动物营养学报  2013, Vol. 25 Issue (12): 2973-2980   PDF (1154 KB)    
葡甘露聚糖单方、复配膨润土及改性产物的霉菌毒素体外吸附效果
徐雪梅1,2, 齐德生1 , 张妮娅1, 何学军1, 王玲玲2, 尹佳佳2, 朱克华2    
1. 华中农业大学动物科技学院, 武汉 430070;
2. 青岛蔚蓝生物集团有限公司, 青岛 266061
摘要:本试验旨在研究葡甘露聚糖单方、复配膨润土及改性产物的霉菌毒素体外吸附效果。通过体外等温吸附试验和解吸试验,研究葡甘露聚糖、葡甘露聚糖与膨润土复合物 1(组合Ⅰ)、4: 1(组合Ⅱ)、2: 1(组合Ⅲ)和1: 1(组合Ⅳ)]以及乙酸酐改性葡甘露聚糖对黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的吸附和解吸作用。结果表明:1)葡甘露聚糖、葡甘露聚糖与膨润土复合物、乙酸酐改性葡甘露聚糖对AFB1、ZEN的等温吸附均符合Langmuir方程,吸附方式为单分子层吸附;所有吸附剂对DON的等温吸附均不符合Freundlich和Langmuir方程。2)pH 2.0时,以组合Ⅳ对AFB1、ZEN的最大吸附量最高,分别为250.00、1 776.00 μg/g。pH 8.0时,以组合Ⅳ和组合Ⅲ对AFB1的最大吸附量最高,均为217.39 μg/g;组合Ⅳ对ZEN的最大吸附量最高,为1 324.00 μg/g;各吸附剂对DON的吸附率均偏低。3)2种pH条件下,组合Ⅳ对AFB1、ZEN的累积解吸率较低。本试验条件下,1: 1的葡甘露聚糖与膨润土复合物对霉菌毒素的吸附效果最好,吸附稳定性最高。
关键词霉菌毒素     葡甘露聚糖     膨润土     改性葡甘露聚糖     吸附     解吸    
Glucomannan, Glucomannan Combined with Bentonite and Modified Glucomannan: Assessment of in Vitro Mycotoxins Absorption Effects
XU Xuemei1,2, QI Desheng1 , ZHANG Niya1, HE Xuejun1, WANG Lingling2, YIN Jiajia2, ZHU Kehua2    
1. College of Animal Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China;
2. Qingdao Weilan Biological Co., Ltd., Qingdao 266061, China
Abstract: This experiment was conducted to assess in vitro mycotoxins absorption effects of glucomannan (GM), GM combined with bentonite and modified GM. The adsorption and desorption effects of GM, GM combined with bentonite 1 (combination Ⅰ), 4: 1 (combination Ⅱ), 2: 1 (combination Ⅲ) and 1: 1 (combination Ⅳ), receptively] and anhydride modified GM on aflatoxin B1 (AFB1), zearalenone (ZEN) and deoxynivalenol (DON) by in vitro isothermal adsorption and desorption experiments. The results showed as follows: 1) the isothermal adsorptions of GM, GM combined with bentonite and anhydride modified GM on AFB1 and ZEN were fitted with Langmuir equation, and the adsorption style was monolayer adsorption, but that on DON was not fitted with Langmuir and Freundlich equations. 2) The maxium adsorption quality (AQmax) on AFB1 (250.00 μg/g) and ZEN (1 776.00 μg/g) presented in combination Ⅳ at pH 2.0. The AQmax on AFB1 presented in combinations Ⅳ and Ⅲ (217.39 μg/g) at pH 8.0. The AQmax on ZEN presented in combination Ⅳ (1 324.00 μg/g) at pH 8.0. The adsorption of different adsorbents on ZEN was very low. 3) The cumulate desorption quality rates of AFB1 and ZEN in combination Ⅳ were lower than those in other combinations both at pH 2.0 and 8.0. Under conditions in the present study, GM combined with bentonite at 1: 1 shows the best mycotoxins adsorption effects and adsorption stability.
Key words: mycotoxins     glucomannan     bentonite     modified glucomannan     adsorption     desorption    

饲料原料在田间、收获、储藏、加工及成品储藏等诸多环节均可受到霉菌感染。因此,霉菌毒素在饲料及饲料原料中的产生是不可避免的。目前,普遍使用各种脱毒方法以降低霉菌毒素对动物的危害,但都存在一定的缺陷,难以保证消除霉菌毒素对动物的危害。饲料中添加吸附剂是目前主要的脱毒方法,也是最有效的脱毒方法之一;但无机吸附剂对霉菌毒素吸附的同时吸附矿物元素等营养物质,且往往添加量大才会有效;同时吸附范围窄,基本上仅限于吸附黄曲霉毒素等弱极性霉菌毒素。鉴于无机吸附剂有着各种各样的局限性,近年来,有机吸附剂酵母细胞提取物葡甘露聚糖(glucomannan,GM),因其具有添加量低、吸附多种霉菌毒素、吸附营养物质少的特点广受关注。试验表明,应用葡甘露聚糖吸附剂对饲料进行脱毒不会产生其他有毒的物质,并且葡甘露聚糖也不会影响饲料的营养价值、氨基酸及微量元素的利用率以及饲料的适口性[1],葡甘露聚糖对黄曲霉毒素有较好的吸附作用[2],对玉米赤霉烯酮(ZEN)、T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)以及赭曲霉毒素A也有一定的吸附作用,但吸附率(adsorption rate,AR)较低[3],并且利用不同种属酵母制成的产品对霉菌毒素的吸附能力差别较大。因此,应对葡甘露聚糖吸附剂进行适当改性处理,以提高其对霉菌毒素的吸附脱毒能力;膨润土是一种极性吸附剂,并且表面带有电荷;本试验旨在探索适宜的葡甘露聚糖与膨润土配伍比例,并对葡甘露聚糖进行改性处理,评价它们对饲料中霉菌毒素的吸附效果,为饲料霉菌毒素脱毒剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

葡甘露聚糖:由华中农业大学食品科技学院提供。膨润土:由河南信阳上天梯丰源膨润土有限公司提供,粒度<150目。葡甘露聚糖与膨润土复合物:将葡甘露聚糖用研钵研磨,使其全部通过150目,与膨润土粒度保持一致。之后,将葡甘露聚糖与膨润土按比例混合均匀。乙酸酐改性葡甘露聚糖:结合各种霉菌毒素的结构特点,选择非极性改性剂(乙酸酐)改性处理方法对魔芋葡甘露聚糖进行改性,改性方法参照乙酸酐对魔芋葡甘露聚糖的改性[4]

1.2 试验设计

试验吸附剂分别为葡甘露聚糖、葡甘露聚糖与膨润土复合物[二者比例分别为9∶ 1(组合Ⅰ)、4∶ 1(组合Ⅱ)、2∶ 1(组合Ⅲ)和1∶ 1(组合Ⅳ)]和乙酸酐改性葡甘露聚糖。

1.3 主要仪器与试剂

霉菌毒素标准品:黄曲霉毒素B1(AFB1)、ZEN,纯度>99%,均购自美国Sigma公司;DON,纯度>99%,购自日本Wako公司。乙醇、乙酸酐均为分析纯;正己烷、三氟乙酸、乙睛、甲醇均为色谱级;水均为高纯水(电阻率≥18.0 ΜΩ)。

Agilent 1200型液相色谱系统,包括四元低压梯度泵、自动进样器、恒温柱温箱、真空脱气机、荧光检测器、二极管阵列检测器;恒温水浴振荡器;离心机;分析天平(0.000 01 g);水溶性过滤膜(0.45 μm);氮吹仪;水浴锅。

AFB1标准储备溶液的配制:准确称取适量的AFB1标准品,以苯-乙腈(98∶ 2)溶于棕色容量瓶中,配成浓度为10 μg/mL标准储备液。

ZEN标准储备溶液的配制:准确称取适量的ZEN标准品,以甲醇溶于棕色容量瓶中,用分光光度计进行校正,得到浓度为75.6 μg/mL标准储备液。

DON标准储备溶液的配制:准确称取适量的DON标准品,以乙腈溶于棕色容量瓶中,用分光光度计进行校正,得到浓度为116 μg/mL标准储备液。

1.4 试验方法
1.4.1 等温吸附试验
1.4.1.1 对AFB1的等温吸附试验

精确称取10.0 mg上述吸附剂于10 mL具塞刻度离心管,分别加不同体积的AFB1标准储备溶液,用已调节好的pH 2.0或pH 8.0的水溶液定容至10 mL,使刻度离心管中AFB1的初始浓度分别为0、10、30、50、80、100、150 ng/mL,每个浓度设3个重复,另设未添加吸附剂的对照管,3个重复,在37 ℃恒温振荡水浴锅中,以150 r/min频率振荡吸附1.5 h,其间每隔5 min振摇混匀1次。吸附反应结束后,于5 000 r/min下离心10 min,测定上清液中AFB1含量,用下列公式计算吸附剂对AFB1吸附量(adsorption quality,AQ):

Q=[V(C0-C)]/m

Y=100×(C0-C)/C0

式中:Q为霉菌毒素吸附量(ng/mL或μg/mL),V为溶液的体积(mL),m为吸附剂的用量(mg),C0C分别为吸附前、后溶液霉菌毒素的浓度(ng/mL或μg/mL),Y为霉菌毒素吸附率(%)。

以吸附反应体系中AFB1浓度为横坐标,AFB1浓度与吸附量的比值为纵坐标,绘制pH 2.0和pH 8.0下的等温吸附曲线,用Langmuir方程和Freundlich方程对曲线进行拟合。Langmuir方程的表达式为:

Cr/CaCr/K1+1/(K1K2)。

式中:Cr为溶液中霉菌毒素平衡浓度(ng/mL或μg/mL),Ca为霉菌毒素的吸附量(ng/mL或μg/mL),K1为吸附容量常数(ng/mg或μg/mg),即最大吸附量(AQmax),K2为亲和常数(mL/ng或mL/μg),表示吸附剂对霉菌毒素的吸附程度。

Freundlich方程的表达式为:

Ca=KCnr

式中:K、n为Freundlich常数,K为与吸附能力有关的常数(ng/mg或μg/mg),n为与吸附强度有关的常数(mL/ng或mL/μg)。

1.4.1.2 对ZEN的等温吸附试验

使刻度离心管中ZEN的初始浓度分别为0、0.756 0、0.907 2、1.134 0、1.360 8、1.512 0、1.663 2 μg/mL,其余操作步骤及计算公式与1.4.1.1相同。

1.4.1.3 对DON的等温吸附试验

使刻度离心管中DON的初始浓度分别为 0、1.160、1.392、1.740、2.088、2.320、2.552 μg/mL, 其余操作步骤与及计算公式与1.4.1.1相同。

1.4.2 解吸试验
1.4.2.1 对AFB1的解吸试验

分别在pH 2.0、pH 8.0水溶液和AFB1初始浓度为50 ng/mL的吸附反应结束后,倾去离心管上清液,向残余物中加入pH 8.0水溶液至10 mL,在37 ℃恒温振荡水浴锅中,以150 r/min频率振荡解吸1.5 h。其间每隔5 min振荡混匀1次。然后,于5 000 r/min下离心10 min。测定上清液中AFB1含量。经残液校正后,计算解吸量。如此连续解吸3次,计算3次累积解吸量(cumulate desorption,DQc)及累积解吸率(cumulate desorption rate,DRc)。

1.4.2.2 对ZEN的解吸试验

分别在pH 2.0、pH 8.0水溶液和ZEN初始浓度为1.134 0 μg/mL的吸附反应结束后,进行解吸试验,测定上清液中ZEN含量。经残液校正后,计算解吸量。如此连续解吸3次,计算3次累积解吸量及累积解吸率。其余步骤与1.4.2.1相同。

1.4.2.3 对DON的解吸试验

分别在pH 2.0、pH 8.0水溶液和DON初始浓度为1.74 μg/mL的吸附反应结束后,进行解吸试验,测定上清液中DON含量。经残液校正后,计算解吸量。如此连续解吸3次,计算3次累积解吸量及累积解吸率。其余步骤与1.4.2.1相同。

1.4.3 霉菌毒素含量的测定方法
1.4.3.1 AFB1含量

根据样品中AFB1的实际含量取一定体积的样品溶液,在60 ℃下,用氮吹仪吹干。加入200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸,在涡旋混合仪上混合均匀,然后在40 ℃水浴中衍生反应大约1 min。取出衍生后的样品溶液,在60 ℃下用氮吹仪吹干,使用流动相定容到1.00 mL,过0.45 μm滤膜,高效液相色谱仪检测。

色谱条件:色谱柱Inertsil HPLC Column C8 4.6 nm×150 mm,流动相为乙睛∶ 水=30∶ 70(v/v),流速1.0 mL/min,柱温35 ℃,进样体积5 μL,检测波长,激发波长为365 nm,发射波长为440 nm。

1.4.3.2 ZEN含量

取上清液1 mL,0.45 μm水性滤膜过滤上机检测。

色谱条件:色谱柱:Inertsil HPLC Column C18 4.6 nm×150 mm,流动相:水∶ 乙睛∶ 甲醇=40∶ 50∶ 10(v/v/v),流速:1.0 mL/min,柱温:35 ℃,进样体积:5 μL(视样品浓度定),检测波长:236 nm,参比波长:460 nm。

1.4.3.3 DON含量

取上清液1 mL,0.45 μm水性滤膜过滤上机检测。

色谱条件:色谱柱:SYMMETRY C18 3.9 nm×150 mm,5 μm,流动相为水∶ 甲醇=90∶ 10(v/v)检测波长220 nm,参比波长360 nm,流速1.0 mL/min,柱温35 ℃,进样体积20 μL(具体进样体积视样品浓度而定,但不大于20 μL)。

1.5 数据统计与处理

数据用Excel处理后,结果以平均值±标准差表示,采用统计软件SPSS 16.0 ANOVA过程进行方差分析,并采用Duncan氏法进行多重比较,以P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析
2.1 等温吸附方程与最大吸附量
2.1.1 AFB1

用Langmuir方程和Freundlich方程分别对吸附曲线进行拟合,经拟合度检验证明,所有吸附剂对AFB1的等温吸附曲线均符合Langmuir方程。用Langmuir方程拟合,在pH 2.0、pH 8.0下得到等温吸附方程见表1。各吸附剂对AFB1的吸附量(Ca)随平衡浓度(Cr)的增加而增加。pH 2.0时,对AFB1的最大吸附量依次为组合Ⅳ>组合Ⅲ>组合Ⅱ>组合Ⅰ>乙酸酐改性葡甘露聚糖>葡甘露聚糖,以组合Ⅳ对AFB1的最大吸附量为最高;pH 8.0时,对AFB1的最大吸附量依次为组合Ⅲ=组合Ⅳ>组合Ⅰ>组合Ⅱ>乙酸酐改性葡甘露聚糖>葡甘露聚糖,以组合Ⅲ、组合Ⅳ对AFB1的最大吸附量为最高。

表1 葡甘露聚糖、葡甘露聚糖与膨润土复合物以及乙酸酐改性葡甘露聚糖吸附剂对AFB1的等温吸附方程 Table 1 Isothermal adsorption equations of GM, GM combined with bentonite and acetic anhydride modified GM on AFB1

2.1.2 ZEN

用Langmuir方程和Freundlich方程分别对吸附曲线进行拟合,经拟合度检验证明,所有吸附剂对ZEN的等温吸附曲线均符合Langmuir方程。用Langmuir方程拟合,在pH 2.0、pH 8.0下得到等温吸附方程见表2。吸附剂对ZEN的吸附量随平衡浓度的增加而增加。pH 2.0时,对ZEN的最大吸附量依次为组合Ⅳ>乙酸酐改性葡甘露聚糖>葡甘露聚糖>组合Ⅰ>组合Ⅲ>组合Ⅱ,以组合Ⅳ对ZEN的最大吸附量为最高;pH 8.0时,对ZEN的最大吸附量依次为组合Ⅳ>乙酸酐改性葡甘露聚糖>葡甘露聚糖>组合Ⅰ>组合Ⅲ>组合Ⅱ,以组合Ⅳ对ZEN的最大吸附量为最高。

表2 葡甘露聚糖、葡甘露聚糖与膨润土复合物以及乙酸酐改性葡甘露聚糖吸附剂对ZEN的等温吸附方程 Table 2 Isothermal adsorption equations of GM, GM combined with bentonite and acetic anhydride modified GM on ZEN

2.1.3 DON

以Langmuir方程和Freundlich方程将所有吸附剂对DON的吸附试验数据拟合曲线,从拟合度来看,发现所有吸附剂对DON的吸附均不符合上述2类等温吸附方程。

2.2 吸附与解吸
2.2.1 吸附

吸附剂对霉菌毒素的吸附与解吸结果见表3。各吸附剂对AFB1和ZEN的吸附量和吸附率与通过Langmuir方程得到的最大吸附量的变化趋势一致。各吸附剂对DON的吸附率都偏低,其中,pH 2.0时,吸附率最高的是组合Ⅳ,其对DON的吸附率仅为23.55%;pH 8.0时,吸附率最高的是葡甘露聚糖,其对DON的吸附率仅为27.16%。

2.2.2 解吸
2.2.2.1 AFB1

pH 2.0和50 ng/mL AFB1的吸附方式下,AFB1的累积解吸率为葡甘露聚糖>乙酸酐改性葡甘露聚糖>组合Ⅰ>组合Ⅳ>组合Ⅲ>组合Ⅱ。其中,与从葡甘露聚糖的累积解吸率相比,AFB1从组合Ⅳ、组合Ⅲ、组合Ⅱ的累积解吸率分别降低了97.87%、98.27%、98.66%,吸附稳定性得到了提高。

pH 8.0和50 ng/mL AFB1的吸附方式下,AFB1的累积解吸率为葡甘露聚糖>组合Ⅰ>组合Ⅲ>乙酸酐改性葡甘露聚糖>组合Ⅱ>组合Ⅳ,其中,与从葡甘露聚糖的累积解吸率相比,AFB1从组合Ⅱ、组合Ⅳ的累积解吸率分别降低了59.13%、78.30%,吸附稳定性也得到了提高。

50 ng/mL AFB1条件下,pH 8.0的AFB1累积解吸率高于pH 2.0。

2.2.2.2 ZEN

pH 2.0和1.134 μg/mL ZEN的吸附方式下,ZEN从组合Ⅳ的累积解吸率最低。与从葡甘露聚糖的累积解吸率相比,ZEN从组合Ⅰ、乙酸酐改性葡甘露聚糖、组合Ⅱ、组合Ⅲ、组合Ⅳ的累积解吸率分别降低了28.94%、50.94%、53.78%、59.89%、65.09%。

pH 8.0和1.134 μg/mL ZEN的吸附方式下,与从葡甘露聚糖的累积解吸率相比,ZEN从组合Ⅰ、乙酸酐改性葡甘露聚糖、组合Ⅲ、组合Ⅱ、组合Ⅳ的累积解吸率分别降低了14.65%、26.15%、31.03%、39.43%、45.56%,以ZEN从组合Ⅳ的累积解吸率为最低。

2.2.2.3 DON

pH 2.0和1.74 μg/mL DON的吸附方式下,以DON从组合Ⅱ的累积解吸率为最低,为4.35%。pH 8.0和1.74 μg/mL DON的吸附方式下,DON从组合Ⅱ的累积解吸率为最低,为5.83%。

综合说明,组合Ⅳ的吸附性能最好。

3 讨 论

等温吸附法已经被成功地用于评估霉菌毒素吸附剂的效果[5]。Langmuir方程、Freundlich方程是描述等温吸附的2种不同类型的方程。其中,Langmuir方程适用于单分子层的吸附,即1个吸附位置只吸附1个分子[6];Freundlich方程适用于多分子层的吸附,总吸附量为各层吸附量之和[7]。葡甘露聚糖、葡甘露聚糖与膨润土复合物及乙酸酐改性葡甘露聚糖吸附剂对AFB1、ZEN的等温吸附,用Langmuir方程和Freundlich方程拟合,符合Langmuir方程。说明葡甘露聚糖、葡甘露聚糖与膨润土复合物及乙酸酐改性葡甘露聚糖吸附剂对AFB1、ZEN的吸附方式为单分子层吸附。通过Langmuir方程,计算最大吸附量,发现1∶ 1葡甘露聚糖与膨润土复合物对AFB1、ZEN的最大吸附量最大。葡甘露聚糖的分子结构能把霉菌毒素牢牢吸附在其分子晶体结构中[8],因此,葡甘露聚糖能对抗霉菌毒素对动物的毒性[9, 10]。而膨润土对某种化合物的吸附主要包括物理吸附和化学吸附。物理吸附主要依靠静电引力和热运动的平衡作用,保持在扩散双电层的外层,因此这种吸附是可逆的,在一定程度上可以被重新解吸。而且,吸附量的大小取决于膨润土所带的电荷数,膨润土表面电荷密度愈大,离子所带电荷越多,吸附就越多[11]。化学吸附是在非静电因素作用下发挥的一种吸附作用,主要包括水合作用、离子和分子的相互作用及共价键和氢键结合等,这种吸附一般不容易解吸。从分子结构来看,AFB1有一个羟基,是一种极性化合物,所以膨润土对AFB1的吸附强;而ZEN属于弱极性化合物,这也就是膨润土对其吸附低的原因。而当葡甘露聚糖与膨润土以1∶ 1复合,对AFB1、ZEN的吸附效果最好。可能是葡甘露聚糖与膨润土以此比例复合,其物理结合程度最高,比表面积最大,吸附效果最好。本试验结果还表明,当葡甘露聚糖与膨润土以1∶ 1比例复合,pH 8.0条件下比pH 2.0条件下的吸附量大,说明,在肠道环境中由于复合吸附剂所带的电荷多,吸附多,而且也不容易被解吸掉。

表3 葡甘露聚糖、葡甘露聚糖与膨润土复合物以及乙酸酐改性葡甘露聚糖吸附剂对霉菌毒素的吸附与解吸 Table 3 Adsorption and desorption of GM, GM combined with bentonite and acetic anhydride modified GM on mycotoxins

目前,国内外学者对DON的等温吸附研究比较多[12, 13],但研究结果显示,各吸附剂对DON的吸附都不太理想,吸附率偏低。因此,许多研究者都对此展开了深入的研究。有研究报道,酯化葡甘露聚糖对DON的吸附较弱,仅为12.2%。天然的和改性的膨润土对DON的吸附能力很弱[12]。体外吸附试验结果表明,各吸附剂对DON的吸附率都偏低。其中,pH 2.0时,吸附率最高的吸附剂是1∶ 1组合的葡甘露聚糖与膨润土,其对DON的吸附率仅为23.55%;pH 8.0时,吸附率最高的吸附剂是葡甘露聚糖,其对DON的吸附率仅为27.16%。本试验结果说明,将葡甘露聚糖与膨润土进行复配,pH 2.0时,其对DON的吸附率确实有所提高,但是仍不理想。可能的原因是虽然膨润土是一种极性吸附剂,并且表面带有电荷,将葡甘露聚糖与膨润土进行复配,可以提高其对DON的吸附效果,但是DON是一种水溶性化合物,而本试验也是在水溶液中进行的,DON在水中的扩散度越大,吸附剂对其的吸附就越小。因此,还需要进行其他方式的复配以及对吸附剂的表面改性等。

4 结 论

本试验条件下,1∶ 1的葡甘露聚糖与膨润土复合物对霉菌毒素的吸附效果最好,吸附稳定性最高。

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