设计2种等氮等能饲料，原料均购自广东粤海饲料集团公司，对照饲料(全鱼粉饲料)以鱼粉为蛋白质源，试验饲料(玉米蛋白粉替代饲料)在对照饲料基础上以玉米蛋白质(玉米蛋白粉形式)替代10%鱼粉蛋白质，饲料组成及营养水平见表1。饲料原料粉碎后过筛(孔径0.25 mm)，加工成直径3.0 mm的颗粒，风干后冷藏备用。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (DM basis) % 项目 Items 对照饲料 Control diet 试验饲料 Experimental diet 原料 Ingredients 玉米蛋白粉 Corn gluten meal1) 7.55 鱼粉 Fish meal2) 68.00 61.20 淀粉 Starch 15.00 15.00 豆油 Soybean oil 2.20 2.39 鱼油 Fish oil 2.20 2.39 乌贼内脏膏 Squid visceral ointment 2.00 2.00 复合预混料 Compound premix3) 2.50 2.50 纤维素 Fiber 5.60 4.47 黏合剂 Binder 2.50 2.50 合计 Total 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels4) 粗蛋白质 CP 44.33 44.34 粗脂肪 EE 10.18 10.17 消化能 DE/(MJ/kg) 19.28 19.30 1)粗蛋白质水平为(59.91±1.43)%。CP level was (59.91±1.43)%. 2)粗蛋白质水平为(66.58±3.16)%。CP level was (66.58±3.16)%. 3)复合预混料为每千克饲料提供Compound premix provided the following per kg of diets: VA 56.25 mg，VE 562.5 mg，VK 75 mg，VB1 62.5 mg，VB2 312.5 mg，VB6 37.5 mg，烟酸 niacin 1 125 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 250 mg，肌醇 inositol 375 mg，生物素 biotin 10 mg，叶酸 folic acid 12.5 mg，对氨基苯甲酸PABA 375 mg，VB12 0.187 5 mg，β-胡萝卜素 β-carotene 12.5 mg，VD 12.5 mg，糊精 dextrin 9 226.062 mg，KCl 1 131.875 mg，MgSO4·7H2O 1 255.625 mg，FeC6H5O7 1 087.5 mg，ZnSO4·7H2O 465.25 mg，CuSO4·5H2O 78.125 mg，MnSO4·6H2O 129.125 mg，KIO3 3.5 mg，CoCl2·6H2O 9.875 mg，Na2SeO3 5 mg，沸石粉 zeolite powder 8 334.125 mg。 4)粗蛋白质和粗脂肪为测定值,消化能为计算值。CP and EE were measured values, while the DE was a calculated value.

表1 饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (DM basis) %

试验用军曹鱼大规格幼鱼来自广东海洋大学东海岛海水鱼育苗场，育苗过程中投喂鱼糜。试验鱼从育苗池塘运到室内水泥池，继续用鱼糜驯养1周后，选取鱼体健康无损伤、大小相近[平均体质量(21.34±1.54) g]的幼鱼为试验对象。

试验鱼饲养在流水式水族箱(70 cm×60 cm×70 cm)中，分为1个对照组和1个试验组，每组3个重复，共6个水族箱，每箱放40尾。试验开始前饥饿24 h，分别测定所有试验鱼的初始体质量。对照组投喂全鱼粉饲料，试验组投喂玉米蛋白粉替代饲料，养殖24 d。试验期间每个水族箱的水量保持在200 L左右，日交换量为100%～150%。试验用水为经曝气、沉淀及沙滤的天然海水，持续充气，试验期间水族箱内水温26~29 ℃，盐度27～32，溶氧高于5 mg/L，pH 7.7左右，氨态氮<0.02 mg/L，硝态氮<2 mg/L；每天09:00和15:00定时投喂饲料至饱食，投喂1 h后回收残饵。

在试验开始后的第2、4、8、16和24天的20:00采样，每个水族箱采样6尾，放置在小水槽中饥饿24 h后采集，测量其湿重。

每次采集的6尾鱼中，全鱼和肌肉的碳、氮稳定同位素值各测定3尾；2种饲料各取5份，鱼粉和玉米蛋白粉各取5份，测定其碳、氮稳定同位素值。所有的样品均在70 ℃烘干并磨成均匀的粉状，通过氯仿-甲醇(50∶ 50，体积比)萃取去除脂类^[4]。脂类去除之后样品在60 ℃烘干，将0.7～0.9 mg的样品装入小锡囊中，送至美国加利福尼亚州达尔文大学，用PDZ Europa ANCA-GSL元素分析仪和PDZ Europa 20-20稳定同位素质谱仪进行测定。在分析过程中，加入谷氨酸和尼龙作为实验室的内部标准物质(稳定同位素值已知的均匀物质)进行多次重复测定，以确保分析数据的准确性。在本试验的样品测定过程中，谷氨酸和尼龙的碳、氮稳定同位素值实测数据的平均偏差范围分别是0.225‰和0.259‰以及0.072‰和0.161‰，符合同位素样品测定的精度要求。用学术界惯用的δ值来代表样品的稳定同位素值：

式中：X表示所测定的稳定同位素种类，在本试验中分别是碳和氮，下文分别使用δ¹³C和δ¹⁵N来表示碳、氮稳定同位素值；R_sample表示样品的重、轻稳定同位素比率；R_standard表示标准物质的重、轻稳定同位素比率；δ¹³C的标准物质使用维也纳箭石化石(PeeDee)，δ¹⁵N的标准物质使用大气中的氮。

预先测定饲料的溶失率，根据投饵量和校正的残饵量计算试验期间各水族箱的实际摄食量；增重率(weight gain rate,WGR)、特定生长率(special growth rate,SGR)、饲料转化率(feed conversation rate,FCR)和蛋白质效率(protein efficiency rate,PER)的计算公式如下：

式中：M₀(g)和M_t(g)分别为试验鱼的初始体质量和终末体质量(湿重基础)；FI(g)和M_p(g)分别为试验鱼的摄食饲料总量和摄入蛋白质的质量(风干基础)；t(d)为饲喂天数。

用双源单稳定同位素混合模型^[5]来估算不同蛋白质源对幼鱼蛋白质生长的贡献率(方程1)：

式中：F₁和F₂分别是饲料中玉米蛋白质和鱼粉蛋白质对幼鱼蛋白质生长的贡献率；δ¹⁵N_fish是试验鱼与饲料达到氮稳定同位素平衡时，鱼体或肌肉的δ¹⁵N；Δδ¹⁵N是鱼体或肌肉由于代谢作用造成的氮同位素富集因子；δ¹⁵N₁是玉米蛋白质的δ¹⁵N，δ¹⁵N₂则是鱼粉蛋白质的δ¹⁵N。式中的δ¹⁵N₁和δ¹⁵N₂可以直接测定，δ¹⁵N_fish和Δδ¹⁵N可以通过试验数据的回归分析确定。为保证计算精度，该模型一般要求试验鱼的体质量在养殖试验结束时增长3倍以上。

饲料变化后动物体天然稳定同位素组成变化是组织生长和组织代谢共同作用的结果，为预测本试验所观察到的鱼体天然同位素变化规律，确定全鱼或肌肉的δ¹⁵N_fish，采用了Hesslein指数模型^[6](方程2)：

式中：R_sample为新饲料饲养t天时鱼体组织的稳定同位素值；R₀为鱼体组织与初始饲料达到平衡时的δ¹³C或δ¹⁵N；R_n为鱼体组织与新饲料达到稳定同位素平衡时的δ¹³C或δ¹⁵N(其中δ¹⁵N即方程1中的δ¹⁵N_fish)；m为鱼体的代谢周转常数；k为鱼体的生长率常数。

在本试验中，Hesslein指数模型中的R₀取试验开始前军曹鱼幼鱼的δ¹³C和δ¹⁵N；R_n和m可以将试验鱼的δ¹³C和δ¹⁵N随养殖时间而变化的实测数据代入方程2，通过SPSS 17.0中的迭代非线性回归计算出来。

生长率常数k为生长情况的估算值，可通过指数生长方程^[6](方程3)获得：

式中：W为鱼体最终湿重；W₀为鱼体起始湿重；t为饲养天数；k为生长率常数。

Hesslein指数模型中的参数k和m，能分别反映鱼体的生长和代谢周转对鱼体同位素比率变化的影响。因此，在计算出k和m之后，还能估算出摄食新饲料之后，鱼体碳、氮元素周转半时(以T₅₀表示)，从而评估碳、氮元素在试验鱼体内的代谢周转速度^[6]：

在计算出方程2中的各参数之后，就可以通过比例换算法计算出方程1所需的同位素富集因子Δδ¹⁵N。由于试验鱼在摄食新饲料之后，其δ¹⁵N下降(R₀>R_n)，而δ¹³C上升(R₀n)，这表明在氮同位素变化过程中m和k的作用方向相反，而在碳同位素变化过程中m和k的作用方向相同，碳、氮同位素富集因子Δδ¹⁵N和Δδ¹³C的计算公式分别为：

用SPSS 17.0进行数据分析和迭代非线性回归计算。试验数据的组间差异显著性通过Student’s t检验方法来判断，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

由表2可知，试验组和对照组幼鱼的摄食量无显著差异(P＞0.05)，而试验组幼鱼的增重率、饲料转化率、蛋白质效率和特定生长率均显著小于对照组(P＜0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 投喂不同饲料的军曹鱼幼鱼的生长性能 Table 2 Growth performance of juvenile cobia fed different diets 组别 Groups 摄食量 FI/g 初体质量 IBW/g 终体质量 FBW/g 增重率 WGR/% 饲料转化率 FCR/% 蛋白质效率 PER/% 特定生长率 SGR/% 对照组 Control group 84.03 ±3.78 21.46 ±0.28 112.49 ±4.64 429.62 ±22.45 108.52 ±4.12 239.72 ±9.10 6.94 ±0.18 试验组 Experimental group 82.48 ±2.56 21.39 ±1.54 100.41 ±4.21* 370.47 ±15.63* 95.80 ±3.33* 211.58 ±7.35* 6.34 ±0.34* 试验组数据肩标*表示与对照组相比差异显著(P＜0.05)，* *表示差异极显著(P<0.01)。表4同。 Values in the experimental group with * superscripts mean significant difference (P＜0.05), and with * * superscripts mean extremely significant difference compared with control group (P＜0.01). The same as Table 4.

表2 投喂不同饲料的军曹鱼幼鱼的生长性能 Table 2 Growth performance of juvenile cobia fed different diets

在试验中分别测定了鱼粉蛋白质和玉米蛋白质、2种饲料、初始样品中全鱼和肌肉的δ¹³C和δ¹⁵N。由表3可知，鱼粉蛋白质和玉米蛋白质的δ¹³C和δ¹⁵N差异极显著(P＜0.01)，全鱼粉饲料和玉米蛋白粉替代饲料的δ¹³C和δ¹⁵N也差异显著(P＜0.05)，而初始样品中全鱼和肌肉的δ¹³C和δ¹⁵N差异不显著(P＞0.05)。

由表4可知，试验组的生长率常数k显著小于对照组(P＜0.05)；试验组全鱼和肌肉δ¹⁵N终值均显著小于对照组(P＜0.05)，而其全鱼和肌肉的δ¹³C终值与对照组则无显著差异(P＞0.05)。随着饲养时间的延长，军曹鱼幼鱼全鱼和肌肉的δ¹⁵N逐渐下降(图1)，而δ¹³C逐渐上升(图2)。

将试验鱼δ¹³C和δ¹⁵N随养殖时间而变化的实测数据(图1和图2)代入方程2，通过迭代非线性回归计算军曹鱼幼鱼全鱼和肌肉的碳、氮元素T₅₀，结果见表5和表6。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 投喂不同饲料的军曹鱼幼鱼的全鱼和肌肉氮元素周转 Table 5 Nitrogen element turnover in whole fish and muscle of juvenile cobia fed different diets 项目 Items Rn/‰ m/(10-2/d) Δδ15N/‰ T50/d 全鱼 Whole fish 对照组 Control group 17.23±0.02 0.47±0.17 0.04±0.01 9.55±0.18 试验组 Experimental group 16.12±0.04* 0.42±0.12 0.10±0.04* * 9.88±0.22 肌肉 Muscle 对照组 Control group 17.09±0.06 0.33±0.10 0.05±0.02 9.37±0.08 试验组 Experimental group 15.89±0.03* 0.51±0.05* 0.17±0.02* * 10.01±0.05*

表5 投喂不同饲料的军曹鱼幼鱼的全鱼和肌肉氮元素周转 Table 5 Nitrogen element turnover in whole fish and muscle of juvenile cobia fed different diets

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 投喂不同饲料的军曹鱼幼鱼的全鱼和肌肉碳元素周转 Table 6 Carbon element turnover in whole fish and muscle of juvenile cobia fed different diets 项目 Items Rn/‰ m/(10-2/d) Δδ15N/‰ T50/d 全鱼 Whole fish 对照组 Control group -16.17±0.05 3.80±0.19 0.31±0.01 6.03±0.13 试验组 Experimental group -15.41±0.02* 4.68±0.47* 0.65±0.04* * 5.72±0.22 肌肉 Muscle 对照组 Control group -15.82±0.00 2.20±0.32 0.26±0.03 6.99±0.19 试验组 Experimental group -16.40±0.01 2.44±0.45 0.15±0.02* * 7.79±0.16*

表6 投喂不同饲料的军曹鱼幼鱼的全鱼和肌肉碳元素周转 Table 6 Carbon element turnover in whole fish and muscle of juvenile cobia fed different diets

由表5可知，试验组与对照组幼鱼全鱼和肌肉氮元素周转的R_n差异显著(P＜0.05)，而Δδ¹⁵N差异极显著(P＜0.01)。试验组与对照组幼鱼全鱼氮元素周转的m差异不显著(P＞0.05)，而肌肉氮元素周转的m则差异显著(P＜0.05)，但在数值上均不到k的1/10。军曹鱼幼鱼全鱼和肌肉氮元素T₅₀为9~10 d，其中试验组与对照组幼鱼肌肉氮元素T₅₀差异显著(P＜0.05)，全鱼氮元素T₅₀差异不显著(P＞0.05)。

由表6可知，试验组与对照组幼鱼全鱼碳元素周转的R_n和m差异显著(P＜0.05)，而肌肉R_n和m则差异不显著(P＞0.05)；试验组与对照组幼鱼全鱼和肌肉的Δδ¹³C均差异极显著(P＜0.01)。试验组与对照组幼鱼碳元素周转的m较大，其数值接近k的1/2。军曹鱼幼鱼全鱼和肌肉碳元素T₅₀为6~8 d，其中试验组与对照组肌肉碳元素T₅₀差异显著(P＜0.05)，全鱼碳元素T₅₀差异不显著(P＞0.05)。

将各参数代入方程1，计算出在10%玉米蛋白粉替代饲料中，玉米蛋白质对军曹鱼幼鱼全鱼和肌肉蛋白质生长的贡献率分别为(7.64±0.49)%和(9.62±0.16)%，经检验，二者差异显著(P＜0.05)。

已有研究发现，脱脂豆粕^{[7, 8]}、啤酒酵母粉^{[9, 10]}和玉米蛋白粉^[3]都可以部分替代军曹鱼配合饲料中的鱼粉。玉米蛋白粉是玉米除去淀粉、胚芽和外皮后剩下的副产品，蛋白质含量通常在55%~65%，可以直接用作畜禽饲料的蛋白质原料；然而，由于玉米蛋白粉存在口感粗糙、水溶性差等缺点，在国内饲料行业中并未得到充分的利用，甚至被当作废物处理；实际上，玉米蛋白粉的氨基酸总和高于豆粕和鱼粉，其中含硫氨基酸和亮氨酸含量也比豆粕和鱼粉要高，因此玉米蛋白粉可以作为替代蛋白质源与豆粕和鱼粉蛋白质源相互补充^[11]。国内外众多研究结果也表明，军曹鱼^[12]、大西洋鳕鱼(Gadus morhua)^[13]、金头鲷(Sparus aurata) ^[14]、暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)^[15]、青鱼(Mylopharyngodon piceus)^[16]、建鲤(Cyprinus carpiovar)^[17]和团头鲂(Megalobrama amblycephala)^[18]等鱼类都对玉米蛋白质具有良好的表观利用率。因此，本研究选取玉米蛋白粉作为军曹鱼饲料中鱼粉的替代品，研究玉米蛋白质对幼鱼蛋白质生长的实际贡献率。

Pereira等^[19]发现，玉米蛋白粉最多可以替代杂食偏肉食性的金头鲷幼鱼饲料中60%的鱼粉而不影响幼鱼生长；Heidi等^[20]的研究结果表明，玉米蛋白粉可以替代饲料中50%的鱼粉而不会影响杂交条纹鲈(Morone chrysops♀×Morone saxatilis♂)的特定生长率和饲料转化率；Kotaro^[21]的研究结果表明，玉米蛋白粉能够替代日本比目鱼(Paralichthys olivaceus)饲料中40%的鱼粉；Regost等^[22]的研究结果表明，玉米蛋白粉能够替代大比目鱼(Psetta maxima)饲料中1/3的鱼粉。但也有研究者发现玉米蛋白粉在水产饲料中的用量不宜过高，比如刘兴旺等^[23]研究发现，当饲料中玉米蛋白粉含量超过25%时，大菱鲆(Scophthalmus maximus)的特定生长率显著低于对照组；陈然等^[24]也发现，玉米蛋白粉在异育银鲫(Carassais auratus gibebio)饲料中的适宜用量仅为4%～8%。

本实验室前期的研究结果表明，豆粕粉、啤酒酵母、玉米蛋白粉3种蛋白质源均可替代军曹鱼幼鱼[(33.85±2.89) g]饲料中10%的鱼粉而不会对其生长、饲料利用、体成分和体指标产生显著影响^[3]。但在本研究中，玉米蛋白质替代10%的鱼粉蛋白质就已对(21.34±1.54) g的军曹鱼幼鱼的生长和饲料利用产生了显著的不良影响。2次养殖试验是在相似的养殖条件下进行，所用饲料组成基本相同，所用幼鱼也是同一批培育的种苗，2次试验得到不同结果的主要原因可能是采用的军曹鱼种苗规格不同，这可以通过比较其他研究者对不同规格军曹鱼幼鱼鱼粉替代蛋白的研究结果得到佐证^{[7, 8, 9, 10]}。军曹鱼在幼鱼阶段的生长发育非常迅速，对于饲料营养的需求可能会随其生长而产生显著的差异；在育苗生产中，饲料的实际应用效果也表明，替代蛋白质含量较高的饲料可以满足较大规格幼鱼生长的需要，但却无法很好地满足较小规格幼鱼快速生长的需要。

本研究的结果表明，投喂玉米蛋白质替代10%鱼粉蛋白质饲料之后，玉米蛋白质对军曹鱼幼鱼全鱼蛋白质生长的实际贡献率只有(7.64±0.49)%，这表明有一部分玉米蛋白质未被用于蛋白质的生长，其主要原因可能是因为与鱼粉相比，玉米蛋白质的氨基酸组成不够平衡，赖氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)严重不足^[25]。Robaina等^[14]研究表明，投喂用玉米蛋白质替代不同比例鱼粉蛋白质的饲料后，金头鲷的可溶性氮排泄量随着替代量的增加而增加，当替代量为40%时，可溶性氮排泄量显著高于鱼粉组。Dias等^[26]研究发现，欧洲狼鲈(Dicentrarchus labrax)摄食全玉米蛋白质饲料时，其氮保留量显著低于摄食全鱼粉蛋白质饲料时。王军等^[27]研究也发现，用8%玉米蛋白粉替代饲料中等量鱼粉后，异育银鲫的氮保留率显著降低。根据本试验的结果，试验组和对照组军曹鱼幼鱼的摄食量差异不显著，推断试验组军曹鱼幼鱼生长指标下降是由于玉米蛋白质的利用效率较低；如果这些未利用的玉米蛋白质被幼鱼排出体外，就会导致其可溶性氮排泄量的增加和氮保留率的降低，为上述研究的结果提供了理论佐证。此外，需要特别注意的一点是，在本试验中玉米蛋白质对军曹鱼幼鱼全鱼和肌肉蛋白质生长的贡献率差异显著，对全鱼蛋白质生长的贡献率小于其在饲料蛋白质中的含量，而对肌肉蛋白质生长的贡献率与其在饲料蛋白质中的含量相近，体现了食物中的营养元素在生物体内的差异分配^[5]，这在应用稳定同位素技术开展生物生理生态学研究时是必须要考虑的。

采用稳定同位素技术研究不同饲料(或饲料蛋白质源)对生物生长的贡献率或者饲料蛋白质利用情况是目前国外饲料营养学研究的一个新方向，Gamboa-Delgado等^[28]采用稳定同位素技术研究了活饵和人工饲料对塞内加尔鳎(Solea senegalensis)生长的贡献率，以及饲料中的大豆蛋白质和鱼粉蛋白质对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长的贡献率^[29]。Beltrán等^[30]也采用碳、氮稳定同位素作为示踪物质研究了虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和乌颊鱼(Sparus aurata)的饲料蛋白质利用情况。上述研究证明了稳定同位素技术是动物饲料营养学研究中一项应用前景广阔的新技术。

从表5和表6可以看出，玉米蛋白质替代饲料中10%鱼粉蛋白质之后，对全鱼碳、氮元素的T₅₀无显著影响，但导致军曹鱼幼鱼肌肉碳、氮元素的T₅₀延长。因此，虽然饲料中的玉米蛋白质对军曹鱼幼鱼肌肉蛋白质生长的贡献率与其在饲料蛋白质中的含量相近，但生长时间却延长了。

在试验期间，军曹鱼幼鱼全鱼和肌肉中碳元素的周转速度明显要比氮元素的周转速度快，而且在碳同位素变化的贡献中，代谢所占的比例也比较高(m较大，相当于k的1/2)，这可能是因为军曹鱼是一种活跃的游泳鱼类，频繁而快速的游动需要旺盛的碳水化合物代谢，导致碳元素周转速度的加快。2组军曹鱼幼鱼氮元素周转的m均不到k的10%，说明军曹鱼的代谢对其δ¹⁵N变化的贡献非常小，δ¹⁵N变化主要是由体组织的生长造成的。