2. 扬州大学动物科学与技术学院, 扬州 225009
2. College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
大豆黄酮(daidzein,DA)化学名为4,7-二羟基异黄酮,其化学结构与17-β雌二醇在空间结构上具有几乎等同的2个羟基结构,被称为“植物雌激素”[1]。研究表明大豆黄酮不仅具有弱的雌激素和抗雌激素作用,还具有延缓衰老、抗氧化、降低胆固醇、改善人体及动物骨质疏松、增强免疫等一系列重要的功能,日益受到人们的关注[2, 3, 4]。大豆黄酮主要在肠道中被吸收,经肠道内的β-葡糖苷酶水解为糖苷配基或苷元,这些水解产物一部分被直接吸收,另一部分经肠道微生物菌群的作用进一步代谢,生成去氧甲基安哥拉紫檀素和具有更高生物活性的雌马素[5]。近年来有关大豆黄酮作为动物饲料添加剂的研究也越来越多,本实验室前期研究结果表明,大豆黄酮具有改善产蛋后期蛋鸡的生产性能、内分泌激素水平,调节骨代谢,改善鸡蛋品质等作用[6, 7]。但长期高剂量添加大豆黄酮是否对动物具有毒副作用,仍是一个充满争议的问题。高剂量大豆黄酮的添加是否会造成鸡蛋中大豆黄酮大量残留,目前也尚未见报道。因此,本试验旨在研究饲粮添加高剂量大豆黄酮对产蛋后期蛋鸡鸡蛋中大豆黄酮及其代谢产物雌马酚残留状况的影响,为大豆黄酮作为蛋鸡饲料添加剂在生产中的应用及动物产品安全性问题的研究提供依据。
试验材料为大豆黄酮(四川广汉生化制品有限公司),含量大于97.5%。试验动物为56周龄海兰褐蛋鸡。
选取56周龄海兰褐蛋鸡640只,随机分成4组,即Ⅰ组(对照组)、Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组。每组8个重复,每个重复20只鸡,预试期3周,饲喂基础饲粮,根据预试期各组产蛋性能相近的原则调整分组进行正式试验。正式试验期从59周龄至70周龄,共12周。Ⅰ组饲喂基础饲粮(基础饲粮组成及营养水平见表1),Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组饲喂在基础饲粮中分别添加10(最高推荐有效量)、50(5倍最高推荐有效量)、100 mg/kg(10倍最高推荐有效量)大豆黄酮的试验饲粮。
![]() | 表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)
Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % |
每天15:00准时收蛋,以重复为单位每天记录产蛋数、蛋重,每周统计耗料量和鸡只死亡数,计算全期产蛋率、采食量、料蛋比、产蛋量(平均每只鸡每天产蛋重)。
试验第4、8、12周,每个重复随机选择1只鸡采集血液,分离血清待测。同时,每个重复捡取3枚平均蛋重左右的鸡蛋,分离蛋黄,将同一重复的蛋黄混匀合并成1个样本,-20 ℃保存待测。
饲粮和鸡蛋样品前处理:准确称取2 g试样于50 mL离心管中,加入5.0 mL乙酸铵缓冲液,加入30 μL β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase),混匀后,置于37 ℃恒温摇床中培养8 h。取出先加入10 mL乙腈,再加10 mL乙酸乙酯,涡旋混匀2 min,离心,取上清液于磨口三角瓶中,再用20 mL乙酸乙酯提取2次,合并提取液,在40 ℃条件下减压旋转蒸干,用3.0 mL 50%甲醇水溶液定容,取出,-9 ℃冷冻离心30 min后,过0.22 μm滤膜,待测。
血清样品前处理:取0.5 mL试样于15 mL离心管中,加入1.0 mL乙酸铵缓冲液,加入30 μL β-葡萄糖苷酸酶,混匀后,置于37 ℃恒温摇床中培养2 h。取出后先加入2 mL乙腈,再加2 mL乙酸乙酯,涡旋混匀2 min,离心,取上清液于10 mL离心管中,再用1 mL乙酸乙酯提取2次,合并提取液,在40 ℃条件下减压蒸干,用1.0 mL 50%甲醇水溶液定容,取出,-9 ℃冷冻离心30 min后,过0.22 μm滤膜,待测。
检测方法:高效液相色谱-串联质谱法(Agilent Technologies 6460 Triple Quad LC/MS),液相色谱柱为Agilent C18柱(规格:150 mm×4.6 mm,填料粒径:5 μm);流动相A为水,B为乙腈+甲醇=1+1;柱温35 ℃;进样量5 μL。质谱采用电喷雾离子源、负离子模式(ESI-)、多反应监测(MRM)模式。由图1可知,图谱A中保留时间为6.347 min的峰质谱检测为大豆黄酮,图谱B中保留时间为6.591 min的峰质谱检测为雌马酚。
![]() | 图1 大豆黄酮及代谢产物雌马酚液质联用检测图谱
Fig.1 The HPLC-MS chart of daidzein and equol |
标准曲线制作:将大豆黄酮和雌马酚的标准样品配成0、2、4、6、8和10 μg/mL的标准溶液,按上述色谱条件分析,测峰面积。以标准品浓度为横坐标x,标准品峰面积为y,作回归方程。饲粮中大豆黄酮及雌马酚的含量(测定值)见表2。
![]() | 表2 饲粮中大豆黄酮及雌马酚的含量
Table 2 The contents of daidzein and equol in diets mg/kg |
数据经Excel 2003整理后,用SPSS 16.0统计软件进行分析,单因子方差分析(one-way ANOVA,LSD)检验组间差异显著性,并在对比中选择多项式进行一次线性和二次曲线分析。P<0.05表示差异显著。
大豆黄酮对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响见表3。大豆黄酮显著影响了蛋鸡产蛋率、产蛋量和料蛋比(P<0.05,二次曲线P值分别为0.029、0.003、0.019),表明蛋鸡产蛋率、产蛋量和料蛋比与大豆黄酮添加量呈二次曲线关系;但大豆黄酮对蛋鸡采食量没有显著影响(P>0.05)。
![]() | 表3 大豆黄酮对产蛋后期蛋鸡生产性能的影响
Table 3 Effects of daidzein on performance of laying hens during the late laying period[8]
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产蛋率、产蛋量和料蛋比与大豆黄酮添加量的二次曲线关系分别为:y=83.994+0.145x-0.001x2、y=54.282+0.093x-0.001x2、y=2.181-0.004x+0.000 033 6x2,依此模型推算,达到最佳产蛋率、产蛋量和料蛋比的大豆黄酮添加量分别为72.50、46.50和59.52 mg/kg。
由表4可知,第4、8和12周各组之间蛋鸡血清中大豆黄酮及雌马酚的含量均无显著差异(P>0.05)。
![]() | 表4 蛋鸡血清中大豆黄酮及雌马酚的含量
Table 4 The contents of daidzein and equol in serum of laying hens mg/L
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由表5可知,饲粮中添加大豆黄酮可显著影响第4周蛋黄中大豆黄酮及雌马酚的含量(P<0.05),且均呈一次线性关系(P<0.05),即蛋黄中大豆黄酮及雌马酚的含量随着饲粮中大豆黄酮添加量的升高而升高;但饲粮中添加大豆黄酮对第8周和第12周蛋黄中大豆黄酮及雌马酚的含量没有显著影响(P>0.05)。
![]() | 表5 蛋鸡蛋黄中大豆黄酮及雌马酚的含量
Table 5 The contents of daidzein and equol in yolk of laying hens mg/kg
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大豆黄酮具有促进生长、提高机体免疫力、抗氧化、提高动物繁殖力和产蛋性能等多种生理功能。本研究结果显示全期产蛋率与大豆黄酮呈现显著的二次曲线关系,这表明产蛋率随着大豆黄酮含量升高呈现先提高后降低的趋势。本试验低剂量部分研究结果与Zhao等[9, 10]在蛋鸭(5 mg/kg),Ni等[4]、Liu等[11]在蛋鸡(10 mg/kg)上面得出的大豆黄酮可显著提高产蛋率的结论一致。这可能由于适宜剂量的大豆黄酮具有雌激素受体激动剂的作用,可增强雌激素作用,上调促性腺激素受体mRNA的表达量,从而促进产蛋后期蛋鸡卵泡的发育[11, 12];而过高剂量的大豆黄酮起抗雌激素的作用,这可能是因为抗雌激素的作用干扰下丘脑-垂体-性腺轴的神经内分泌机能,抑制下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)的合成和释放,抑制垂体促黄体生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)的释放,抑制性激素分泌及性激素蛋白的合成,抑制蛋鸡卵泡发育,降低蛋鸡产蛋性能[13],这点由本试验中100 mg/kg大豆黄酮组蛋鸡产蛋率、产蛋量和料蛋比低于50 mg/kg大豆黄酮组得到进一步证实,同时此部分与前人研究结果存在差异可能主要由于前人未开展高剂量(>50 mg/kg)研究。
大豆黄酮主要在肠道中被吸收,吸收率在10%~40%,在肠腔内微生物作用下降解和代谢后进入血液,最后随尿、粪或蛋、奶排除体外。大豆黄酮在体内代谢迅速,最终代谢产物为雌马素和去氧甲基安哥拉紫檀素。对猪的研究表明,口服大豆黄酮8 h后,约有55%直接从尿中排除,另外约22%的大豆黄酮转化成雌马酚由尿或粪排出[1]。本研究发现,饲粮添加不同剂量的大豆黄酮并未造成蛋鸡血清中大豆黄酮及其代谢产物雌马酚含量的差异,表明饲粮中大豆黄酮含量不会引起机体大豆黄酮消化吸收率的变化。
卵母细胞卵黄沉积作用是蛋黄中大豆黄酮及代谢产物雌马酚的主要来源[14]。血浆中的大豆黄酮及其代谢产物雌马酚会转移并积聚在卵母细胞中。本研究表明,试验第4周时,各组血清中大豆黄酮及其代谢产物雌马酚含量未出现显著差异,但蛋黄中的含量随饲粮大豆黄酮添加量的增加呈一次线性上升。由此推断,血浆可能不是蛋黄大豆黄酮,尤其是雌马酚的唯一来源。有专家推测,一部分大豆黄酮及糖苷配基转移到了肝脏,代谢成雌马酚,再与一些物质结合,直接转运到卵母细胞[14],但这一假说还有待进一步验证。但随着时间的推移,各组间蛋黄中大豆黄酮及雌马酚的含量差异不显著。这可能与大豆黄酮的抗雌激素作用有关,当机体中大豆黄酮含量升高到一定程度时,会表现出抗雌激素活性,抑制大豆黄酮与雌激素受体(ER)结合,从而起到反向调节的作用。
目前已有的大部分研究表明大豆黄酮是安全的。Setchell等[15]研究表明,成人日均采食豆类食物超过50 mg(大豆黄酮的含量约为0.001 mg),其血液中大豆异黄酮的含量在50~800 ng/mL,这一摄入量对人类健康有积极作用。但也有少数学者担心其存在潜在的毒性作用,例如Makela等[16]研究表明,大豆异黄酮与雌激素受体结合能够加强乳腺癌细胞的增殖分化。目前大豆黄酮在人上使用的安全问题主要集中在长期高剂量的服用是否会增加乳腺癌的风险[17, 18, 19]。本研究检出蛋黄中大豆黄酮和雌马酚的总量最大约为0.15 mg/kg,即在成人日均采食1~2枚此种鸡蛋时,相当于采食了50 mg豆类食物,对人类健康不会造成负面影响。
① 饲粮添加大豆黄酮对蛋鸡产蛋率、产蛋量和料蛋比呈现先促进后抑制的作用。
② 饲粮添加大豆黄酮对蛋鸡血清中大豆黄酮及其代谢产物雌马酚含量没有显著影响。
③ 饲粮中添加高剂量大豆黄酮短时间内会引起在鸡蛋中大豆黄酮及其代谢产物雌马酚的沉积,但随着时间该沉积效应逐渐降低。
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