动物营养学报  2013, Vol. 25 Issue (12): 2920-2927   PDF (1026 KB)    
引用本文
白萨茹拉, 杨红建, 李胜利. 不同粗饲料组合全混合日粮对泌乳奶牛体外瘤胃挥发性脂肪酸生成动力学特性的影响[J]. 动物营养学报, 2013, 25(12): 2920-2927.  
BAI Saruul, YANG Hongjian, LI Shengli. Different Roughage Combinations in Total Mixed Rations： Effects on Kinetic Characteristics of in Vitro Ruminal Volatile Fatty Acid Production of Lactating Dairy Cows[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2013, 25(12): 2920-2927.  
不同粗饲料组合全混合日粮对泌乳奶牛体外瘤胃挥发性脂肪酸生成动力学特性的影响
白萨茹拉, 杨红建 , 李胜利    
中国农业大学动物科学技术学院, 动物营养学国家重点实验室, 北京 100193
收稿日期：2013-7-22
基金项目：国家重点基础科学研究计划(2011CB100801);国家科技支撑计划项目(2012BAD12B02)
作者简介：白萨茹拉(1985- ),女,内蒙古通辽人,硕士研究生,反刍动物营养研究方向。E-mail: bsrl.cau.edu.cn@163.com
通讯作者：杨红建,副教授,博士生导师,E-mail: yang_hongjian@sina.com
摘要：本试验旨在研究不同粗饲料组合全混合日粮(TMR)对泌乳奶牛体外瘤胃挥发性脂肪酸生成动力学特性的影响。选用4头体重、年龄、泌乳期和日均产奶量相近、安装有永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为试验动物,分别饲喂4种TMR。TMR精饲料组成相同,精粗比为61: 39,粗饲料组合分别为100%玉米秸(TMR1)、50%玉米秸+50%玉米秸黄贮(TMR2)、50%玉米秸黄贮+50%羊草(TMR3)、50%羊草+50%全株玉米青贮(TMR4)。在预试期15 d后,晨饲前采集各头奶牛瘤胃液,分别以各头奶牛所饲喂的TMR为底物,进行体外批次培养试验,采样时间点分别为发酵后2、5、10、14、20、27、36、48和72 h。结果表明:TMR4乙酸产量潜在增幅(46.8 mmol/L)最低,极显著低于其他TMR(P<0.01);TMR2乙酸产量增速常数(0.14%/h)和日产量(29.01 mol/d)最高,分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)高于其他3种TMR。TMR2丙酸产量潜在增幅(8.0 mmol/L)最低,极显著低于其他TMR(P<0.01),TMR1(13.5 mmol/L)最高,但与TMR3和TMR4之间差异不显著(P>0.05);不同TMR丙酸产量增速常数差异不显著(P>0.05);TMR2丙酸日产量最低(1.35 mol/d),显著低于TMR3和TMR4(P<0.05)。不同TMR丁酸产量潜在增幅差异不显著(P>0.05);TMR3丁酸产量增速常数(0.091%/h)和日产量最高(2.82 mol/d),分别极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)高于其他TMR。综上所述,不同粗饲料组合TMR瘤胃微生物发酵乙酸、丙酸和丁酸生成动力学参数存在显著差异,但采用体外批次培养法测算的奶牛瘤胃乙酸、丙酸、丁酸日产量较同位素示踪体内法偏低,故不适于测算奶牛体内挥发性脂肪酸日产量。
关键词： 粗饲料组合     泌乳奶牛     挥发性脂肪酸     体外批次培养法    
Different Roughage Combinations in Total Mixed Rations： Effects on Kinetic Characteristics of in Vitro Ruminal Volatile Fatty Acid Production of Lactating Dairy Cows
BAI Saruul, YANG Hongjian , LI Shengli    
State Key Laboratory of Animal Nutrition, College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Abstract: This experiment was conducted to study the effects of different roughage combinations in total mixed rations (TMRs) on kinetic characteristics of in vitro ruminal volatile fatty acid (VFA) production of lactating dairy cows. Four Holstein cows with similar body weight, age, lactation period and average daily milk yield, and fitted with permanent ruminal fistulas, were used as experimental animals and fed four TMRs. Four TMRs had the same concentrate composition, and the ratio of concentrate to roughage was 61: 39. Roughage combinations were designed as follows: 100% corn stover (TMR1), 50% corn stover+50% ensiled corn stover (TMR2), 50% ensiled corn stover+50% Chinese wildrye hay (TMR3) and 50% Chinese wildrye hay+50% whole corn silage (TMR4). After 15-day pre-experimental period, an in vitro batch culture was performed for 2, 5, 10, 14, 20, 27, 36, 48 and 72 h, in which TMRs fed to each corresponding cows were chosen as substrates. The results showed as follows: the lowest potential amplification of acetate production occurred in TMR4 (46.8 mmol/L), and was significantly lower than that in other TMRs (P<0.01); TMR2 had the greatest accelerate constant of acetate production (0.14%/h) and daily acetate production (29.01 mol/d), which were significantly higher than those in other TMRs (P<0.05 or P<0.05). TMR2 had the lowest potential amplification of propionate production (8.0 mmol/d), and was significantly lower than that in other TMRs (P<0.01), while that in TMR1 (13.5 mmol/L) was the highest, but was not significantly different from that in TMR3 and TMR4 (P<0.05); there was no significant difference in the accelerate constant of propionate production among different TMRs (P>0.05); TMR2 had the lowest daily propionate production (1.35 mol/d), which was significantly lower than that in TMR3 and TMR4 (P<0.05). No significant difference in the potential amplification of butyrate production was observed among different TMRs (P>0.05); TMR3 had the greatest accelerate constant of butyrate production (0.091%/h, P<0.01) and daily butyrate production (2.82 mol/d, P<0.05), which were significantly higher than those in other TMRs. In conclusion, TMRs with different roughage combinations exhibit remarkable difference in the kinetic parameters of acetate, propionate and butyrate production. The values of daily acetate, propionate and butyrate production estimated by in vitro batch culture method are lower than those estimated by in vivo isotopic tracing method, which suggests that the in vitro batch culture method can not be used to estimate dairy VFA production in the rumen for dairy cows.
Key words: roughage combination     dairy cow     volatile fatty acid     in vitro batch culture    

近十年来，我国奶牛养殖业发展迅速，但与发达国家相比，苜蓿等优质牧草供给不足成为制约提高产奶量及奶品质的重要影响因素。为了提高奶品质及养殖效益，缓解草、畜供给矛盾，如何进一步提高我国农作物秸秆等粗饲料资源饲用效率备受关注。瘤胃是反刍家畜进行微生物消化主要场所，饲粮养分结构和组成可以改变瘤胃微生物区系和数量，进而影响养分消化分解及挥发性脂肪酸(VFA)产量[1, 2, 3]。早在20世纪60和70年代，就有研究得出奶牛和绵羊瘤胃微生物消化代谢主要VFA产物乙酸、丙酸和丁酸产量约占总挥发性脂肪酸(TVFA)的95%[4, 5, 6, 7]，不仅可为宿主机体提供能量，而且是乳脂和体脂合成的重要前体物[8]。有研究报道，瘤胃中产生的76% VFA可被瘤胃上皮吸收[9]，有一些研究采用同位素示踪法测定了绵羊瘤胃中VFA日产量[6, 7, 10]，发现因部分VFA以不同速率被瘤胃壁吸收进入血液[11, 12, 13, 14]，很难通过体内法准确地测定各VFA产量。由于同位素示踪法本身费时费力，且对试验动物和操作者具有一定侵害性，近半个世纪以来并未被广泛采用。Corley等[15]首次尝试利用体外批次培养法，发现这一方法得到的VFA日产量与饲喂相同饲粮的绵羊的体内法测定结果十分相近。本试验基于体外批次培养法，测定不同粗饲料组合全混合日粮(TMR)饲喂条件下，泌乳奶牛体外瘤胃微生物发酵产物乙酸、丙酸和丁酸日产量。

1 材料与方法
1.1 试验动物和饲粮设计

选用4头体况良好，年龄为4岁，体重[(543±45) kg]、泌乳期[(60±13)d]和日均产奶量[(18.47±0.77) kg]相近，安装有大口径永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为试验动物，每天07:00和19:00分2次饲喂。

试验全混合日粮组成及营养水平见表1，全天自由饮水。试验期为18 d，前15天为预试期，后3天为瘤胃液采样期。

表1 试验全混合日粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental TMRs (DM basis) %


1.2 体外批次培养

在65 ℃分别烘干各试验TMR样品，粉碎过2 mm分级筛后作为发酵底物。称取每种TMR 500 mg置于总容积为140 mL具有气、液取样口的厌氧发酵瓶中。参考Corley等[15]的体外批次培养法，向每个发酵瓶中加入50 mL配制好的pH 6.85缓冲液[17]，通入CO2 5 s后，加上几丁质胶塞，拧紧瓶盖，在恒温生化培养箱中预热至39 ℃。在试验奶牛食糜采样期内，晨饲前分别自饲喂TMR1、TMR2、TMR3、TMR4奶牛瘤胃不同部位采集瘤胃液，4层纱布过滤后，分别置于39 ℃预热保温瓶中带回实验室。用50 mL注射器向上述发酵瓶中加入饲喂相应TMR奶牛的瘤胃液25 mL，加上胶塞和拧紧瓶盖后，置于39 ℃恒温生化培养箱中进行培养。每种TMR设5个重复，分别于发酵后0、2、5、10、14、20、27、36、48和72 h时，用1 mL医用注射器自发酵瓶液体取样口采集1 mL发酵液，立即加入300 μL的25%偏磷酸溶液，4 ℃静放30 min后，10 000×g离心，取上清样于-20 ℃冻存，待测VFA产量。

1.3 分析测定与计算

发酵液上清液样品解冻后，用微量进样器吸取0.5 μL待测样，通过安装有15 m×0.53 mm毛细管柱和氢火焰离子化检测器的GC522型气相色谱仪(上海伍丰科学仪器有限公司)以高纯氮气为载气分析测定VFA产量。色谱条件：气化室温度250 ℃、柱箱温度120 ℃。

利用SAS 9.1.3统计软件NLIN过程按照以下函数模型[15]进行非线性拟合计算：

Y=a-b×e-c×t (1)

式中：Y为VFA产量(mmol/L)，a为发酵液中VFA理论最大产量(mmol/L)，b为随发酵时间延长VFA产量潜在增幅(mmol/L)，c为VFA产量增速常数(%/h)；t为发酶时间(h)。

根据式(1)，随发酵时间延长，发酵瓶中底物不断减少，VFA产量不断增加达到最大值时，对上面的指数函数进行一阶导数转换后，VFA生成速率可以表述为以下函数模型：

dy/dt=b×c×e-c×t (2)

式中：dy/dt为VFA生成速率(mmol/h)。

根据式(2)，当发酵时间t=0时，可以回推得到晨饲前泌乳奶牛瘤胃液采样时的VFA生成速率为b×c。假定4头体重为(543±45) kg奶牛瘤胃平均容量54 L[18]，则可根据式(3)分别计算出饲喂TMR对应的奶牛乙酸(Yace)、丙酸(Ypro)和丁酸日产量(Ybut)。以乙酸日产量为例，计算公式为：

Yace=bace×cace×T×D×54/1 000 (3)

式中：Yace为乙酸日产量(mol/d)，bace为随发酵时间延长乙酸产量潜在增幅(mmol/L)，cace为TMR发酵乙酸产量增速常数(%/h)，T昼夜总时长24 h，D为瘤胃液的稀释系数(本试验中D=3)。

1.4 数据处理及统计分析

数据经Excel整理后，采用SAS 9.1.3统计软件直接读取Excel数据，并用GLM过程进行单因素方差分析，采用Duncan氏法和Means语句过程统计不同TMR间差异。

2 结 果
2.1 体外瘤胃发酵乙酸生成动力学参数

由表2可知，不同TMR乙酸72 h产量差异不显著(P>0.05)。TMR2乙酸理论最大产量显著高于TMR3和TMR4(P<0.05)，TMR1、TMR3和TMR4之间差异不显著(P>0.05)。TMR4乙酸产量潜在增幅最低，极显著低于其他3种TMR(P<0.01)，TMR1、TMR2和TMR3之间差异不显著(P>0.05)。TMR2乙酸产量增速常数及日产量最高，分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)高于其他3种TMR，其他3种TMR间差异不显著(P>0.05)。

2.2 体外瘤胃发酵丙酸生成动力学参数

由表3可知，各TMR丙酸72 h产量、理论最大产量差异不显著(P>0.05)。丙酸产量潜在增幅存在极显著差异(P<0.01)，其中TMR2丙酸产量潜在增幅最低，极显著低于其他TMR(P<0.01),TMR1最高，但与TMR3和TMR4之间差异不显著(P>0.05)。不同TMR间丙酸产量增速常数差异不显著(P>0.05)。丙酸日产量TMR3>TMR4>TMR1>TMR2，TMR3、TMR4与TMR2之间差异显著(P<0.05)。

2.3 体外瘤胃发酵丁酸生成动力学参数

由表3可知，不同TMR丁酸72 h产量及理论最大产量存在极显著差异(P<0.01)，其中TMR2丁酸72 h产量及丁酸理论最大产量最高，极显著高于其他TMR(P<0.01)。丁酸产量潜在增幅在不同TMR间差异不显著(P>0.05)。TMR3丁酸产量增速常数及日产量最高，分别极显著(P<0.01)和显著高于其他3种TMR(P<0.05)，其他TMR间差异不显著(P>0.05)。

3 讨 论

瘤胃微生物通常可将饲粮中纤维素、淀粉和可溶性糖等碳水化合物首先转化为丙酮酸，丙酮酸进入三羧酸循环(TCA)通过不同的代谢途径分别生成乙酸、丙酸和丁酸。对泌乳奶牛来说，乙酸是乳腺合成乳脂中重要原料。乙酸在体内也可以用于合成少量的葡萄糖和酮体，但乙酸在体内主要通过乙酰辅酶A在还原性辅酶Ⅱ(NADPH)作用下合成体脂和乳脂，并以此在体内储存能量；乙酸在体内也可以进入TCA分解成CO2和H2，同时释放出ATP供能。反刍动物消化吸收碳水化合物的主要形式为VFA，而不是葡萄糖，但其血液中却维持着较高水平的血液葡萄糖浓度，其中丙酸起着非常重要作用，因此丙酸对泌乳奶牛来说是乳糖合成的重要前体物。丁酸被瘤胃壁吸收过程中先转化为β-羟基丁酸进入肝脏和乳腺组织，参与体内物质的代谢，尤其作为肌肉组织的能量来源。因此乙酸、丙酸和丁酸对泌乳奶牛是不可或缺的代谢产物。一般认为，瘤胃中TVFA产量受饲粮精粗比的影响较大[19]，而各VFA组成则主要与饲粮NFC/NDF有关。有研究报道，不同品质粗饲料饲粮可改变瘤胃发酵方式和发酵功能，在精粗比(20∶ 80)相同条件，随着分级指数(GI)的升高，瘤胃中乙酸产量具有降低的趋势，而丙酸产量有上升的趋势，但TVFA产量在不同品质粗饲料饲粮间差异不显著[20]。胡红莲[21]研究表明，随饲粮NFC/NDF的增加，瘤胃中乙酸产量呈现降低而丙酸和丁酸产量呈现增加的趋势。

表2 不同粗饲料组合TMR体外瘤胃发酵乙酸生成动力学参数 Table 2 Kinetic parameters of acetate production of TMRs with different roughage combinations after in vitro rumen fermentation

表3 不同粗饲料组合TMR体外瘤胃发酵丙酸生成动力学参数 Table 3 Kinetic parameters of propionate production of TMRs with different roughage combinations after in vitro rumen fermentation

表4 不同粗饲料组合TMR体外瘤胃发酵丁酸生成动力学参数 Table 4 Kinetic parameters of butyrate production of TMRs with different combinations of roughages after in vitro rumen fermentation

在本试验中，经体外批次培养法估测，乙酸、丙酸和丁酸产量有不同程度的变化。这可能与不同粗饲料组合饲粮影响瘤胃微生物纤维素降解酶活性有关；另一方面，不同粗饲料组合饲粮对主要瘤胃纤维素降解菌溶纤维丁酸弧菌、产琥珀酸杆菌和瘤胃白色球菌数量也有不同程度影响，从而影响饲料纤维素降解，改变乙酸、丙酸和丁酸的产生[22]。Silva等[23]认为，只饲喂秸秆类粗饲料会导致瘤胃微生物缺乏易于消化的养分底物，限制瘤胃微生物的生长与增殖；当同时饲喂秸秆和易于消化的纤维性饲料时，纤维素分解菌则会首先附着于优质粗饲料上，瘤胃微生物快速增殖，进而提高秸秆的利用率，影响乙酸、丙酸和丁酸的产生。本体外研究结果与其体内结论相似，TMR1只由单种玉米秸秆组成，而TMR2、TMR3和TMR4都由不同的2种粗饲料组成，TMR2、TMR3和TMR4乙酸日产量均高于TMR1，而未发现TMR1丙酸和丁酸日产量低于其他TMR的趋势，同时丙酸和丁酸日产量与乙酸相比极少。有些文献报道，粗饲料之间组合效应，可通过营养素间的互补有效平衡单一粗饲料碳、氮不平衡的缺陷，为瘤胃微生物创造分解纤维素的条件，进而有利于瘤胃微生物的生长繁殖，提高组合粗饲料的整体可发酵水平[24, 25, 26]。

在本研究中，奶牛瘤胃体外发酵乙酸生成动力学参数中乙酸产量潜在增幅、增速常数及日产量在不同TMR间差异显著或极显著，TMR2乙酸产量增速常数显著高于其他TMR，从而导致TMR2乙酸日产量最高。这可能是因为玉米秸黄贮易于被微生物降解，有利于微生物繁殖。本试验中NFC/NDF为TMR2[27]及张倩等[28]试验结果，体外发酵72 h全株玉米青贮和羊草丙酸产量显著高于玉米秸黄贮和玉米秸秆，这或许也可以解释TMR3和TMR4丙酸日产量高于TMR1和TMR2。不同TMR丁酸产量增速常数和日产量具有显著差异，其中TMR3丁酸产量增速常数及日产量最高，与高巍等[27]和张倩等[28]得出的全株玉米青贮和玉米秸秆丁酸产量分别高于玉米秸黄贮和羊草结果相反。这可能是单一粗饲料与组合粗饲料对丁酸产量影响不同所致，关于此问题可在今后试验中进一步求证。

在已有的大量奶牛试验研究报道中，有关瘤胃内VFA变化比较，大多以TVFA和各VFA产量进行报道，并未考虑到奶牛个体瘤胃容积和瘤胃壁VFA吸收效率差异所造成的影响。在Sutton等[18]的研究中，试图使用同位素铬标记的乙二胺四乙酸(Cr-EDTA)和聚乙二醇(PEG)标记法估测泌乳奶牛(体重650 kg，日均产奶量为17.8 kg)瘤胃容积，但因测定结果变异很大，最终不得不采用瘤胃食糜掏空法估测瘤胃容积，结果发现，精粗比为60∶ 40时，固相食糜容量平均值为77.0 kg，液相食糜容量平均值66.9 kg。Sutton等[18]的试验奶牛产奶量与本试验中泌乳牛十分相近。综合考虑到本试验中所使用奶牛体重差异，设定瘤胃容积为54 L或许比较合理。

尽管Corley等[15]利用绵羊瘤胃液通过体外批次培养发酵试验法所测得乙酸、丙酸、丁酸日产量与文献报道的绵羊体内法测定结果[15]十分相近，但与Sutton等[18]用碳同位素标记VFA所测定的奶牛每天乙酸、丙酸和丁酸日产量分别为56.5、16.8、6.5 mol/d，Davis[29]饲喂高精饲料低纤维素饲粮奶牛，用碳同位素标记乙酸，测定的乙酸日产量为28.1 mol/d，Bauman等[30]用同种方法测定的饲喂高精饲料低纤维素饲粮奶牛丙酸日产量31.0 mol/d相比，本试验中体外批次法所测算获得的这些VFA日产量偏低，说明体外批次法不能完全真实而只能相对反映活体牛瘤胃内饲料的发酵效率，与同位素示踪体内法VFA日产量测定值相比，体外批次培养法不适于测算奶牛VFA日产量。

4 结 论

不同粗饲料组合TMR瘤胃微生物发酵乙酸、丙酸和丁酸生成动力学参数存在显著差异，但采用体外批次培养法测算的奶牛瘤胃乙酸、丙酸、丁酸日产量较同位素示踪体内法偏低，故不适于测算奶牛体内VFA日产量。

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