孵化机，购于北京蓝天蛟电子技术有限公司。

叶酸标准品(Sigma)∶ C₁₉H₁₉N₇O₆，纯度≥97％。

选用114枚萨索肉鸡种蛋，采用单因子完全随机设计，将其分为3组：生理盐水组(每枚种蛋注射0.1 mL生理盐水)、45 μg叶酸组(每枚种蛋注射含45 μg叶酸的0.1 mL的生理盐水)、90 μg叶酸组(每枚种蛋注射含90 μg叶酸的0.1 mL的生理盐水)。孵化后每组4个重复，每个重复6只鸡。孵化期21 d，饲养期42 d。

叶酸注射液的配制：分别称取2.25、4.50 mg的叶酸，加4.50 mL蒸馏水，然后滴加1.0 mol/L NaOH至叶酸完全溶解，再用0.1 mol/L HCl调pH至6.8～7.2，最后定容至5 mL，则分别配制成450和900 μg/mL的叶酸注射液。

孵化期间参数：温度，前期(1～10 d)控制在38.0～38.2 ℃，后期(11～19 d)控制在37.8～38.0 ℃；整个孵化期湿度控制在45%～65%；翻蛋周期为120 min，翻蛋时间为180 s；孵化前期注意控温，孵化后期注意通风换气。注射部位为卵黄囊(种蛋大头约1/3处)。

试验参照NRC(1994)肉鸡营养需要配制基础饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表1。所有试鸡采用舍内笼养方式，各重复均匀分布于鸡舍。自由采食、饮水。按常规程序进行鸡只免疫和栏舍消毒。

试验数据均以“平均值±标准差”表示，采用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，LSD法多重比较检验。

由表2可知，孵化期11胚龄注射不同水平叶酸对1～21日龄和22～42日龄肉仔鸡的ADFI和F/G均无显著影响(P>0.10)，但对1～21日龄和22～42日龄肉仔鸡的ADG产生了影响(P=0.050)，与生理盐水组比较，45 μg叶酸组和90 μg叶酸组肉仔鸡的ADG显著提高(P=0.047；P=0.024)。孵化期11胚龄注射不同水平叶酸有提高1日龄肉仔鸡体重的趋势(P=0.110)，对21日龄肉仔鸡体重产生了影响(P=0.055)，且与生理盐水组比较，45 μg叶酸组和90 μg叶酸组肉仔鸡体重不同程度提高(P=0.026；P=0.053)，而叶酸组之间无显著差异(P>0.10)，对42日龄肉仔鸡体重也产生了影响(P=0.069)，且与生理盐水组比较，45 μg叶酸组和90 μg叶酸组肉仔鸡体重有不同程度提高(P=0.050；P=0.038)，而叶酸组之间无显著差异(P>0.10)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 孵化期11胚龄注射不同水平叶酸对肉仔鸡生产性能和免疫器官指数的影响 Table 2 Effects of injecting different levels of folic acid at 11 embryonic ages during incubation period on performance and immune organ indices of broilers 项目 Items 日龄 Days of age/d 叶酸水平 Folic acid level/μg 0 45 90 平均日采食量 ADFI/g 55.53±2.78 56.50±4.22 54.03±3.59 平均日增重 ADG/g 1～21 3.78±0.89a 8.15±1.19b 7.38±1.23b 料重比 F/G 1.82±0.22 1.78±0.32 1.50±0.16 平均日采食量 ADFI/g 151.63±27.83 175.57±24.65 177.07±10.27 平均日增重 ADG/g 22～42 27.38±6.92a 57.43±11.97b 63.53±1.26b 料重比 F/G 4.61±0.97 3.73±0.74 4.16±1.31 1 43.20±0.58b 39.20±1.91a 40.20±1.02ab 体重 BW/g 21 123.00±18.00a 209.50±24.50b 195.80±25.18b 42 807.60±71.28a 1 314.80±221.15b 1 358.60±171.86b 脾脏指数 Spleen index/(10-2 g/kg) 1 2.22±0.01a 3.14±0.01ab 4.40±0.01b 21 22.40±0.01 18.30±0.01 27.30±0.01 42 13.80±0.01 35.80±0.01 18.50±0.01 法氏囊指数 Bursa of Fabricius index/ (10-2 g/kg) 1 12.80±0.01b 7.30±0.01a 12.50±0.01b 21 10.80±0.01a 21.30±0.01b 15.30±0.01ab 42 19.10±0.01 21.10±0.01 14.30±0.01 同行生产性能数据肩标不同小写字母表示在P<0.10水平上差异显著，无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.10)。 In the same row, values of performance with different small letter superscripts mean significant difference at P<0.10, while no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.10). 同行器官指数数据肩标不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著，无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)。 In the same row, values of organ indices with different small letter superscripts mean significant difference at P<0.05, while no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

表2 孵化期11胚龄注射不同水平叶酸对肉仔鸡生产性能和免疫器官指数的影响 Table 2 Effects of injecting different levels of folic acid at 11 embryonic ages during incubation period on performance and immune organ indices of broilers

孵化期11胚龄注射不同水平叶酸对21日龄和42日龄肉仔鸡脾脏指数无显著影响(P>0.05)，但对1日龄肉仔鸡脾脏指数产生了显著影响(P=0.022)，且与生理盐水组比较，90 μg叶酸组脾脏指数显著增加(P=0.007)，而生理盐水组和45 μg叶酸组以及2个叶酸组之间无显著差异(P>0.05)。孵化期11胚龄注射不同水平叶酸对42日龄肉仔鸡法氏囊指数无显著影响(P>0.05)，但与45 μg叶酸组比较，生理盐水组和90 μg叶酸组显著增加了1日龄肉仔鸡法氏囊指数(P=0.036；P=0.047)，而生理盐水组和90 μg叶酸组之间无显著差异(P>0.05)，且45 μg叶酸组相比生理盐水组显著增加了21日龄肉仔鸡法氏囊指数(P=0.025)。

由表3可知，孵化期11胚龄注射不同水平叶酸对1日龄肉仔鸡血浆叶酸含量及1日龄、21日龄和42日龄肉仔鸡血浆总蛋白和白蛋白含量均无显著影响(P>0.05)，对21日龄和42日龄肉仔鸡血浆球蛋白含量也无显著影响(P>0.05)，但对1日龄肉仔鸡血浆球蛋白含量产生了显著影响(P=0.049)，与生理盐水组和90 μg叶酸组比较，45 μg叶酸组肉仔鸡血浆球蛋白含量显著升高(P=0.035；P=0.023)，生理盐水组和90 μg叶酸组之间无显著差异(P>0.05)。

由表4可知，孵化期11胚龄注射不同水平叶酸对1日龄肉仔鸡肝脏总超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性以及丙二醛含量均无显著影响(P>0.05)。

由表5可知，孵化期11胚龄注射不同水平叶酸对28日龄肉仔鸡血液CD4⁺比例、CD4⁺/CD8⁺及40日龄肉仔鸡血液CD4⁺比例、CD8⁺比例、CD4⁺/CD8⁺均无显著影响(P>0.05)，但与生理盐水组比较，注射45和90 μg叶酸有提高40日龄肉仔鸡血液CD4⁺/CD8⁺的趋势(P>0.05)。孵化期11胚龄注射不同水平叶酸对28日龄血液CD8⁺比例产生了显著影响(P=0.028)，45 μg叶酸组CD8⁺比例较生理盐水组显著降低(P=0.010)，而90 μg叶酸组与生理盐水组和45 μg叶酸组比较均无显著差异(P>0.05)。

目前，饲粮中添加叶酸对动物生产性能的研究相对较多，而有关孵化期注射叶酸对肉仔鸡生产性能的研究报道不多。叶酸是所有动物繁殖过程中所需的关键维生素，且与产蛋需要量相比，孵化需要量更高^[12]。同时，叶酸能够提高动物生产性能，其不足或过量可通过影响动物机体的蛋白质代谢影响机体蛋白质的合成，最终对动物生产性能产生影响^[13]。晏家友^[14]研究发现，在母猪饲粮中补充叶酸，可提高种猪的繁殖性能和仔猪的断奶重(P<0.05)。葛文霞^[15]在研究中指出，饲粮中添加叶酸显著提高了1日龄艾维茵商品肉仔鸡的日增重和日采食量(P<0.05)，同样有研究表明在种鸡饲粮添加叶酸可提高肉仔鸡体重(P<0.05)，从而影响肉仔鸡的生长速度和料重比(P<0.05)^[16]。本试验中，肉仔鸡父母代饲粮中的叶酸含量为24.32 mg/kg，而在孵化期11胚龄注射45和90 μg叶酸显著增加了1～21日龄和22～42日龄肉仔鸡的ADG(P=0.047；P=0.024)，且叶酸组不同程度地提高了肉仔鸡的体重，表明孵化期注射叶酸可在一定程度上提高肉仔鸡的生产性能，与以上饲粮中添加叶酸试验结果类似，说明种鸡若饲粮中叶酸缺乏可能会影响肉仔鸡的生长，进而表明叶酸在禽类存活及生长方面起重要作用，可促进机体的生长^[17]。而有研究发现，种鸡饲粮中添加叶酸对肉仔鸡的生产性能无显著影响(P>0.05)^[18]。 Rebel等^[7]也发现，种鸡和肉鸡饲粮中添加维生素和微量元素对肉鸡体重和ADFI无显著影响(P>0.05)，对脾脏指数也无显著影响(P>0.05)。以上试验结果的不同可能是由于作用时间、添加剂量、动物品种等因素不同而造成的。

脾脏、胸腺和法氏囊指数可用于评价禽类的免疫状态。一般认为免疫器官重量减小为免疫抑制所致，而免疫器官重量增加代表免疫增强^[19]。本试验中注射90 μg叶酸显著提高了1日龄肉仔鸡的脾脏指数(P<0.05)，注射45 μg叶酸显著提高了21日龄肉仔鸡法氏囊指数(P<0.05)，说明注射叶酸可影响免疫器官指数进而影响肉仔鸡的免疫状态,从而间接影响动物的生产性能。

机体出现缺陷是由于营养物质的摄入不足，而有些维生素对于氨基酸转化为球蛋白是必需的。因此，如果机体维生素摄入不足，则会影响机体免疫力，进而出现缺陷现象。叶酸缺乏会引起代谢异常，从而导致白蛋白减少、贫血，进而影响机体的免疫功能^[20]。有研究报道，蝶酰谷氨酸对提高肉仔鸡的免疫力有重要作用^[21]。本试验中注射叶酸对1日龄肉仔鸡血浆叶酸含量无显著影响(P>0.05)，这与Schweigert等^[22]在饲粮中添加叶酸的研究结果相似，而注射45 μg叶酸显著增加了血浆球蛋白含量(P<0.05)，这与Munyaka等^[23]添加叶酸试验结果一致。这说明注射的叶酸在血液中部分用于免疫蛋白的合成，从而对肉仔鸡的免疫功能产生一定影响,表明叶酸可通过参与球蛋白的合成而影响机体的免疫状态，最终间接提高动物的生产性能。但本试验在血液指标的测定中由于个体误差对结果的精密性产生一定影响，这也可能是由于不同个体对注射的叶酸产生的不同反应，以后需通过增加样本数量等方法来避免这一问题的出现。

Pravenec等^[24]发现，叶酸不足的饲粮可降低小鼠的肝脏、肾脏及心脏抗氧化酶(如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶)的活性(P<0.01)。本试验中注射叶酸对1日龄肉仔鸡肝脏抗氧化能力无显著影响(P>0.05)。叶酸影响氧化应激的机理：叶酸不足会促进机体的氧化应激，原因是在叶酸水平降低的同时同型半胱氨酸水平升高，此过程与抗氧化酶活性降低有关(如谷胱甘肽过氧化酶活性的降低等)，从而导致机体发生氧化应激。正常情况下，同型半胱氨酸浓度越低，机体越能保持完美的生化平衡，如果同型半胱氨酸浓度不在较低或平衡范围内，将导致机体的氧化和衰老等现象的发生。本试验出现的结果可能是因为注射的叶酸没有在肝脏中达到一定多的沉积量，而主要用于循环系统中的叶酸需要，从而对肝脏的抗氧化能力无显著作用。另一个可能的原因是叶酸作用具有组织、器官特异性，而其肝脏中同型半胱氨酸浓度比较低，使叶酸对肝脏的抗氧化能力无显著作用。

研究报道，维生素、微量元素、脂类、蛋白质及核苷酸在调节细胞免疫和体液免疫过程中发挥关键作用，营养素不足或过量都可对免疫功能产生不利影响，从而使机体易受病原感染^{[25, 26]}。许多维生素被证明可影响抗体的产生及具有抗感染能力^[27]。而淋巴细胞亚群的稳定是维持机体正常免疫调节功能所必需的，是评价机体细胞免疫功能的重要指标。现代免疫学理论认为，机体T淋巴细胞各亚群之间相互平衡、互相调节，使机体对外来抗原袭击产生正常免疫应答，并维持机体的免疫平衡状态。因此，CD4⁺、CD8⁺可作为评估免疫状态的主要依据，其比值降低是免疫缺陷的标志^{[28, 29]}。研究表明，种鸡饲粮中添加叶酸对血液及脾脏中的CD3 、CD4⁺、CD8⁺比例以及CD4⁺/CD8⁺均无显著影响(P>0.05)^[23]。而Field等^[30]发现在小鼠饲粮中添加叶酸可缓解因年龄造成的T细胞群分化、增殖降低的状况。在叶酸缺乏情况下，T细胞在分裂素刺激下的分裂能力降低^[31]，添加叶酸则可增强T细胞的增殖^[32]。且有报道指出CD4⁺/CD8⁺高与肉鸡高的免疫力有关^[33]。本试验中注射45 μg叶酸显著降低了28日龄肉仔鸡血液中CD8⁺比例(P<0.05)，说明注射叶酸在一定程度上可影响T淋巴细胞亚群，从而对肉仔鸡的免疫力产生作用，最终影响肉仔鸡的生产性能。