仔猪在断奶时自身的免疫系统尚未发育完全，而断奶将中断其母源抗体供应，这将损伤或抑制其免疫功能，导致仔猪在断奶后易出现生长缓慢、腹泻、感染疾病及死亡率升高等仔猪断奶综合征[1, 2, 3]。在传统的仔猪的生产过程中，经常通过在饲粮中添加抗生素来促进仔猪的健康生长，然而在抗生素带了巨大的经济效益的同时也引发了药物残留、药物抵制等一系列严重的负面效应[4, 5]。因此，开发具有免疫调节作用、天然绿色的抗生素替代品对促进断奶仔猪的健康生长和保障畜产品的安全有重要的意义。甲壳素是真菌细胞壁及虾、蟹等节肢类动物外壳的主要成分之一。壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基得到的一种天然的、无毒的、可生物降解的、带正电荷的碱性多糖[6]。研究表明，壳聚糖能够影响动物机体内花生四烯酸(araehidonieaeid，AA)的代谢进而可能影响机体的免疫功能。AA的代谢网络是炎症代谢网络中的一个核心网络[7]。在正常的生理状态，机体中AA浓度很低，当细胞膜受到各种刺激时(如炎症、寄生虫等)，细胞膜磷脂在磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)催化作用下可以生成AA[8, 9]。AA在体内主要有2条代谢途径：一是在环氧合酶(cyclooxygenase,COX)作用下最终产生多种前列腺素，二是在脂氧化酶(lipoxygenase，LOX)作用下最终产生白细胞三烯等激素类物质，而产物中的前列腺素E2(PGE2)和白三烯B4(LTB4)具有重要的免疫调节功能：PGE2可增强单核细胞、中性粒细胞的趋化反应等;LTB4可诱导活化抑制性T细胞和自然杀伤细胞(N-K细胞)等[8, 9, 10]。Bianeo等[11]研究发现壳聚糖可以激活巨噬细胞的胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)，进而促进了AA的释放。Usami等[12]的试验表明壳聚糖能刺激犬多形核细胞合成并释放PGE2和LTB4。本课题组前期研究发现，壳聚糖对肉仔鸡免疫功能的影响可能与其提高肉仔鸡血清AA浓度、cPLA2活性及小肠胞内cPLA2 mRNA表达有关[13]。尽管人们对壳聚糖影响动物机体内AA的代谢有了初步的研究，但是有关壳聚糖对断奶仔猪机体内AA代谢的研究较少，且有关壳聚糖通过影响AA代谢来调节机体免疫功能的分子机理也不太清楚。为此，本试验旨在以断奶仔猪外周血淋巴细胞(PBLs)为研究对象，深入研究不同水平壳聚糖对断奶仔猪PBLs中AA代谢网络途径中主要参与炎症反应或免疫调节的介质、关键控制酶及其基因表达的影响，以期为揭示壳聚糖发挥免疫调节作用的可能途径和促进其在仔猪生产中的应用提供科学的理论依据。
试验所用壳聚糖(食品级，CAS RN.：9012-76-4)购买于济南海德贝海洋生物有限公司，黏度为45 mPa·s，脱乙酰度为85.09%。
试验所用淋巴细胞采于1头健康的28日龄断奶的三元杂交仔猪(杜×大×长)。在无菌采血后用猪淋巴细胞分离液(天津TBD,中国)按照说明书分离淋巴细胞。血样在800×g离心分离20 min，收集的淋巴细胞用RPMI-1640培养基(Gibco公司，美国)洗涤2次。将淋巴细胞用台盼蓝染色法在光学显微镜进行计数后，再悬于适量的RPMI-1640完全培养基[100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10%胎牛血清和25 mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液]中。
调整淋巴细胞密度为1×106个细胞/mL RPMI-1640完全培养基，接种于2个24孔板中，每孔接种量为1 mL，置于37 ℃、5％CO2的培养箱中进行培养。壳聚糖的添加浓度为0、40、80、160和320 μg/mL，每个处理设6个重复。培养24 h后，每孔中加入200 μL最终浓度为16 μmol/mL刀豆蛋白A(Sigma公司，美国)来刺激细胞的分化。继续培养24 h后，离心后收集上清液(800×g，在4 ℃下离心10 min)，冻存于-20 ℃，待测定cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及AA、PGE2和LTB4的浓度；收集细胞，冻存于-80 ℃，待分析cPLA2、COX-2和5-LOX mRNA的表达。
上清液中cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及AA、PGE2和LTB4的浓度采用放射免疫法测定，所用仪器为中国科技大学实业总公司生产的GC-911-γ-放射免疫计数器。试剂盒由北京华英生物技术研究所提供。
淋巴细胞中总RNA用RNAiso试剂盒(大连宝生物，中国)按照说明书进行提取，RNA的完整性用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析检测；RNA的纯度在多功能酶标仪(TECAN，瑞士)上用OD260 nm/OD280 nm来确定；RNA的浓度在多功能酶标仪上读取。取适量的RNA用PrimeScript RT试剂盒(大连宝生物，中国)进行反转录，反应体系为10 μL，其中含有0.5 μL PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I、2 μL 5× PrimeScript Buffer、0.5 μL Random 6mers、0.5 μL Oligo dT Primer和适量的无酶水；反应条件为:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。
引物用NCBI网站上的在线引物设计工具设计(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index)，由上海生工生物工程有限公司合成。以β-肌动蛋白(β-actin)为管家基因，对各个目的基因进行相对定量分析。各基因的引物序列见表1。
 | 表1 基因引物序列
Table 1 Gene primer sequences
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采用SYBR PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒(大连宝生物，中国)进行实时定量PCR扩增。PCR反应体系为20 μL，其中10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTM、0.4 μL上游引物(10 μmol/L)、0.4 μL下游引物 (10 μmol/L)、2 μL的cDNA模板和7.2 μL无酶水。用Bio-Rad实时定量PCR仪(Bio-Rad，美国)进行β-actin、cPLA2、COX-2和5-LOX基因的PCR扩增反应，反应条件为:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环后，72 ℃延伸10 min。反应结束后在70~95 ℃绘制熔解曲线。反应过程中用无酶水作为阴性对照，基因的相对表达量用2-ΔΔCt法[14]计算。扩增产物经单一熔解曲线峰进行确定后，再取5 μL的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳确定产物片段大小后，由上海生工生物工程有限公司进行测序来确定产物序列。
所有数据经Excel 2007整理后，采用SAS 9.0软件中回归分析程序进行统计，对含不同水平壳聚糖的处理进行线性和二次回归分析。P<0.05代表回归关系显著；P<0.01代表回归关系极显著。
由表2可知，随着壳聚糖添加水平的升高，PBLs培养液中的cPLA2、COX-2和5-LOX活性及AA、PGE2和LTB4浓度呈显著的二次曲线变化(P<0.05)，且上述所有指标的最大值出现在壳聚糖的添加水平为80~160 μg/mL时。然而，当壳聚糖的添加水平增加到320 μg/mL时，以上各指标的值有不同水平的降低。这表明壳聚糖的添加水平与cPLA2、COX-2、5-LOX活性及AA、PGE2、LTB4浓度之间存在二次剂量依赖关系。
| 表2 壳聚糖对断奶仔猪PBLs培养液中cPLA2、COX-2和5-LOX活性及AA、PGE2和LTB4浓度的影响 Table 2 Effects of chitosan on cPLA2, COX-2 and 5-LOX activities and AA, PGE2 and LTB4 concentrations in PBLs medium of weaner piglets |
由表3可知，随着壳聚糖添加水平的升高，PBLs中cPLA2、COX-2和5-LOX mRNA的相对表达量呈显著的二次曲线变化(P<0.05)，且上述所有指标的最大值出现在壳聚糖的添加水平为80~160 μg/mL时。然而，当壳聚糖的添加水平增加到320 μg/mL时，以上各指标的值有不同水平的降低。这说明在壳聚糖的添加水平与cPLA2、COX-2和5-LOX mRNA的相对表达量之间也存在二次剂量依赖关系。
| 表3 壳聚糖对断奶仔猪PBLs培养液中cPLA2、COX-2和5-LOX基因表达的影响 Table 3 Effects of chitosan on the expressions of cPLA2, COX-2 and 5-LOX genes in PBLs medium of weaner piglets |
AA是机体内一种分布最广的、属于n-6系列的多不饱和的必需脂肪酸。体内大部分AA是以sn-2位置酯化的形式存在于细胞膜磷脂当中,没有生物活性；少量AA以游离的形式存在于细胞质和体液中,具有活性[15]。当细胞受到刺激时(如炎症、寄生虫等)，在细胞膜cPLA2的作用下释放AA[8, 9]。cPLA2是细胞内PLA2主要亚型，并能够特异性水解甘油磷脂sn-2位的脂酰键进而产生大量的AA[16]。在本试验中，壳聚糖不仅增加了断奶仔猪PBLs培养液中的AA浓度，而且提高了AA的代谢关键酶cPLA2的活性和淋巴细胞中cPLA2 mRNA的相对表达量。此外，壳聚糖对上述指标的影响都呈现出一定的二次剂量依赖关系。这表明适当水平的壳聚糖可能通过提高控制AA生产的关键酶cPLA2的活性及其基因表达进而影响AA的代谢。Bianeo等[11]研究发现适当水平(0.01%～0.05%)的壳聚糖，可以显著促进巨噬细胞释放AA，而高水平(＞0.05%)的壳聚糖没有使AA发生显著变化，并认为壳聚糖激活了cPLA2从而促进巨噬细胞释放AA。程富胜等[17]报道蕨麻多糖能够影响小鼠淋巴细胞AA代谢水平从而影响了机体免疫机能。李慧英等[13]研究指出，壳聚糖可以显著提高肉仔鸡血清中AA浓度、cPLA2活性及小肠胞内cPLA2 mRNA的表达。本试验的结果与前人的研究结果基本一致。试验中PBLs中AA浓度的升高可能是由于壳聚糖激活了PBLs中cPLA2 mRNA的表达引起cPLA2活性升高所致。
AA在体内主要有2条代谢途径：一是在COX作用下先生成不稳定的环内过氧化物前列腺素G2(PGG2)和前列腺素H2(PGH2)，PGH2在PGE酶的催化下生成PGE2和血栓素A2；二是在5-LOX作用下，生成5-羟基过氧化二十碳四烯酸，接下来被氧化成白三烯A4和5-羟基二十碳四烯酸，白三烯A4可以进一步生成LTB4等激素类物质,AA及其代谢产物具有参与细胞免疫和炎症反应等重要的生理功能[8, 9, 10, 15]。在本试验中，随着壳聚糖添加水平的升高，PBLs培养液中的COX-2和5-LOX的活性及PGE2和LTB4浓度呈现显著的二次曲线升高；与之对应的PBLs中COX-2和5-LOX的mRNA相对表达量也呈现显著的二次曲线升高。这表明壳聚糖不仅影响AA的产生，而且还可以影响AA的COX和LOX代谢途径的代谢产物、关键酶及其基因表达。Usami等[12]报道壳聚糖能够刺激犬多形核细胞合成并释放PGE2和LTB4。李慧英[17]研究指出壳聚糖可以显著提高肉仔鸡血清中PGE2和LTB4的浓度。本试验的结果表明，适量的壳聚糖可以影响AA的COX和LOX代谢途径，这与前人的研究结果相近。AA的代谢网络是炎症反应的主要网络,该网络中的COX-2是环氧合酶途径中催化AA产生PGE2的一种重要的诱导酶，5-LOX是脂氧化酶途径中催化AA产生LTB4的关键酶[7,10,16]。尽管有关壳聚糖对淋巴细胞中COX-2和5-LOX的mRNA表达影响的报道较少，但本试验的结果表明淋巴细胞上清中PGE2和LTB4浓度及COX-2和5-LOX的活性可能是由于壳聚糖提高淋巴细胞中COX-2和5-LOX的mRNA表达所致。AA的代谢产物中的PGE2和LTB4具有重要的免疫调节功能：PGE2可增强单核细胞、中性粒细胞的趋化反应等;LTB4可诱导活化抑制性T细胞和N-K细胞等[8, 9, 10]，这表明壳聚糖可能通过对AA的下游代谢途径的影响进而发挥其对机体免疫功能的调节作用。此外，也有研究表明壳聚糖可以抑制脂多糖(LPS)所诱导的RAW264.7鼠巨噬细胞中PGE2浓度和COX-2基因表达的升高[18]。这表明壳聚糖对PGE2的产生具有双向调节作用，即单独添加壳聚糖可以促进机体PGE2的产生，而当在受到外界刺激时(如LPS)壳聚糖又能抑制PGE2的大量产生。
传统上，人们认为AA及其代谢产物是致炎因子，然而有研究表明AA还是一个非常重要的细胞内第二信使，参与细胞内信号转导进而调控细胞的生物活动[15]。由此可见，AA的代谢对机体的影响是复杂多样的，需要我们做更深入的研究来探寻其未知的、具体的功能。在本试验中，适当水平的壳聚糖促进了断奶仔猪PBLs内AA代谢网络途径中参与炎症或免疫调节的主要介质PGE2和LTB4的产生，提高了关键控制酶cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及其基因表达。本试验的结果也为进一步揭示壳聚糖发挥免疫调节作用的可能途径和促进其在仔猪生产中的应用提供了一定的理论依据。
本试验的结果表明：适当水平的壳聚糖可以促进断奶仔猪PBLs内AA代谢网络途径中参与炎症或免疫调节的主要介质PGE2和LTB4的产生，提高关键控制酶cPLA2、COX-2和5-LOX的活性及其基因表达，这可能是其发挥免疫调节功能的原因之一。
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