2. 延边大学农学院, 延吉 133002
, LI Guangyu1, CHANG Zhongjuan1, ZHANG Tietao1, ZHONG Wei1, ZHOU Ning2, SUN Weili1, ZHAO Jingbo1, YANG Fuhe1
2. Agriculture College, Yanbian University, Yanji 133002, China
水貂是珍贵的毛皮动物，蛋白质是毛皮动物最主要的营养素之一。毛发主要是角蛋白，角蛋白形成的主要来源是饲粮中的蛋白质，因此研究饲粮中的蛋白质对调节动物毛绒生长的作用机理，充分发挥蛋白质的营养作用，从而提高毛皮动物生产性能具有十分重大的意义。大量研究证明，增加饲粮中粗蛋白质的采食量和吸收量，对于绵羊、安哥拉山羊、内蒙古绒山羊、蓝狐、安哥拉兔等毛皮动物毛纤维的生长有很大的促进作用[1, 2, 3, 4]。蛋白质主要是分解为氨基酸后被动物利用，含硫氨基酸是毛皮动物的第一限制性氨基酸[5]，Mata等[6]研究表明，随着饲粮中蛋氨酸含量的增加，羊毛纤维直径、羊毛产量及羊的活体重量都显著增加。Typpnen等[7]的研究结果表明，低蛋白质水平饲粮中补充蛋氨酸时，与高蛋白质水平饲粮相比对蓝狐毛皮品质影响的差异不大。此外，Zhang等[8]和Dahlman[9]研究表明，适当降低蓝狐饲粮蛋白质水平，补充足够量的可消化含硫氨基酸时，对冬毛期蓝狐的毛皮品质无显著影响。因而从分子水平上来解释蛋白质和含硫氨基酸对水貂毛发生长的调控机理，有助于阐明水貂在特定饲粮条件下对蛋白质和含硫氨基酸的需要量。胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(IGF-ⅠR)和表皮生长因子(EGF)基因广泛存在于动物皮肤及毛囊中，在毛发生长过程中发挥着重要的作用[10, 11, 12]。目前，关于饲粮蛋白质水平和蛋氨酸的添加对水貂皮肤组织中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因表达影响的报道很少。为此，本试验采用实时荧光定量PCR方法研究饲粮中不同蛋白质水平和蛋氨酸的添加对水貂皮肤中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因表达的影响，旨在阐明饲粮蛋白质和蛋氨酸对水貂毛皮发育的作用，为蛋白质及含硫氨基酸对毛皮发育机理研究奠定基础。
选用125日龄平均初始体重为(1.95±0.20) kg、身体健康的雄性水貂56只，分为4组，每组14个重复，分别为A组(饲粮蛋白质水平为32%)、B组(饲粮蛋白质水平为24%)、C组(饲粮蛋白质水平为16%)和D组(饲粮蛋白质水平为24%，同时添加0.8%DL-蛋氨酸)，试验预试期5 d，正试期80 d。整个试验期内由固定饲养人员进行专门的饲养管理。动物每天早晚各饲喂1次，早饲喂量为全天饲粮的40%，晚饲喂量为60%，自由饮水。
根据水貂常用鲜动物性饲料原料配制不同蛋白质水平的试验饲粮。试验饲粮组成及营养水平见表1。
 | 表1 试验饲粮组成及营养水平 Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets % |
正试期第80 天时，进行屠宰试验，每组选4只体重相近的水貂取腹侧部皮肤样品，置于焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)处理过的冻存管中，立即放入液氮中保存备用。
利用总RNA提取试剂盒(Bioteke Corporation)提取水貂皮肤组织中总RNA，溶于经DEPC处理的超纯水中，用紫外分光光度计检测RNA，OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.0证明提取的总RNA纯度符合试验要求。同时提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，确定其完整性。
在无RNA酶污染的环境中，应用TaKaRa试剂盒中反转录试剂盒说明书，配制10 μL反转录反应体系，总RNA 1.2 μL，5×PrimeScript Buffer (for Real Time) 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，RNase Free dH2O 5.3 μL。将上述PCR管中的溶液混合均匀，在以下反应条件下进行反应，42 ℃，15 min(反转录反应)，85 ℃，5 s(反转录酶的失活反应)，4 ℃保存，结束反应。
根据GenBank中人、鼠的β-肌动蛋白(β-actin)序列(登录号：NM_001101.3；NM_007393.3)、IGF-Ⅰ序列(登录号：NM_000618.3；NM_001111276.1)、IGF-ⅠR序列(登录号：BC113612；NM_052807.2)和EGF序列(登录号：NM_001178130.1；NM_010113.3)，利用DNAstar软件找出其保守区域、利用引物分析软件Primer 5.0分析设计其特异性引物。用β-actin作为内参基因，实时荧光定量PCR引物详细信息见表2(引物由大连宝生物公司合成)。
| 表2 实时荧光定量PCR引物详细信息 Table 2 Detailed information of real-time fluorescence quantitative PCR primers |
按照TaKaRa公司反转录试剂盒，配制50 μL反应体系，10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，上游引物(F)2 μL，下游引物(R)2 μL，cDNA模板2 μL，r-Taq酶0.26 μL，dH2O 34.74 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性30 s，引物的复性温度根据所有引物退火温度范围设置梯度，均在55~65 ℃，此步骤持续时间均为30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存，结束反应。
确定好反应温度后，利用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa)对β-actin、IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因进行扩增，同时建立标准曲线，反应体系为20 μL，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6 μL。反应条件为预变性95 ℃、30 s；变性95 ℃，5 s；复性60 ℃，35 s(40个循环)；95 ℃，60 s；60 ℃，60 s。扩增结束后进行熔解曲线及结果分析，60 ℃，10 s(71个循环)。
利用实时荧光定量PCR分别检测出目的基因和内参基因，2-ΔΔCt方法分析基因相对表达差异量，试验数据采用统计软件SAS 8.0的一般线性模型(GLM)模块进行的单因素方差分析。表中的结果均为“平均值±标准差”( ±SD)，其中P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
取2 μL总RNA，利用3%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，如图1所示。紫外分光光度计测定OD260 nm/OD280 nm在1.8~2.0，表明总RNA无降解，符合试验纯度，可以进行反转录试验。β-actin、IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因经3%琼脂糖凝胶电泳，发现条带与所预计的产物很相近，如图2所示，各对引物PCR扩增后的条带清晰，无杂带，片段大小符合引物设计要求。测序后与目的序列一致性为100%，为目的基因片段。这进一步说明了合成的cDNA可以用来进行实时荧光定量PCR反应。
 | 图1 水貂皮肤总RNA电泳结果
Fig.1 Electrophoresis result of total RNA of mink skin |
 | 图2 目的基因检测结果
Fig.2 Result of object genes test |
饲粮蛋白质水平和蛋氨酸添加对水貂毛皮相关基因表达的影响见表3。
| 表3 饲粮蛋白质水平和蛋氨酸添加对水貂毛皮相关基因表达的影响 Table 3 Effects of dietary protein level and methinion supplementation on fur related gene expressions |
可以看出，饲粮蛋白质水平与中等蛋白质水平(24%)饲粮中补充蛋氨酸对水貂皮肤中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因的相对表达量均有极显著的影响(P＜0.01)。随着饲粮蛋白质水平的降低，IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因的相对表达量逐渐下降，但B组和C组之间差异不显著(P＞0.05)，当中等蛋白质水平饲粮中补充蛋氨酸(D组)后，水貂皮肤中IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR基因的相对表达量极显著的高于B组和C组(P＜0.01)，但与A组差异不显著(P＞0.05)；水貂皮肤中EGF基因B组和C组极显著低于A组(P＜0.01)，且中等蛋白质水平饲粮中补充蛋氨酸后，水貂皮肤中EGF基因极显著高于B组和C组(P＜0.01)，但仍极显著低于A组(P＜0.01)。从表中可以看出，水貂皮肤中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF 3种基因，IGF-ⅠR的相对表达量相对较高，IGF-Ⅰ和EGF的相对表达量相对较低，且两者差异不明显。
本试验结果显示，随着饲粮蛋白质水平的提高和中等蛋白质水平饲粮中蛋氨酸的添加，水貂皮肤中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因的相对表达量均有极显著的增加趋势。大量研究表明，在小鼠、绵羊、鸡等动物上，饲粮蛋白质水平对动物肝脏中的IGF-Ⅰ基因的相对表达量及血清中的IGF-Ⅰ含量具有显著影响，该基因的相对表达量与饲粮蛋白质水平呈正相关[13, 14, 15, 16]。此外，荣风梅等[17]研究表明，当饲粮中添加不同水平的蛋氨酸时，随着蛋氨酸水平的增加新西兰肉兔肝脏组织中IGF-Ⅰ基因的相对表达量有上升的趋势。Carew等[18]试验表明，8～22日龄的雄性肉鸡饲粮中蛋氨酸缺乏时，对肉鸡血清中IGF-Ⅰ的含量没有显著的影响，但IGF-Ⅰ基因在组织中的相对表达量会显著降低。本试验结果显示，中等蛋白质水平饲粮中添加蛋氨酸对IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR和EGF基因相对表达量有极显著的提高作用。IGF-Ⅰ对维持和调节动物毛发的生长是必不可少的，尤其是在毛周期的初期，IGF-Ⅰ对防止毛囊过早的进入中期具有重要的调节作用[19]。大量研究结果表明，当提高饲粮中蛋白质水平或蛋氨酸含量时对动物毛绒的生长有显著的提高作用[2, 3]，且外源性的IGF-Ⅰ能够显著促进体外毛囊的生长发育，同时影响毛囊的形态[20, 21]。可见在饲粮的蛋白质和蛋氨酸调节水貂毛绒生长的过程中，IGF-Ⅰ是其发挥作用的重要信号传导因子之一，或直接作用于毛囊或需要其他生长因子的共同协调参与。
关于饲粮蛋白质和蛋氨酸水平对IGF-Ⅰ及其受体基因相对表达量差异及其机制研究比较多，而对EGF基因的相对表达量研究相对较少。EGF作为一种生长因子，同其他生长因子一样与饲粮中营养成分有很大的相关性。Rogers等[21]年研究发现，生长激素(GH)对EGF基因的表达与生成具有重要的调节作用。当饲粮蛋白质水平和蛋氨酸的添加量提高时，可以显著地提高血液中GH的含量，饲粮中的蛋白质和蛋氨酸水平可能通过GH来调节EGF基因的表达[22]。Ekberg等[23]研究发现，当给大鼠外源性的GH时，可以显著地提高大鼠肝脏中EGF及其受体基因的表达水平，而且能够有效提高EGF与其受体的结合能力。本试验结果显示随着饲粮蛋白质水平的下降，EGF基因的相对表达量有降低趋势，这可能与饲粮营养成分的不足而引起GH的量减少有关，但具体机理尚不明确。研究发现，EGF及其受体在成熟的毛囊中分布广泛，主要分布在外根鞘、角朊细胞、皮脂腺和毛囊的上皮等部分[24]。姚玉园等[25]研究表明EGF对毛囊生长有正向调节作用，且适当浓度的EGF能够显著促进体外毛囊生长[26, 27]，分析原因可能是真皮鞘细胞在一定条件下转化为毛乳头细胞，从而促进了毛囊生长。具体EGF基因如何调节毛绒生长的机理有待于进一步研究。
饲粮高蛋白质水平和中等蛋白质水平饲粮中蛋氨酸的添加能够促进水貂皮肤中IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR及EGF基因的表达。
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