系酸力显著下降(P＜0.05)，即饲料的酸度逐渐增高，在16.0 g/kg组达到最高。

表2 L-苹果酸对饲料pH和系酸力的影响

Table 2 Effects of L-malic acid on pH and acid-binding capacity of diets


2.2 L-苹果酸对湘云鲫生长性能的影响

由表3可知，饲料中添加L-苹果酸后湘云鲫的终末尾均重、增重率、摄食量均有所增加，而饲料系数则有所下降。其中，以4.0 g/kg组的生长效果最佳，与对照组相比，其增重率、摄食量分别提高了27.17%、26.77%(P＜0.05)，饲料系数则降低了16.40%(P＜0.05)。

表3 L-苹果酸对湘云鲫生长性能的影响

Table 3 Effects of L-malic acid on growth performance of triploid crucian carp (Carassius auratus)


2.3 L-苹果酸对湘云鲫体组成及饲料营养成分沉积率的影响
2.3.1 L-苹果酸对湘云鲫体组成的影响

由表4可知，饲料中L-苹果酸添加水平为0～8 g/kg时，全鱼水分含量逐渐下降，粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量逐渐增加。与对照组相比，8 g/kg组全鱼水分含量降低了2.73%(P＜0.05)，而粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量分别增加了4.60%、13.20%和13.03%(P＜0.05)；4 g/kg组全鱼水分含量降低了2.52%(P＜0.05)，而粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量分别增加了2.58%、10.53%和10.92%(P＜0.05)；4、8 g/kg组之间上述指标差异不显著(P>0.05)。

表4 L-苹果酸对湘云鲫体组成的影响(鲜重基础) Table 4 Effects of L-malic acid on body composition of triploid crucian carp (Carassius auratus) (fresh weight basis) %


2.3.2 L-苹果酸对湘云鲫饲料营养成分沉积率的 影响

由表5可知，各L-苹果酸添加组的蛋白质、脂肪和灰分沉积率均较对照组显著提高(P＜0.05)。其中，蛋白质和脂肪沉积率均在4 g/kg组达到最大值，分别较对照组提高了32.13%和39.97%(P＜0.05)；灰分沉积率在8 g/kg组达到最大值，较对照组提高了49.91%(P＜0.05)。

表5 L-苹果酸对湘云鲫饲料营养成分沉积率的影响

Table 5 Effects of L-malic acid on dietary nutrient retention ratio of triploid crucian carp (Carassius auratus) %


2.4 L-苹果酸对湘云鲫肠道消化酶活性和Na+/K+-ATP酶活性的影响

由表6可见，随着饲料中L-苹果酸添加水平的增加，肠道淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶和Na+/K+-ATP酶活性均呈先升高后降低的趋势，且均在8 g/kg组达到最大值，分别较对照组提高了31.46%、96.98%、12.00%和42.30%(P＜0.05)。16 g/kg组(高添加水平组)的肠道淀粉酶和脂肪酶活性虽然比对照组显著增加(P＜0.05)，但其胰蛋白酶和Na+/K+-ATP酶活性则均显著低于对照组(P＜0.05)，分别比对照组降低了27.90%和49.30%。

表6 L-苹果酸对湘云鲫肠道消化酶和Na+/K+-ATP酶活性的影响

Table 6 Effects of L-malic acid on intestinal digestive enzyme and Na+/K+-ATPase activities of triploid crucian carp (Carassius auratus)


2.5 L-苹果酸对湘云鲫肝脏SOD、MDH活性及 MDA含量的影响

由表7可知，随着饲料中L-苹果酸添加水平的增加，肝脏SOD和MDH活性呈先升高后降低趋势，而MDA含量则相反。在4.0 g/kg组，肝脏SOD和MDH活性达到最大值，MDA含量达到最小值，并均与对照组差异显著(P＜0.05)；在16.0 g/kg组，肝脏SOD和MDH活性较对照组降低了12.28%和46.15%(P＜0.05)，MDA含量增加了15.42%(P＜0.05)。

表7 L-苹果酸对湘云鲫肝脏SOD、MDH活性及MDA含量的影响

Table 7 Effects of L-malic acid on liver SOD and MDH activities and MDA content of triploid crucian carp (Carassius auratus)


3 讨 论

酸化剂对鱼类生长的影响受多种因素影响，其中酸化剂的类型和添加量、鱼的种类、饲料的营养水平与系酸力等是较为主要的因素。据报道，在饲料中添加2、3 g/kg的柠檬酸后鲤鱼、罗非鱼增重率分别提高了12.3%[9]、12.5%[15]；柠檬酸还可促进草鱼[8]、虹鳟[11]、中国对虾[16]和异育银鲫[17]的生长；乳酸和磷酸对罗非鱼也有一定的促生长作用[18]；但在革胡子鲶饲料中添加柠檬酸并无明显促生长作用[19]。本研究以湘云鲫为研究对象，添加1～16 g/kg的L-苹果酸，结果显示，饲料中添加L-苹果酸后，湘云鲫的生长和对饲料的利用效果都得到提高，其中4 g/kg组生长效果最佳，这与潘庆等[20]在罗非鱼饲料中添加1～4 g/kg的柠檬酸得到的结果相似。

苹果酸的促生长机制与其可降低饲料和消化道pH，提高消化酶活性有关。对无胃鱼而言，酸性食糜可刺激十二指肠和胰脏分泌更多的消化液以中和其中的酸，以此为肠道中消化酶提供适宜pH环境[21]。饲料系酸力可反映饲料结合酸的能力，系酸力越高的饲料，酸结合能力越强，在消化道内结合的游离酸就越多，导致消化道内pH升高越多，破坏鱼类适宜消化吸收的酸性环境。大量研究结果表明，降低饲料系酸力能有效提高畜禽饲料采食量，促进生长发育，并大幅提高日增重和饲料转化率[22, 23, 24]。本试验结果表明，在湘云鲫饲料中添加适量L-苹果酸后，饲料系酸力降低，湘云鲫摄食量和增重率增加，这与上述研究结果相一致。目前苹果酸对鱼类消化酶活性影响的研究尚未见报道，相近的研究表明，罗非鱼饲料中添加1～4 g/kg的柠檬酸，饲料pH呈下降趋势，胃蛋白酶、肝胰脏蛋白酶、肠道淀粉酶活性呈先上升后下降趋势[20]；王纪亭等[21]报道，在鲤鱼饲料中添加0.3%的复合酸，显著提高了肝胰脏、肠道蛋白酶活性，淀粉酶、脂肪酶活性有升高的趋势，但与对照组差异不显著。在本试验中，饲料中添加L-苹果酸后，湘云鲫肠道淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶以及Na+/K+-ATP酶的活性均不同程度升高，并均在8 g/kg组达到最大值。而当添加水平达到16 g/kg时，除脂肪酶外的肠道其他各酶活性均显著降低，这与16 g/kg组增重率及饲料效率低于适宜添加组的结果相一致。上述结果说明，饲料中适量添加酸化剂有利于刺激肠壁消化腺的代谢分泌活动，增加消化酶的分泌量，提高消化酶活性，促进消化吸收，从而促进生长；添加过量的酸化剂则可能对消化道表面造成损伤，使鱼类处于应激状态[25]，生长促进作用显著降低。

前人关于酸化剂对鱼类体组成影响的研究表明，罗非鱼饲料中添加1%～4%柠檬酸[11]或0.3%的磷酸、富马酸、乳酸[10]，草鱼饲料中添加0.21%的磷酸、柠檬酸、乳酸、复合酸[8]均对鱼体组成无显著影响。但在本试验中，饲料中添加L-苹果酸后，湘云鲫鱼体水分含量下降，粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量增加，且饲料蛋白质、脂肪和灰分沉积率均显著增加，以饲料灰分和脂肪沉积率的增高最为明显，这可能与苹果酸提高矿物质的利用[8]和提高肝脏MDH活性有关，MDH活性越高，机体产生的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)越多，从而促进了脂肪的沉积。

动物机体抗氧化能力是衡量机体健康状态的重要指标之一，SOD是一类特异性消除超氧自由基的循环酶，主要负责过氧化和嗜菌作用造成的组织损伤的防御保护作用[26]。机体中MDA的含量反映的是机体脂质过氧化的程度，从而反映出细胞损伤程度[27]。尚卫敏等[8]在饲料中添加4种不同类型酸化剂后发现，4种酸化剂均可显著提高草鱼机体的抗氧化能力；张纯等[28]研究发现，饲料中添加200～400 mg/kg绿原酸能显著增强建鲤的抗氧化能力；吴军林等[29]发现，L-苹果酸能够显著改善老年大鼠机体代谢酶的代谢能力，有利于增强肝组织新陈代谢和抗氧化能力。本试验中，饲料中适量添加L-苹果酸可显著提高湘云鲫肝脏中SOD的活性并同时显著降低MDA的含量，说明L-苹果酸可提高湘云鲫机体抗氧化能力。其原因可能是L-苹果酸能使机体保持还原状态，为抗氧化酶的还原和再生提供有利的条件，促进机体的能量代谢速率，为大分子蛋白质的合成提供能量基础。

4 结 论

① 饲料中适量添加L-苹果酸能够促进湘云鲫生长，降低饲料系数，增加鱼体营养物质沉积，提高消化和抗氧化能力。

② 湘云鲫饲料中L-苹果酸的适宜添加量为4~8 g/kg。

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