动态pH连续监测记录系统主要由pH电极、pH变送器和无纸记录仪组成。使用前先用pH 4.00和pH 7.00标准液进行标定，然后将pH电极通过瘤胃瘘管插入瘤胃内，同时电极下挂有一定的重物保证电极处于瘤胃腹囊中。通过变送器将信号输入到无纸记录仪上。无纸记录仪设定为每隔5 min记录1次pH，上传到计算机上进行数据分析。数据分析计算pH平均值、最大值、最小值，以及pH为5.2~(<5.5)所持续时间，该阶段视为试验动物处于SARA状态。

对照组、SARA组和恢复组试验奶山羊宰杀前禁食12 h，宰杀后立即取瘤胃后背盲囊、后腹盲囊、前腹盲囊、前背盲囊及瓣胃组织块，去肌层，剔除结缔组织，去掉内容物后用无菌生理盐水反复冲洗干净，然后以吸水纸吸干组织块表面水分，用载玻片刮取各部位并立即置于冻存管中，标记后置于-80 ℃冰箱中保存待用；取上述组织块(1 mm×1 mm×1 mm)置于4%戊二醛溶液中固定，用于电镜的观察；取组织块(1 cm×1 cm)若干放于10%的福尔马林中固定，进行PCNA和TUNEL的检测。

取瘤胃后背盲囊、后腹盲囊、前腹盲囊、前背盲囊及瓣胃组织块(1 mm×1 mm×1 mm)置于4%戊二醛溶液中固定，用于电镜切片的制作，分别观察对照组、SARA组及恢复组瘤胃及瓣胃上皮细胞中细胞器的变化及是否有凋亡小体的形成。

以牛血清白蛋白作为标准，参照Lowry等^[3]的方法测定蛋白质含量；DNA和RNA含量测定采用二苯胺法^[4]，以小牛胸腺DNA作为标准，RNA含量通过测定260和332 nm处的吸光值，用Fleck-Begg公式^[5]算出。

采用En-Vosion法免疫组织化学染色标记PCNA、PCNA一抗(英国Abcam公司)。

石蜡切片常规脱蜡至水→磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次3 min →细胞松弛素B(CB)热诱导修复，室温自然冷却→PBS洗3次，每次3 min→0.3％过氧化氢(H₂O₂)抑制内源性过氧化物酶室温孵育20 min→PBS洗3次，每次3 min→20%羊血清室温孵育30 min→滴加适当稀释特异性一抗37 ℃孵育2 h→PBS洗3次，每次3 min→En-Vision试剂(HRP-R/M)37 ℃孵育30 min→PBS洗3次，每次3 min→二氨基联苯胺(DAB)显色8～12 min，苏木素精衬染，热水蓝化→吹干后树脂封片→镜下观察。

参照许岸高等^[6]的标准每张切片在普通光学显微镜下连续观察至少5个以上高倍视野计数阳性细胞数，细胞核着棕褐色即为阳性染色细胞。随机计数瘤胃、瓣胃上皮细胞总数和PCNA阳性细胞数，计算增殖指数，公式为：

参考Gavrieli等^[7]方法，应用TUNEL试剂盒，结合说明书的方法，稍有改动。

石蜡切片常规脱蜡至水→PBS洗3次，每次3 min→蛋白酶K(20 μg/mL)孵育20 min→PBS洗3次，每次3 min→4%多聚甲醛溶液孵育5 min→PBS洗3次，每次3 min→TUNEL混合液→PBS洗3次，每次3 min→1∶ 500辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(streptavidin-HRP)孵育30 min→PBS洗3次，每次3 min→DAB+H₂O₂显色30 min→去离子水漂洗若干次→吹干、树脂封片→镜下观察。

每张切片在普通光学显微镜下连续观察至少5个以上高倍视野计数阳性细胞数，凋亡细胞即为细胞核中出现棕褐色颗粒或者细胞核质呈均匀的棕褐色者，随机计数瘤胃、瓣胃上皮细胞总数和TUNEL阳性细胞数，计算凋亡指数，公式为：

由表6可以看出，SARA组瘤胃上皮细胞AI/PI为1.78，显著高于对照组(0.23)(P<0.05)。恢复组为0.87，高于对照组，且低于SARA组，差异均显著(P<0.05)。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 SARA对瘤胃和瓣胃上皮细胞AI/PI的影响 Table 6 Effects of SARA on the ratio of apoptosis index and proliferation index of rumen and omasum epithelial cells 项目 Items 对照组 Control group SARA组 SARA group 恢复组 Recovery group 瘤胃上皮细胞 Rumen epithelial cells 0.23±0.01c 1.78±0.21a 0.87±0.05b 瓣胃上皮细胞 Omasum epithelial cells 0.14±0.02b 1.45±0.44a 1.11±0.32a

表6 SARA对瘤胃和瓣胃上皮细胞AI/PI的影响 Table 6 Effects of SARA on the ratio of apoptosis index and proliferation index of rumen and omasum epithelial cells

对照组、SARA组及恢复组瓣胃上皮细胞AI/PI分别为0.14、1.45、1.11，SARA组与对照组相比差异显著(P<0.05)，而与恢复组相比差异不显著(P>0.05)。

机体生长发育的基础是细胞数目的增殖和体积的增大，其中蛋白质、DNA和RNA又是细胞增殖的基础。从根本上讲动物机体的生长代谢是一些生物大分子(蛋白质、DNA和RNA)不断合成，又不断的代谢并最终降解的一个动态过程。机体的一切生理代谢都离不开这些生物大分子。蛋白质是构成动物机体组织、器官的主要成分，机体的生命活动离不开蛋白质。而蛋白质的合成又离不开RNA，无论是何种RNA(mRNA、tRNA或者是rRNA)都参与蛋白质的合成，因此，了解蛋白质的合成情况可以定量的测定RNA的含量变化，也可以通过RNA/DNA来更确切的了解蛋白质的合成情况。DNA是携带遗传信息的生物大分子，同时DNA又与细胞分化、细胞核体积大小密切相关。研究DNA含量就可以从单位组织中了解细胞的增殖情况。

本试验通过测定瘤胃和瓣胃黏膜蛋白质、DNA和RNA含量来揭示瘤胃和瓣胃上皮细胞增殖情况。本试验中，瘤胃黏膜RNA/DNA由高到低依次是对照组、恢复组、SARA组，而RNA/DNA更确切地反映蛋白质合成情况，因此，对照组瘤胃蛋白质合成强于恢复组，而SARA组最弱，这与直接测定蛋白质含量的结果相一致。DNA含量能够间接地反映细胞增殖情况，本试验研究发现，瘤胃黏膜DNA含量，对照组显著地高于恢复组,恢复组显著低于SARA组，证明对照组瘤胃细胞增殖量要高于恢复组和SARA组，SARA组最次。

目前，研究者普遍认为丁酸能够促进瘤胃上皮细胞的增殖。Sakata等^[8]研究认为，瘤胃快速灌注丁酸后，瘤胃上皮细胞指数分裂提高，并认为丁酸能够刺激瘤胃上皮细胞进行分裂，最终引起增殖。黄智南^[9]再次证明高营养水平饲粮对瘤胃上皮细胞增殖有促进作用。课题组前期研究^[10]表明，奶山羊饲喂不同NFC/NDF饲粮，随着NFC/NDF增加，SARA组瘤胃丁酸浓度增加，并且高于对照组和恢复组。SARA组丁酸浓度最高，其细胞增殖反而弱于对照组和恢复组，这与黄智南^[9]瘤胃灌注丁酸，瘤胃上皮细胞有增殖趋势相反。之所以出现截然不同的结果，可能与SARA模型建立方式不同，也可能是处于SARA阶段的奶山羊瘤胃内丁酸浓度过高，超出瘤胃对丁酸代谢作用，最终丁酸对瘤胃上皮细胞的增殖有抑制作用，但最主要的是SARA对瘤胃上皮细胞有损害作用。恢复组奶山羊在发生SARA后饲喂青干草，瘤胃上皮细胞增殖能力反而强于SARA组，但是与对照组相比较弱些，这可能是瘤胃丁酸浓度降低，或者是粗饲料能刺激瘤胃上皮细胞发育的原因。

本试验中，瓣胃黏膜DNA、RNA含量以及RNA/DNA各组间差异均不显著，从数值上看，对照组、恢复组、SARA组瓣胃RNA/DNA有依次降低趋势，但几乎接近，结果反映出蛋白质合成情况是：对照组瓣胃蛋白质合成略强于恢复组，而SARA组略低于恢复组。DNA含量能够间接地反映细胞增殖情况，3组奶山羊瓣胃黏膜DNA含量几乎接近，也说明了SARA对瓣胃上皮细胞增殖没有影响作用。此结论与Shen等^[11]和黄智南^[9]研究饲粮营养水平对瓣胃黏膜生长发育的影响不明显相一致。

细胞凋亡是机体细胞在内外环境改变的情况下，按照自身的程序，引起细胞主动性死亡，最后完成脱落、裂解而后被吞噬的过程。细胞凋亡是生命活动中的正常现象，为机体正常细胞的更新和异常细胞的清除提供了手段，对机体维持正常生理代谢功能具有重要的作用和意义。据Hall等^[12]报道小肠黏膜每日每根绒毛有900～1 200个小肠上皮细胞发生凋亡，以维护肠道屏障的生理功能，确保新老细胞的更替。对于反刍动物瘤胃及瓣胃而言，上皮细胞的增殖与凋亡达到动态平衡，胃肠通透性才能保持完整，屏障功能处才能处于正常状态^{[13, 14, 15, 16]}。近些年来，人们侧重于研究SARA对瘤胃内发酵产物影响，据胡红莲^[17]、赵培厅^[18]报道，SARA能引起瘤胃乳头大面积脱落。黄智南^[9]研究认为，高营养饲粮能够降低瓣胃角质层细胞层数。本试验研究发现，SARA能引起瘤胃乳头脱落，降低瘤胃及瓣胃角质层厚度，结论也证实了前人的研究成果。但是人们却忽视了胃肠道上皮细胞凋亡对屏障功能的影响。本试验研究认为，瘤胃及瓣胃上皮细胞凋亡指数受饲粮NFC/NDF影响，处于SARA阶段的关中奶山羊瘤胃及瓣胃上皮细胞凋亡较对照组和恢复组显著增强，说明SARA时瘤胃及瓣胃上皮细胞发生过度凋亡。瘤胃及瓣胃上皮细胞发生过度凋亡，导致瘤胃及瓣胃屏障遭到损伤，尤其是机械屏障。瘤胃及瓣胃角质层构成了机械屏障，与胃内容物直接接触，因而受到损伤的几率最大。同时，当SARA发生时，瘤胃内挥发性脂肪酸(VFA)大量积累导致pH升高，瘤胃及瓣胃处于异常应激状态，造成瘤胃及瓣胃破损、出血及溃疡等^[19]，从而导致上皮细胞凋亡进一步增加，胃黏膜的通透性增高，引起屏障功能减弱，大量内毒素及细菌由瘤胃壁进入血液循环造成内毒素血症^[20]，进一步破坏瘤胃壁，加重了SARA的发展^[21]。因而本试验可以推测SARA能促进瘤胃及瓣胃上皮细胞凋亡的发生，是导致瘤胃及瓣胃黏膜屏障功能障碍的一个重要因素。

PCNA是DNA聚合酶δ的一种辅助蛋白质，其分子质量为36 ku^[22]，在DNA复制过程中起着关键性作用，且仅存在于肿瘤细胞或者存在于正常增殖的细胞内。细胞的增殖状态及增殖周期与PCNA有着密切的联系，在细胞G₁期，PCNA的表达快速增高，在G₁/S期交界处PCNA的表达处于峰值状态，在整个细胞周期的S期PCNA表达处于持续高水平状态，到了细胞周期M期和G₁早期PCNA的表达处于低水平状态。因此，PCNA被认为是细胞周期S期的特异性的分子学指标之一^[23]。能够客观反映细胞的增殖程度，被研究人员作为一种理想的增殖细胞标志^[24]。检测PCNA阳性细胞数(增殖指数)变化可以反映瘤胃及瓣胃黏膜损伤修复状况。本试验中，瘤胃上皮细胞增殖指数受饲粮NFC/NDF影响，SARA组瘤胃上皮细胞增殖指数显著降低，与对照组奶山羊比较差异显著，说明SARA时瘤胃上皮细胞PCNA表达减少，提示SARA对瘤胃细胞增殖有抑制作用，不利于损伤修复。恢复组增殖指数低于对照组，但显著高于SARA组，恢复组与对照组差异不显著。证明恢复组的恢复情况好于SARA组但不及对照组。3组间瓣胃上皮细胞增殖指数分别为64.67%、42.33%、42.67%，SARA组与对照组差异显著，证明SARA对瓣胃上皮细胞PCNA表达也有抑制作用，但SARA组与恢复组差异不显著。提示SARA对瓣胃上皮细胞增殖有抑制作用，不利于损伤修复。

PCNA是评价细胞增殖的重要指标，是反映细胞增殖状态的重要指标^[25]，细胞凋亡又是生命活动中的正常现象，为机体正常细胞的更新和异常细胞的清除提供了手段。细胞凋亡和细胞增殖必须同步协调，才能维持黏膜的完整性，从而确保胃肠屏障功能稳定发展，表现在细胞AI/PI处于定值^[6]，而AI/PI较凋亡指数更为准确的评价细胞动力学改变^[26]。本试验中，SARA组瘤胃上皮细胞AI/PI显著高于对照组，恢复组AI/PI高于对照组且低于SARA组，而瓣胃上皮细胞AI/PI由高到底依次是SARA组、对照组、恢复组瘤胃和瓣胃上皮细胞。恢复组AI/PI略低于SARA组，但是又高于对照组，说明奶山羊在发生SARA后停止诱导其中毒，再次给予青干草可以缓解SARA症状，但是恢复不到对照组状态。因此，从AI/PI角度考虑，SARA对奶山羊瘤胃及瓣胃上皮细胞凋亡有促进作用，对增殖有抑制作用。

综上，处于SARA阶段奶山羊瘤胃及瓣胃上皮细胞凋亡指数明显要高于对照组和恢复组，而细胞增殖与凋亡指数呈现相反结果，即SARA组低于对照组和恢复组，恢复组高于SARA而低于对照组。上皮细胞的增殖与凋亡的相对平衡是维持屏障完整性的保障，因此，SARA对瘤胃及瓣胃上皮细胞增殖起到抑制作用而对凋亡起到促进作用，使其屏障功能遭到严重破坏，进而加重SARA发生。