2. 吉林省农业科学院, 长春 130033
2. Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130033, China
甲烷是位于二氧化碳之后的第二大温室气体，化学性质稳定，难于降解代谢，并且还是反刍动物饲料能量损失的重要途径之一。反刍动物产生的甲烷大部分来源于瘤胃发酵，由于不可能绝对消除瘤胃发酵产生的甲烷，因此，利用营养调控技术合理有效地控制和减少瘤胃甲烷的生成，不仅能提高饲料利用率，节约生产成本，还能减轻甲烷对大气层的破坏，获得环境和经济的双重收益。
草原红牛是以英国短角牛为父本，蒙古牛为母本经过级进杂交和横交固定培育而成的我国第1个肉乳兼用型的优良品种，1985年通过国家验收，正式定名为中国草原红牛，后期通过导入利木赞血液，形成了肉用群体。莫能菌素是一类畜禽专用聚醚类离子载体抗生素类药物，研究表明，莫能菌素影响反刍动物瘤胃内能量代谢，改善瘤胃发酵[1]，降低乙酸/丙酸，减少甲烷生成[2]，提高蛋白质消化率[3]，提高犊牛日增重[4]，因此具有提高反刍动物饲料利用率和促进生长的作用。吐温80是一种非离子型表面活性剂，其作用为降低溶剂表面张力，改变体系界面状态，产生润湿或反润湿、乳化或破乳、分散或凝集、起泡或消泡以及增溶等，在食品加工中被广泛作为添加剂使用，添加在动物饲料中通常被认为是安全的。根据以往的报道，吐温80对反刍动物的影响多集中在其对瘤胃功能的影响上，主要有增加瘤胃纤维素酶、木聚糖酶和淀粉酶的活力[5]，促进牛链球菌、反刍月形单胞菌、溶纤维丁酸孤菌、黏液真杆菌、埃氏巨球形菌和产琥珀酸丝状杆菌的生长[6]，低浓度吐温80对真菌有营养作用[7]，提高瘤胃内总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度和反刍动物饲粮干物质降解率[8]。因此，吐温80有可能作为一种非离子型表面活性剂应用于反刍动物生产，其作用需要进一步探究。本试验在精料中分别添加莫能菌素、吐温80以及联合添加二者，研究其对草原红牛瘤胃发酵特性及甲烷排放的影响，为莫能菌素和吐温80在草原红牛生产中的有效利用及提高反刍动物饲料利用效率提供理论依据。
本试验选用吉林省农业科学院畜牧分院试验牛场选择17月龄、体重相近[(276±18) kg]的生长期草原红牛公牛8头。基础饲粮参照我国《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)配制，由精料和羊草组成，精粗比40∶ 60，精料组成及营养水平见表1。
 | 表1 精料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the concentrate (air-dry basis) % |
采用4×4拉丁方试验设计，试验牛随机分为4组，每组2头。分别饲喂基础饲粮(对照组)以及在基础饲粮中分别添加0.36 g/d莫能菌素(莫能菌素组)、1.75 g/d吐温80(吐温80组)、0.36 g/d莫能菌素+1.75 g/d吐温80(联合组)的试验饲粮。试验在吉林省农业科学院畜牧分院试验牛场进行。每期试验每头牛预试期7 d，正试期15 d。共进行4期试验。
试验牛单槽栓系饲养，每日分别于05:00、16:00准时定量(4 kg)饲喂精料，自由采食羊草，自由饮水，记录正试期内每头牛的日采食量、日排粪量和日排尿量。利用吉林省农业科学院自主研制的大型开放回流式呼吸测热装置进行呼吸代谢试验。正试期内第1天与第14天下午13:00将试验牛称重后牵入呼吸测热室进行24 h呼吸代谢试验，计算试验牛平均日增重，电脑自动记录每头牛的呼吸代谢耗氧气量、二氧化碳排放量、甲烷排放量、呼吸熵等的变化。正试期内的第10天与第11天，进行消化代谢试验,分2批次于每天08:00抽取试验牛的瘤胃液。
利用气筒式抽瘤胃液器经口腔直接抽取瘤胃液后，立即用4层纱布过滤，测定瘤胃液pH，按照4∶ 1的比例取4 mL过滤后的瘤胃液加入1 mL 10%偏磷酸混合均匀，4 000 r/min离心15 min，取上清液再以12 000 r/min离心15 min后，再取上清液测定挥发性脂肪酸(VFA)浓度。
该装置由吉林省农业科学院畜牧分院自主研制，可以人工控制模拟各种气候环境，进行长时间连续不间断对大、中、小型动物(5~1 000 kg)呼吸代谢的实时监测，主要由下列装置构成：进气、排气装置，高精度气体在线分析仪，数据采集控制仪，呼吸代谢室，控温、控湿装置，收粪、尿装置等。该装置每5 min采集并分析1次呼吸代谢室内氧气、二氧化碳和甲烷气体的浓度，计算机自动运算记录，并保存数据。
气筒式抽瘤胃液器由吉林省农科院畜牧分院改装。
色谱条件，汽化室参数：载气为N2，分流比40∶ 1，进样量1 μL，温度220 ℃；色谱柱参数：DB-FFAP色谱柱恒流模式，流量3.0 mL/min，平均线速度38 cm/s；柱温箱参数：程序升温65~190 ℃；检测器参数：氢气流量40 mL/min，空气流量400 mL/min，柱流量+尾吹气流量45 mL/min，氢火焰离子化检测器(FID)温度250 ℃。
试验数据采用Excel 2003软件进行整理后，采用SPSS 17.0软件进行统计分析，采用GLM模块进行方差分析，采用Tukey法进行多重比较，以P<0.05为差异显著性判断标准。
由表2可知，与对照组相比，采食2 h后，3个试验组的瘤胃液pH均略低，但差异均未达到显著水平(P>0.05)；莫能菌素组极显著增加了乙酸、丙酸、丁酸和TVFA的浓度(P<0.01)，吐温80组和联合组无显著变化(P>0.05)。莫能菌素组与联合组相对于吐温80组和对照组，均能极显著降低了乙酸/丙酸(P<0.01)，极显著提高了丙酸比例(P<0.01)。吐温80组相较莫能菌素组极显著增加丁酸比例(P<0.01)，但二者与对照组相比，以及联合组与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。
| 表2 莫能菌素和吐温80对草原红牛瘤胃发酵特性的影响 Table 2 Effects of monensin and tween-80 on ruminal fermentation characteristics of Grassland Red bulls |
由表3可知，3个试验组的平均日增重都大于对照组，但差异均未达到显著水平(P>0.05)。在精料采食量相同的情况下，与对照组相比，莫能菌素组、吐温80组和联合组羊草采食量分别提高了25.8%、6.9%和15.4%，但只有莫能菌素组与对照组差异达到显著水平(P<0.05)。与对照组相比，莫能菌素组极显著降低了每天的甲烷排放量(10.51%)(P<0.01)，吐温80组则极显著增加了每天的甲烷排放量(5.48%)(P<0.01)，联合组每天的甲烷排放量有所降低，但差异未达到显著水平(P>0.05)。吐温80组相较对照组能显著降低增重1 kg的羊草采食量(P<0.05)，莫能菌素组则相反，但未达到差异显著水平(P>0.05)。3个试验组相较对照组均能显著降低增重1 kg的甲烷排放量(P<0.05)，莫能菌素组、吐温80组和联合组分别降低了31.89%、22.59%和25.26%。
| 表3 莫能菌素和吐温80对草原红牛甲烷排放的影响
Table 3 Effects of monensin and tween-80 on CH4 emission of Grassland Red bulls
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瘤胃液pH是评定瘤胃发酵状况的重要参数，其主要来源是纤维素降解为丙酮酸，丙酮酸再转变成乙酸和氢气，其次还有少量是由甲酸产生的。Murphy等[9]报道的瘤胃液pH正常范围为5.5~7.5，本研究中所测得的瘤胃液pH在7.0左右，属于正常范围内，但相较于王志博等[10]研究发现的6.5左右偏高，可能是由于本试验中粗料采食只有羊草，而后者的粗料包括羊草和青贮玉米，羊草中中性洗涤纤维的含量较高，非纤维性碳水化合物的含量低，而中性洗涤纤维发酵产生VFA的速度低于非纤维性碳水化合物发酵产生VFA的速度。与薛秀梅[11]研究发现的瘤胃液pH 6.09~6.64相比，本研究结果也较高，可能是由于本试验利用气筒式抽瘤胃液器经口腔直接抽取瘤胃液，后者采用体外批次培养法，如此则没有底物的外流和VFA的吸收以及唾液的缓冲作用，以至于发酵产物大量积累而导致培养液pH下降幅度较大。本试验中，在试验牛采食2 h后，3个试验组的瘤胃液pH与对照组相比差异不显著，与王志博等[10]与Hristov等[12]报道的结果一致。
VFA主要是饲粮中碳水化合物的发酵产物，是维持反刍动物生命和生产的主要能量来源，可以为反刍动物提供其总能需要量的70%~80%。VFA包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、戊酸、正丁酸等，其中乙酸、丙酸、丁酸占瘤胃发酵产生TVFA的95%左右[13]。许多研究表明，瘤胃发酵趋向于丙酸型发酵则有利于提高饲料利用率。
莫能菌素对VFA的影响在不同的试验研究中有不同的结果。Martineau等[14]研究发现，与对照组相比，莫能菌素组降低TVFA浓度，增加乙酸和丙酸浓度，降低丁酸浓度，降低乙酸/丙酸，但是都未达到显著水平。钱占宇[15]在研究离子载体对奶牛瘤胃发酵时发现，适量的莫能菌素能显著增加丙酸浓度，降低乙酸/丙酸，对TVFA浓度没有显著影响。叶均安[16]的试验表明，对瘤胃培养液添加莫能菌素培养3 h后，乙酸、丙酸、丁酸的浓度增加，培养6 h后，乙酸、丁酸浓度下降，而丙酸浓度增加。从本试验结果也可以看出，在草原红牛采食2 h后，添加莫能菌素能够极显著增加乙酸、丙酸、丁酸的浓度，与叶均安[16]的研究结果相一致，并且通过分析数据发现，莫能菌素相较对照组显著增加了TVFA浓度，显著降低了乙酸比例，显著降低了乙酸/丙酸，显著增加了丙酸比例，使瘤胃发酵趋向于丙酸型发酵。
吐温80对VFA的影响在不同的试验中也得到了不同的结果。Hristov等[8, 12]报道，与对照组相比，添加吐温80对瘤胃液VFA以及VFA不同组分的比例都没有影响。但是，Lee等[7]研究吐温80对瘤胃发酵特性的影响时发现，与对照组相比，添加吐温80使瘤胃液VFA浓度在饲喂3 h后升高20%，主要是增加了瘤胃液体乙酸和丙酸浓度。代行慧[17]的研究发现，吐温80能够显著提高绵羊瘤胃液中乙酸的浓度，显著降低丙酸和丁酸浓度。王宏勇等[18]报道，吐温80使瘤胃液乙酸、丙酸、丁酸的平均浓度分别提高12.19%、14.23%、15.59%。本试验中，添加吐温80虽然未达到差异显著水平，但同样可提高乙酸、丙酸、丁酸和总VFA的浓度，降低乙酸比例，增加丙酸和丁酸比例，降低乙酸/丙酸,这与Lee等[7]、代行慧[17]和王宏勇等[18]的结果也相一致。
精料中同时添加莫能菌素和吐温80后，相比对照组显著降低了乙酸比例和乙酸/丙酸，增加了丙酸比例，对其他指标无显著影响，此结果与Wang等[19]的研究结果一致。
反刍动物采食饲料后，首先在瘤胃内进行厌氧发酵，瘤胃内的微生物把碳水化合物和其他植物纤维发酵分解成VFA等代谢产物，同时产生甲烷。其产生途径有：1)氢气和甲酸在一系列酶和辅酶的作用下还原生成；2)甲酸、乙酸、丁酸等VFA水解产生；3)甲醇、乙醇等果胶的发酵产物分解产生。研究表明，饲粮组成、采食水平、环境温度、瘤胃内环境和食糜流动速度都是影响反刍动物甲烷排放的主要因素。准确测定反刍动物甲烷排放量，对于比较不同营养调控技术对反刍动物甲烷减排的效果，从而筛选出最佳调控方案具有重要作用。国内对于这方面的研究多采用传统的体外培养法、头套法或六氟化硫示踪法，对于采用国际上较先进水平的呼吸代谢室法还鲜有报道。本研究中所采用的呼吸代谢测热装置，是吉林省农科院在对国际通用的开放回流式呼吸测热流程的基础上进行创新改进后自主研制的专门用于研究反刍动物甲烷排放的装置。该装置最大的优点在于能将动物口腔与肠道排放的甲烷量做长时间实时监测，并且该装置把采集分析完的气体，流经分析仪后又抽回动物呼吸代谢室，使得代谢室内的气体容积不发生改变，从而使测定结果更加准确。
莫能菌素调控瘤胃甲烷的生成主要是通过对瘤胃微生物区系的调控实现的。莫能菌素能通过影响细胞膜通透性、改变微生物代谢活动而抑制产甲烷菌、产氢菌和产甲酸菌，改变瘤胃发酵过程中产生的还原电子在不同受体之间的传递方向，使革兰氏阳性菌产生的甲烷、氢气、二氧化碳显著减少，从而达到减少甲烷排放量的目的。Van Vugt[20]对放牧场采食的奶牛进行研究时发现，莫能菌素使甲烷排放量下降了9%~10%。Odongo等[21]学者研究饲喂莫能菌素对泌乳奶牛甲烷排放量的长期影响时也发现，莫能菌素可使甲烷排放量降低7%和9%，同时不影响奶牛干物质采食量和产奶量。本试验中莫能菌素显著降低甲烷排放量的结果与以上的研究结果一致。但Grainger等[22]的研究也发现，莫能菌素对放牧场和代谢室测得的奶牛的甲烷排放量没有影响，这可能是由于各个研究中莫能菌素的添加剂量不同所致。VanVugt[20]的试验中，莫能菌素的添加量为0.32 mg/d，本试验中的添加量为0.36 mg/d，而Grainger等[22]的试验中，莫能菌素的添加量仅为0.24 mg/d，可能并未达到降低甲烷生成所需莫能菌素的最低水平。将甲烷排放量换算成增重1 kg所排放的量后，本试验中莫能菌素组同样显著低于对照组。
对吐温80的报道多集中于其对瘤胃发酵特性的调控，而对其调控瘤胃甲烷的生成机制目前尚没有明确的报道。本试验中，试验牛采食添加了吐温80的饲粮后，日甲烷排放量相比对照组显著升高，原因可能是吐温80能提高瘤胃内酶活力，提高细菌生长速度，促进瘤真菌生长，促进乙酸浓度的增加而间接影响的。但是将甲烷排放量换算成试验牛增重1 kg的排放量后，则显著低于对照组，并且试验牛增重1 kg的羊草采食量也显著低于对照组、莫能菌素组以及联合组，说明吐温80降低了草原红牛增重1 kg的甲烷排放量。
本试验中，在精料中同时添加莫能菌素和吐温80后，相对于对照组甲烷排放量也显著降低，但是相对于分别添加莫能菌素和吐温80，其降低效果却并没有得到加强，原因有待进一步研究。
① 饲粮中添加莫能菌素使草原红牛的瘤胃发酵类型趋向于丙酸型发酵，同时降低了单位增重的甲烷排放量。
② 饲粮中添加吐温80能同时显著降低单位增重的相对干物质采食量和相对甲烷排放量。
③ 饲粮中同时添加莫能菌素和吐温80的效果没有比分别添加二者的效果增强。
致谢：感谢吉林省农业科学院赵玉民研究员、杨华民副研究员、张国梁研究员对本研究选题给予的指导与建议以及在试验过程中给予的技术、物资的支持，感谢魏炳栋助理研究员对文稿所提的宝贵意见。
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