动物营养学报  2014, Vol. 26 Issue (1): 115-124   PDF (1033 KB)    
引用本文
欧阳克蕙, 张琪, 鲁友友, 瞿明仁, 熊小文, 潘珂. 高精料饲粮中添加烟酸对体外瘤胃发酵培养液pH及发酵参数动态变化的影响[J]. 动物营养学报, 2014, 26(1): 115-124.  
OUYANG Kehui, ZHANG Qi, LU Youyou, QU Mingren, XIONG Xiaowen, PAN Ke. Effects of Nicotinic Acid Supplementation in High Concentrate Diet on Dynamic Changes of Culture Solution pH and Fermentation Parameters of in Vitro Rumen Fermentation[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2014, 26(1): 115-124.  
高精料饲粮中添加烟酸对体外瘤胃发酵培养液pH及发酵参数动态变化的影响
欧阳克蕙, 张琪, 鲁友友, 瞿明仁 , 熊小文, 潘珂    
江西农业大学动物科学技术学院, 南昌 330045
收稿日期：2013-8-14
基金项目：国家现代农业产业技术体系项目（nycytx-38）；国家自然科学基金（31260561）；江西省教育厅项目（GJJ13274）
作者简介：欧阳克蕙（1974-），女，江西万安人，博士，副教授，硕士生导师，主要从事反刍动物营养研究。E-mail：ouyangkehui@sina.com*同等贡献作者*
通讯作者：瞿明仁，教授，博士生导师，qumingren@sina.com
摘要：本试验旨在研究高精料饲粮中添加烟酸对体外瘤胃发酵培养液pH及发酵参数动态变化的影响。选用3头体重（275±20） kg、安装永久性瘤胃瘘管的锦江黄牛作为瘤胃液供体，培养底物为高精料饲粮（精粗比85：15）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别在培养底物中添加0、400、800、1 200 mg/kg烟酸（干物质基础），每组4个重复。在培养0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、18.0、24.0 h取样，测定培养液pH及瘤胃发酵参数。结果表明：1）与Ⅰ组相比，虽然在培养24.0 h时各组的培养液pH无显著变化（P>0.05），但Ⅲ组在6.0~18.0 h显著高于Ⅰ组（P<0.05）；培养24.0 h时，与其他各组相比，Ⅲ组显著提高了瘤胃微生物蛋白和氨态氮浓度（P<0.05），极显著提高了总挥发性脂肪酸浓度（P<0.01），对乙酸、丙酸、丁酸的浓度没有显著影响（P>0.05），显著降低了乙酸/丙酸和乳酸浓度（P<0.05）。2）整体上，烟酸对Ⅱ和Ⅳ组培养液pH和发酵参数的影响均较小，但在培养后期（12.0~24.0 h），Ⅳ组有降低微生物蛋白浓度的趋势，且在18.0 h时达到显著水平（P<0.05）。3）在培养0~2.0 h，随烟酸添加水平的提高，乳酸净生成速率的波动幅度减小；培养液乳酸浓度与pH呈极显著负相关（R2=-0.957，P<0.01）。结果提示，高精料饲粮（精粗比85：15）中添加适量烟酸（800 mg/kg）可以促进瘤胃微生物的增殖，提高微生物蛋白浓度，促进挥发性脂肪酸产生，同时也提高了氨态氮的浓度，抑制了乳酸生成，减小了乳酸净生成速率的波动幅度，最终减缓了培养液pH的下降速率，避免了pH的剧烈变化，稳定了瘤胃内环境。
关键词： 高精料饲粮     烟酸     pH     瘤胃发酵参数     动态变化     体外法    
Effects of Nicotinic Acid Supplementation in High Concentrate Diet on Dynamic Changes of Culture Solution pH and Fermentation Parameters of in Vitro Rumen Fermentation
OUYANG Kehui, ZHANG Qi, LU Youyou, QU Mingren , XIONG Xiaowen, PAN Ke    
College of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China
Abstract: This study was conducted to investigate the effects of nicotinic acid (NA) supplementation in high concentrate diet on the dynamic changes of culture solution pH and fermentation parameters of in vitro rumen fermentation. Rumen fluid was collected from three Jinjiang cattle [(275±20) kg] fitted with permanent rumen fistulas. A high concentrate diet (the ratio of concentrate to forage was 85：15) was used. Four levels of NA [0, 400, 800 and 1 200 mg/kg (dry matter basis)] were supplemented in substrates of groups Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ and Ⅳ, respectively, with 4 replicates in each group. The specimen was sampled after being cultured for 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 12.0, 18.0 and 24.0 h to determine culture solution pH and fermentation parameters. The results showed as follows: 1) compared with group Ⅰ, although no significant difference was found in culture solution pH of different groups after being fermented for 24.0 h (P<0.05), but that of group Ⅲ was significantly higher after being fermented for 6.0 to 18.0 h (P<0.05); compared with the other groups, group Ⅲ significantly increased the concentrations of rumen microbial protein (P<0.05), ammonium nitrogen (P<0.05) and total volatile fatty acid (P<0.01), but significantly decreased acetate/propionate and lactic acid concentration (P<0.05), and no significant differences were found in the concentrations of acetate, propionate and butyrate (P>0.05). 2) Generally, the effects of NA on culture solution pH and fermentation parameters were not obvious in groups Ⅱ and Ⅲ, but microbial protein concentration of group Ⅳ showed a decreasing tendency in late period of fermentation (12.0 to 24.0 h), and the difference reached significant level at 18.0 h (P<0.05). 3) at 0~2.0 h of fermentation, the variation range of net production efficiency of lactate decreased with the increase of NA supplemental level; there was a significant negative correlation between lactic acid concentration and culture solution pH (R2=-0.957, P<0.01). The results indicate that NA supplementation in the high concentrate diet (the ratio of concentrate to forage is 85：15) at a proper level (800 mg/kg) can promote rumen microbial proliferation, increase microbial protein concentration, stimulate volatile fatty acid generation, and improve ammonium nitrogen concentration, but inhibit lactic acid generation, reduce the variation range of net production efficiency of lactate, ultimately decelerate the decline rate of culture solution pH, and avoid the dramatic change of pH to stabilize the ruminal environment.
Key words: high concentrate diet     nicotinic acid     pH     rumen fermentation parameters     dynamic change     in vitro method    

瘤胃液pH的改变是瘤胃内环境变化的主要表现，也是衡量瘤胃酸中毒发生的一个标志性指标[1]。当反刍动物在饲喂高精料饲粮时，大量的可溶性碳水化合物会造成瘤胃内微生物快速增殖，总挥发性脂肪酸(TVFA)和乳酸(LD)浓度增加，瘤胃液pH下降，从而造成瘤胃酸中毒的发生[2]。一些B族维生素如硫胺素，被发现能够显著降低瘤胃内乳酸和乙酸浓度，提高瘤胃液pH，改善山羊瘤胃内环境，缓解亚急性瘤胃酸中毒[3]。烟酸作为动物体内辅酶Ⅰ(NAD+)和Ⅱ(NADP+)的合成前体，可以减轻高产奶牛的酮病，提高产奶性能。还能促进瘤胃微生物生长，改变瘤胃发酵模式，从而提高奶牛、绵羊等反刍动物的生产性能[4, 5]。在我们前期的研究中也发现，用高精料饲粮(精粗比85∶ 15)饲喂肥育肉牛时，添加800 mg/kg烟酸(干物质基础)可提高肉牛日增重和饲料报酬，强化肥育效果[6]。但烟酸对高精料饲粮瘤胃发酵动态影响的研究尚不多见，对高精料条件下瘤胃酸中毒的发生是否有防治作用也不清楚。本试验采用体外瘤胃发酵法，研究在高精料饲粮条件下，烟酸对培养液pH及发酵参数动态变化的影响，旨在探讨烟酸对反刍动物瘤胃机能的调控作用，为烟酸这类B族维生素在反刍动物中的应用提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 瘤胃液供体动物及其饲粮

3头安装有永久性瘤胃瘘管的锦江黄牛，体重(275±20) kg，供瘤胃液采集。试验动物单栏饲养，日喂2次(08:00和17:00)，自由饮水。饲粮根据我国《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)[7]设计。精料组成及营养水平见表1，粗料为稻草，饲粮精粗比20∶ 80。预试期14 d。

表1 精料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the concentrate (air-dry basis) %

1.2 试验设计

培养底物为精粗比85∶ 15的高精料饲粮，所用精料和粗料同1.1供体牛所用。试验采用单因素完全随机试验设计。Ⅰ(对照)、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组在底物中分别添加0、400、800、1 200 mg/kg烟酸(干物质基础)，每组4个重复。烟酸购自郑州嘉禾生物制品有限公司，有效成分含量≥95%。

1.3 试验方法

采用体外批次培养法，培养装置参照卢德勋等[8]的方法。于正试期第1天晨饲前，由3头瘘管牛瘤胃内上、下、左、右(背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊)不同位点采集足量瘤胃液，4层纱布过滤后灌入经预热的收集瓶中，39 ℃水浴保温，并通入CO2备用。在培养瓶中加入预热好的人工唾液40 mL(人工唾液按Menke等[9]的方法配制)，底物4 g，然后迅速加入处理好的瘤胃液20 mL，放入装置中，在(39.0±0.5) ℃的摇床中振荡培养。

1.4 样品采集

在培养0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、12.0、18.0、24.0 h时，收集培养液，用2层纱布过滤。滤液即时测定pH，另一部分1 500 r/min离心15 min，取上清液于-20 ℃保存待测氨态氮(NH3-N)、挥发性脂肪酸(VFA)、乳酸和微生物蛋白(MCP)浓度。

1.5 测定指标及方法

培养液pH用pHS-25型pH计(上海今迈仪器仪表有限公司)测定；NH3-N浓度采用改进的比色法[10]测定；VFA浓度采用气相色谱法[11]测定；乳酸浓度采用酶法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所；MCP浓度采用三氯乙酸沉淀法[12]测定。

v= [Ct-C(t-1)]×V △t 。

式中：v为培养液中乳酸净生成速率(mmol/h)；Ct为t时间点培养液中乳酸浓度(mmol/L)；C(t-1)为t前1个时间点培养液中乳酸浓度(mmol/L)；V为培养液体积(L)；△t为2次取样的时间间隔(h)。

1.6 数据统计分析

试验数据采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法进行多重比较。

2 结果与分析
2.1 培养液pH

由表2可见，随着时间的推移，各组的培养液pH均呈现先升高后下降的趋势。在培养1.0 h达到最高，在6.0 h下降到5.50~5.69范围内，在第12.0 h下降到5.00左右，24.0 h时下降至4.75左右。在培养2.0~18.0 h，各组均有提高培养液pH的趋势。各组中，Ⅲ组效果最好，Ⅲ组培养液pH在1.0 h及发酵4.0~24.0 h均为最高，且在6.0~18.0 h显著高于Ⅰ和Ⅳ组(P<0.05)，在6.0、18.0、24.0 h时显著高于Ⅱ组(P<0.05)。Ⅱ组0.5 h显著低于Ⅰ组(P<0.05)，12.0 h显著高于Ⅰ组(P<0.05)。2.0 h时Ⅳ组显著高于Ⅰ组(P<0.05)。其他各时间点，Ⅱ组、Ⅳ组与Ⅰ组差异均不显著(P>0.05)。

表2 高精料饲粮中添加烟酸对体外瘤胃发酵培养液pH动态变化的影响 Table 2 Effects of nicotinic acid supplementation in high concentrate diet on dynamic change of culture solution pH after in vitro rumen fermentation


2.2 培养液MCP浓度

由表3可见，随着培养时间的延长，培养液中MCP的浓度逐渐升高。除了0~1.0 h外的各时间点均以Ⅲ组的MCP浓度最高，且差异在8.0~24.0 h时与其余3组、1.0~2.0 h时与Ⅱ组、4.0 h时与Ⅱ和Ⅳ组达到显著水平(P<0.05)。其他3组在大多数时间点差异不显著(P>0.05)，但在培养后期(12.0~24.0 h)，Ⅳ组低于Ⅰ组，且在18.0 h时达到显著水平(P<0.05)。

2.3 培养液NH3-N浓度

由表4可见，各组NH3-N浓度呈现先下降，0.5 h后开始上升，在2.0 h时达到最高峰，而后又逐渐下降，18.0 h降至谷底后，24.0 h时略有上升的趋势。这表明微生物利用NH3-N的最佳时间是在培养2.0 h之后。且各组NH3-N变动范围在4.18~11.36 mg/dL之间。4组中，Ⅲ组的各时间点NH3-N浓度均高于其他各组，除0、12.0 h外差异均达到显著水平(P<0.05)。

2.4 培养液VFA浓度

由表5可见，随着培养时间的延长，TVFA的浓度持续增加，并在24.0 h处达到最高。乙酸浓度逐渐下降,丙酸浓度先降低后升高，丁酸的浓度呈上升趋势。乙酸/丙酸在培养前0~2.0 h基本保持不变，2.0 h后急剧下降，发酵类型由乙酸型逐渐转变为丙酸型。烟酸显著或极显著提高了培养液TVFA浓度(P<0.05或P<0.01)，且Ⅲ组＞Ⅳ组＞Ⅱ组＞Ⅰ组。在大多数时间点，烟酸对乙酸、丙酸和丁酸的浓度没有规律性影响，仅在培养1.0~6.0 h时Ⅲ组，12.0 h时Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组的丁酸浓度极显著高于Ⅰ组(P<0.01)。烟酸对乙酸/丙酸没有规律性影响。

表3 高精料饲粮中添加烟酸对体外瘤胃发酵培养液MCP浓度动态变化的影响 Table 3 Effects of nicotinic acid supplementation in high concentrate diet on dynamic change of MCP concentration in culture solution after in vitro rumen fermentation mg/dL


表4 高精料饲粮中添加烟酸对体外瘤胃发酵培养液NH3-N浓度动态变化的影响 Table 4 Effects of nicotinic acid supplementation in high concentrate diet on dynamic change of NH3-N concentration in culture solution after in vitro rumen fermentation mg/dL


2.5 培养液乳酸浓度和乳酸净生成速率

由表6可见，各组乳酸浓度均在培养0.5 h时迅速升高，1.0 h时降低，然后又逐渐升高，24.0 h时达到最高。各培养时间点以Ⅲ组的乳酸浓度最低，其中0.5、2.0、8.0、24.0 h时显著低于Ⅰ组(P<0.05)。经相关性分析表明，培养液乳酸浓度与pH呈到极显著负相关(R2=-0.957，P<0.01)。

培养液乳酸净生成速率表现出振荡式的波动，在培养0.5 h时最大，培养1.0 h时降至最低，培养2.0 h时又升高，之后振荡波动幅度逐渐减小。从培养0~2.0 h看，随烟酸添加水平的提高，乳酸净生成速率的波动幅度减小。

3 讨 论
3.1 高精料饲粮中添加烟酸对体外瘤胃发酵培养液pH动态变化的影响

唾液分泌量、瘤胃的缓冲物质、有机酸生成、吸收和排出速度等均是影响瘤胃液pH的重要因素[13]。体外培养系统没有唾液和有机酸吸收、排出的影响，因此，培养液内碱性物质(如NH3-H)和有机酸的产生成为影响培养液pH的主要因素。本试验中，瘤胃液pH的变化呈现先升高后下降的趋势，在发酵1.0 h时达到最高值。这可能是发酵1.0 h时的高NH3-N和较低的VFA及乳酸浓度造成的。而后期随着TVFA和乳酸的蓄积，pH逐渐下降。在第6.0 h时下降到5.50，在第12.0 h下降到5.00，达到亚急性和急性瘤胃酸中毒的范围[14]。在大多数的研究中，添加烟酸对瘤胃液pH没有影响[15, 16, 17]，甚至趋于使瘤胃液pH降低[18, 19]。这可能与饲粮类型不同有关。Ottou等[19]认为发酵底物、烟酸添加水平及选取的时间点不同，会导致试验结果的差异，前人这些试验中饲粮精粗比多在(40∶ 60)~(60∶ 40)之间，而在本试验的高精料(精粗比85∶ 15)条件下，试验组pH虽然在24.0 h时与Ⅰ组差异不显著，但Ⅲ组在2.0~18.0 h时有提高培养液pH的趋势，且在一定时间段达到显著水平。这和上述试验[15, 16, 17, 18, 19]的结论都不同。而杨艳等[20]在精粗比80∶ 20的情况下所得的结果与本试验相同。

表5 高精料饲粮中添加烟酸对体外瘤胃发酵培养液VFA浓度动态变化的影响

Table 5 Effects of nicotinic acid supplementation in high concentrate diet on dynamic changes of VFA concentrations in culture solution after in vitro rumen fermentation
3.2 高精料饲粮中添加烟酸对体外瘤胃发酵培养液MCP、NH3-N和VFA浓度动态变化的影响

大量试验表明，添加烟酸可促进瘤胃微生物的生长，增强瘤胃MCP的合成，提高瘤胃MCP产量[4, 21]，促进瘤胃氮代谢增强，增加NH3-N浓度[18, 21]；而另一些学者认为,补加烟酸后促进了微生物对NH3-N的利用，降低了瘤胃液NH3-N浓度[22, 23]。Christensen等[24]发现，脂肪和烟酸间存在互作，高脂饲粮添加烟酸使NH3-N浓度提高，而低脂饲粮中则NH3-N浓度降低。添加烟酸还会改变瘤胃的发酵模式，增加瘤胃中VFA浓度[25]，提高瘤胃中丙酸浓度，使乙酸和丁酸浓度降低[5, 23, 26]。Schaetzel等[27]观察到添加烟酸对瘤胃微生物的生长有影响，并使得瘤胃中VFA浓度增加了9%，丙酸浓度增加了57%。也有学者认为，补加烟酸对瘤胃微生物没有影响，对瘤胃内NH3-N浓度没有显著影响[26, 28]，TVFA浓度不变[15, 18]；甚至降低[26]。Doreau等[16]认为烟酸对乙酸、丙酸及TVFA的浓度没有影响，但增加了丁酸的浓度。本试验中添加中等水平(800 mg/kg)的烟酸可提高瘤胃液MCP浓度，提高NH3-N浓度，与Horner等[18]和Erickson等[21]的结果相同，但与Kumar等[22]和Samanta等[23]的结果不同。这可能是由于烟酸添加水平不同、对烟酸的适应性不同以及饲粮及环境因素影响所致[18, 19, 27]。Riddell等[26]在体外试验结果表明，当基础饲粮中精粗比为80∶ 20时，添加烟酸后可促进MCP的合成；当饲粮粗粗比达到50∶ 50时，添加烟酸效果不佳。本试验中添加800 mg/kg烟酸培养液NH3-N浓度达峰值，且高于Ⅰ组，以后比Ⅰ组降低更快，与陆治年等[29]的报道一致。中等水平烟酸还极显著提高TVFA浓度，对乙酸、丙酸的浓度和乙酸/丙酸没有规律性影响，但在一定程度上提高了丁酸浓度，这与Doreau等[16]的结果相符。但添加低水平(400 mg/kg)的烟酸对MCP浓度没有影响，而过高水平(1 200 mg)的烟酸在后期会降低MCP浓度。过高过低水平的烟酸对NH3-N和VFA浓度都没有影响。虽然目前在反刍动物中还未观察到烟酸的毒性[29]，但在给人服用大剂量烟酸时发现有短暂的毒性作用[30]。高水平烟酸对MCP的抑制是否也与其毒性有关目前还不能确定。

表6 高精料饲粮中添加烟酸对体外瘤胃发酵培养液乳酸浓度和乳酸净生成速率动态变化的影响 Table 6 Effects of nicotinic acid supplementation in high concentrate diet on dynamic changes of concentration and net production efficiency of lactate in culture solution after in vitro rumen fermentation

3.3 高精料饲粮中添加烟酸对体外瘤胃发酵培养液乳酸浓度动态变化的影响

由于乳酸的酸度是VFA酸度的数10倍[酸度系数(pKa)3.1 vs. 4.8][31]，是影响瘤胃液pH、诱发瘤胃酸中毒的关键因素[32]。本试验中瘤胃内乳酸含量均在培养0.5 h时迅速升高，培养1.0 h时降低，然后又逐渐升高，和pH的变化呈极显著负相关。潘晓花等[33]也报道了乳酸浓度这种升高后降低的趋势。本试验还发现添加中等剂量的烟酸后也显著降低了乳酸的浓度，这可能是Ⅲ组中TVFA的浓度提高，但pH反而下降的原因。杨艳[20]研究亦表明添加烟酸可抑制乳酸脱氢酶的活性，显著降低高精料饲粮中乳酸的浓度，提高瘤胃液pH。本试验结果与其相同。

乳酸的生成是一个可逆反应[34]。在对培养0~2.0 h的观察还发现，添加烟酸还显著改变了乳酸的净生成速率，减小了乳酸净生成速率的振荡幅度。瘤胃液pH并不是一成不变的，而是在不断变化的。这种变化不仅有因采食而造成的日周期变化，更有短时间内的振荡变化[14]，其原因尚不清楚。从本试验结果看，可能正是乳酸净生成速率的波动，造成了瘤胃液pH的振荡变化。而添加烟酸不仅可以通过减少乳酸的浓度来提高瘤胃液pH，更可能通过减少乳酸净生成速率的波动振荡幅度而避免瘤胃液pH的剧烈变动，起到稳定瘤胃内环境的作用。但在培养后期，由于测定时间间隔的原因，未能观察到更多的结果，需要将来更多的试验来验证。

4 结 论

高精料饲粮(精粗比85∶ 15)中添加800 mg/kg烟酸可促进瘤胃MCP合成，促进瘤胃TVFA产生，同时提高NH3-N浓度，降低乳酸浓度和乳酸净生成速率的波动幅度，最终减缓瘤胃液pH的下降速率，稳定瘤胃内环境。

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