瘤胃酸中毒是奶牛饲养过程中最常见的营养代谢病。在现代奶牛生产中，为了提高奶牛产奶量，养殖者往往在奶牛饲粮中使用大量精料，这会导致瘤胃酸中毒的发生率大大提高。瘤胃酸中毒分为急性瘤胃酸中毒(ARA)和亚急性瘤胃酸中毒(SARA)。在实际生产中，SARA更为常见。在SARA条件下，瘤胃内会产生大量内毒素(即脂多糖)。瘤胃中的内毒素通过消化道转运到血浆中，可引起一系列与之相关的负面反应，如引起奶牛免疫活化状态升高、影响奶牛的营养代谢、容易暴发某些特定疾病或并发其他营养代谢性疾病，从而影响奶牛的生产性能和健康状况。研究表明，在SARA条件下，血浆内毒素可以使血浆非脂化脂肪酸(NEFA)、葡萄糖和乳酸含量升高，使血浆胆固醇、β-羟丁酸含量降低[1, 2, 3]。血浆内毒素还可以对血浆中钙、铁、锌、磷含量产生影响[4, 5]，也可使血浆中游离氨基酸含量产生变化[6, 7]。但是，关于SARA条件下，内毒素对奶牛代谢的影响尚缺乏全面的系统研究。本研究针对现阶段我国奶牛规模化养殖业中优质粗饲料缺乏、精粗比普遍较高的实际情况，模拟国内常见饲粮模式配制奶牛泌乳高峰期饲粮，研究饲粮粗饲料组成和营养水平对奶牛血浆内毒素和代谢产物含量的影响，同时进一步研究血浆内毒素与代谢产物含量变化的关系，为SARA及相关疾病的机理研究提供理论依据。
试验采用单因素随机区组设计，选用经产(第2胎)、体况良好及泌乳天数[(193±21) d]、产奶量和体重相近的荷斯坦奶牛30头，分为3组，分别为单一秸秆高精料(HCS)组、单一秸秆低精料(LCS)组、混合粗饲料低精料(LMF)组，每组10头。试验期56 d。
试验饲粮组成及营养水平见表1。3组饲粮精饲料种类相同。HCS和LMF组饲粮参照NRC(2001)进行设计，这2组饲粮营养水平相同(纤维素水平除外)，但精粗比和粗饲料组成不同。LCS与HCS组粗饲料组成相同，但精粗比和营养水平不同。LCS与LMF组精粗比相同，但LCS组的粗饲料品质和营养水平低于LMF组。
 | 表1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础)
Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %
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 | 图1 血浆内毒素和NEFA含量的关系 Fig.1 Relationship between plasma contents of endotoxin and EFA |
试验期每天定时(08：30和17：30)饲喂全混合日粮(TMR)，保证每头牛都有足够的TMR，且剩料量不超过投料量的5%。奶牛自由饮水，自由运动，每天定时(08：00和19：00)赶至挤奶厅挤奶2次。挤奶设备为利拉伐挤奶系统，对设备每天清洗消毒，挤奶程序严格按照标准程序进行。
在试验期第8周的第5天早上饲喂前从尾动脉采取血样10 mL。采集的血样装入肝素钠抗凝管中，经3 000 r/min离心10 min，小心吸取血浆分装入1.5 mL的多支试管，然后保存于-20 ℃的冰箱中待测。
采用显色基质鲎试剂法测定，测定用试剂盒购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司。
用双缩脲比色法测定血浆总蛋白含量，溴甲酚绿比色法测定血浆白蛋白含量，GOD/HK法测定血浆葡萄糖含量，胆固醇氧化酶法测定血浆总胆固醇含量，最后用总蛋白含量减去白蛋白含量得出血浆球蛋白含量，检测所用仪器为GF-2280全自动生化分析仪(山东高密彩虹分析仪器有限公司)。血浆D-乳酸和NEFA含量利用试剂盒来测定，测定用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。血浆β-羟丁酸含量采用比色法在日立7160全自动生化仪上测定，测定用试剂盒购自宁波瑞源生物科技有限公司。
血浆游离氨基酸包括赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、色氨酸(Trp)、谷氨酸(Glu)、缬氨酸(Val)、苏氨酸(Thr)、鸟氨酸(Orn)、胱氨酸(Cys)、组氨酸(His)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)含量及血浆总游离氨基酸含量采用日立L-8800型氨基酸自动分析仪进行测定。操作过程如下：准确取血浆样品0.8 mL于5 mL塑料离心管中，加入0.8 mL 4%磺基水杨酸溶液，振荡摇匀。将离心管于12 000 r/min离心5 min，用0.22 μm滤膜过滤上机分析。1个样品分析周期为53 min，分析仪有2个流路和2根柱子。分离柱(4.6 mm×60 mm)：洗脱液流经此柱，流速0.40 mL/min，柱温70 ℃，柱压13.798 MPa；反应柱：茚三酮及茚三酮缓冲液流经此柱，流速0.35 mL/min，柱温135 ℃，柱压为0.780 MPa。
用二甲苯胺蓝比色法测定血浆镁含量，偶氮砷Ⅲ比色法测定血浆钙含量，紫外分光光度法测定血浆磷含量，所用仪器为GF-2280全自动生化分析仪(山东高密彩虹分析仪器有限公司)。血浆钠、钾、铜、锰、锌、铁、硒含量采用TAS-990FG石墨炉原子吸收分光光度计(北京普析仪器有限公司)测定，测定时采用自吸扣背景方式。按照仪器系统推荐程序进行加热。血浆样品用含1 mg/L硝酸钯的硝酸溶液(1%的硝酸溶液)进行稀释。用标准溶液的吸光度制成标准曲线，然后算出各个样品的元素含量。
试验数据先用Excel 2003进行初步整理分析，再用SPSS 18.0统计软件线性模型进行统计分析，考虑的影响因素为试验处理。采用LSD法进行多重比较，以P<0.01表示差异极显著，P<0.05表示差异显著，P<0.10表示有差异趋势。所有结果数据以最小二乘均值±标准差来表示。最后选取差异显著的指标，用GraphPad Prim 5软件将其与血浆内毒素含量进行线性回归分析。
由表2可知，HCS组血浆内毒素含量显著高于LCS组(P<0.05)，同时也有高于LMF组的趋势(P>0.05)。
| 表2 饲粮粗饲料组成和营养水平对奶牛血浆内毒素含量的影响 Table 2 Effects of dietary roughage composition and nutrient levels on plasma endotoxin content in dairy cows |
由表3可知，3组奶牛血浆总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆固醇、葡萄糖、D-乳酸含量均无显著差异(P>0.05)。HCS组血浆NEFA含量分别极显著高于LCS和LMF组(P<0.01)，而LCS和LMF组血浆NEFA含量基本一致(P>0.05)。LCS和LMF组血浆β-羟丁酸含量极显著高于HCS组(P<0.01)，而LCS和LMF组血浆β-羟丁酸含量无显著差异(P>0.05)。由图2可知，血浆内毒素和NEFA含量呈极显著的正相关(P<0.01)。由图3可知，血浆内毒素和β-羟丁酸含量呈负相关趋势(P<0.10)。
| 表3 饲粮粗饲料组成和营养水平对奶牛血浆代谢产物含量的影响 Table 3 Effects of dietary roughage composition and nutrient levels on plasma metabolite contents in dairy cows |
 | 图2 血浆内毒素和β-羟丁酸含量的关系 Fig.2 Relationship between plasma endotoxin and β-hydroxybutyric acid contents |
 | 图3 血浆内毒素和铜含量的关系 Fig.3 Relationship between plasma endotoxin and Cu contents |
由表4可知，LCS组血浆总游离氨基酸含量显著低于HCS和LMF组(P<0.05)。LMF组血浆Lys、Cys和Asp含量显著高于HCS组(P<0.05)。
| 表4 饲粮粗饲料组成和营养水平对奶牛血浆游离氨基酸含量的影响 Table 4 Effects of dietary roughage composition and nutrient levels on plasma free amino acid contents in dairy cows μmol/L |
由表5可知，HCS组血浆铜含量极显著高于LCS和LMF组(P<0.01)，而LCS和LMF组血浆铜含量无显著差异(P>0.05)。LCS和LMF组血浆铁含量极显著高于HCS组(P<0.01)，而LMF组血浆铁含量显著高于LCS组(P<0.05)。LMF组血浆锰含量极显著高于HCS组(P<0.01)，也显著高于LCS组高(P<0.05)，而LCS组血浆锰含量显著高于HCS组(P<0.05)。HCS组血浆钙含量显著高于LCS和LMF组(P<0.05)，而LCS和LMF组血浆钙含量无显著差异(P>0.05)。HCS组血浆磷含量显著高于LCS和LMF组(P<0.05)，而LCS和LMF组血浆磷含量无显著差异(P>0.05)。 如图3所示，血浆内毒素与铜含量呈显著的正相关(P<0.05)。如图4所示，血浆内毒素与锰含量呈极显著的负相关(P<0.01)。
| 表5 饲粮粗饲料组成和营养水平对奶牛血浆矿物元素含量的影响 Table 5 Effects of dietary roughage composition and nutrient levels on plasma mineral element contents in dairy cows |
 | 图4 血浆内毒素和锰含量的关系 Fig.4 Relationship between plasma endotoxin and Mn contents |
本研究结果表明，HCS组血浆内毒素含量显著高于LCS组，与Andersen等[8]、Dougherty等[9]、Khafipour等[1]、张瑞阳等[10]、吴永霞[11]的研究结果一致。在精粗比相同而粗饲料组成和营养水平不同的LCS和LMF组之间，血浆内毒素含量的差异不显著。因此，血浆内毒素含量主要受到饲粮精粗比的影响，而饲粮粗饲料组成及营养水平的不同对血浆内毒素含量的影响不大。
Zebeli等[2]用高精料饲粮饲喂奶牛，发现血浆NEFA和葡萄糖含量增高与瘤胃内毒素含量升高有很强的一致性，而血浆总胆固醇、β-羟丁酸含量却随着瘤胃内毒素含量的降低而降低。Ametaji等[3]报道，增加奶牛饲粮中大麦比例(0、15%、30%、45%)使血浆中葡萄糖和NEFA含量升高，使血浆中β-羟丁酸、总胆固醇含量下降。另外，Waldron等[12]对泌乳期奶牛静脉注射内毒素，同样发现血浆葡萄糖和NEFA含量上升，而血浆中β-羟丁酸含量下降。本研究中，HCS组血浆内毒素含量最高，其血浆NEFA含量也是最高，而血浆β-羟丁酸含量最低，与上述研究结果一致。本研究中，血浆内毒素和NEFA含量呈极显著的正相关，血浆内毒素和β-羟丁酸含量呈负相关趋势，这也验证了上述研究结果。尽管3组奶牛血浆葡萄糖和总胆固醇含量差异不显著，但是它们的变化趋势仍然与上述研究结果相符。
对于NEFA来说，HCS组饲粮中精料比例高，瘤胃发酵速度快，所以血浆中NEFA含量会增高[3]。另外，HCS组血浆内毒素含量较高，引起机体免疫活化，为了满足机体免疫系统对能量的需求，奶牛动用体脂，因此血浆NEFA含量升高[3]。另外，LCS和LMF组的血浆NEFA含量无显著差异，这说明血浆NEFA含量与饲粮粗饲料组成和营养水平关系不大。对于β-羟丁酸来说，HCS组β-羟丁酸含量低的原因有2个：第一，饲粮中精料比例较高，所发酵产生的丁酸含量降低，而丁酸是β-羟丁酸的重要前体物质，因此β-羟丁酸含量下降。第二，外周血液中的内毒素使血浆葡萄糖和胰岛素含量升高，而葡萄糖和胰岛素继而刺激肝细胞，使其生酮作用减弱，因此产生的β-羟丁酸含量减少[3]。在对奶牛灌注外源内毒素的试验中，同样发现血浆β-羟丁酸含量降低[12]。因此，在这2种原因中，可能以第2种为主要原因。另外，LCS和LMF组血浆NEFA和β-羟丁酸含量均无显著差异，这说明血浆β-羟丁酸含量与饲粮粗饲料组成和营养水平关系不大。总之，血浆NEFA和β-羟丁酸含量主要受到饲粮精粗比的影响，并与血浆内毒素含量关系密切，而与饲粮粗饲料组成和营养水平关系不大。
Waggoner等[6, 7]在人工注射内毒素引起肉牛免疫反应的试验中，发现牛血浆中的Lys、Met、Ile、Leu、Phe、Ser、Gly、Trp、Asp、Glu、Val、Thr和Orn含量下降，而Cys、His、Gln和Asn含量基本不受影响。张石蕊等[13]用不同精粗比饲粮饲喂南方奶牛时发现，高精料组(精粗比为60∶ 40)的奶牛血浆中Asp、Glu、Ser、Gly、Tyr、His、Met、Val、Phe、Lys含量比低精料组(精粗比为40∶ 60)低，同时高精料组血浆中Ala、Thr、Arg、Leu含量比低精料组高。本研究中，LCS组血浆总游离氨基酸含量同时低于HCS和LMF组，这是因为LCS组营养水平低于HCS和LMF组。LCS组粗蛋白质含量为13.9%(干物质基础)，而HCS和LMF组分别为16.9%和16.8%。因此，LCS组各游离氨基酸含量普遍偏低。HCS和LMF组营养水平相近，且HCS组血浆内毒素含量比LMF组高，2组间血浆Lys和Asp含量的差异与Waggoner等[6, 7]和张石蕊等[13]的研究结果一致。2组间血浆Cys含量的差异与Waggoner等[6, 7]和张石蕊等[13]的研究结果不一致。
事实上，在动物体内，Cys参与合成谷胱甘肽和一些自由基清除剂[14]，Asp普遍存在于生物合成作用中，Lys是急性期蛋白的重要组成成分，当机体发生免疫反应时，它被免疫细胞吸收并合成急性期蛋白[15]。本研究中，HCS组血浆内毒素含量高，机体免疫状态较高，Cys参与抗氧化作用，Asp广泛参与各种生物合成作用，Lys也参与急性期蛋白的合成，可能导致了HCS组血浆中的这3种氨基酸含量低于LMF组。另外，尽管差异不显著，但是HCS和LMF组血浆Thr、Ser、Glu、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe含量的变化趋势与Waggoner等[6, 7]研究结果一致。综上所述，饲粮营养水平是影响血浆游离氨基酸含量的重要因素，在营养水平基本一致的情况下，饲粮精粗比对奶牛血浆游离氨基酸含量有一定的影响。
Zebeli等[4]用大麦含量分别为0、15%、30%和45%的饲粮来饲喂4组奶牛时，发现血浆中钙、铁和锌含量随着精料含量的升高而呈曲线变化。血浆中钙、铁和锌含量最高的是采食大麦含量为15%饲粮的奶牛；血浆中钙、铁和锌含量最低的是采食大麦含量为45%饲粮的奶牛。Waldron等[5]对泌乳期的奶牛静脉灌注大肠杆菌内毒素后，发现血浆钙、磷含量与内毒素含量呈负相关性，镁含量不受内毒素含量的影响。本研究中，血浆铁、镁和锌含量变化规律符合以上研究结果，而血浆钙和磷含量不符合以上研究结果。巩庆亮[16]用精料含量不同(30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、100%)的饲粮饲喂奶牛时，发现血浆钙、磷、钾、铁、铜、锰含量均呈现二次曲线变化，在50%或55%精料组出现拐点，其中45%精料组的血浆钾、铜、锰、锌含量均高于70%精料组，而45%精料组的血浆钙、磷、铁含量却低于70%精料组。本研究中的血浆钙、磷、钾、锌、锰含量变化规律符合此研究结果，而血浆铁、铜含量变化与此研究结果不符合。
对于血浆铁来说，有研究表明，铁主要参与C反应蛋白(CRP)的合成，与机体的急性期反应有关[17]。本研究中，HCS组精料比例大，血浆内毒素含量高，可能导致急性期反应强烈，最终可能导致HCS组血浆铁含量降低。对于血浆铜来说，铜在某些免疫相关酶的激活过程中起着重要作用，在内毒素诱导的急性期反应中，铜和锌的相互配合共同稳定急性期蛋白的二级和三级结构[18]。本研究中，HCS组血浆内毒素含量高，可能急性期反应较强，血浆铜大量用于免疫反应，可能导致大量组织内储存的铜进入血浆，使血浆铜含量升高。目前，关于血浆锰和内毒素的关系的报道还很少，有待于进行深入的研究。由图4和图5可知，血浆铜和锰含量与内毒素含量的关系密切。另外，LCS和LMF组血浆铁、锰含量也有显著的差异，这可能是由于粗饲料组成不同所造成的。
对于血浆钙、磷来说，本研究的研究结果与Zebeli等[4]和Waldron等[5]的研究结果不一致。研究表明，血钙可以通过稳定急性期蛋白的构型以达到协助机体消除内毒素的目的[4]，特别是可以促进淀粉样蛋白-A单体聚合成淀粉样大分子来发挥消除内毒素的作用[18]。血浆磷能缓冲血液pH。血浆钙、磷含量可能受到很多因素调控。Petzl等[19]给奶牛注射内毒素(每15 min注射1次)，发现奶牛会产生内毒素耐受现象，受到240 h LPS刺激的奶牛其耐受性要高于受到70 h内毒素刺激的奶牛。Petzl等[19]还指出，产生LPS耐受性的奶牛体内的白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α等免疫相关因子的基因表达并不活跃。因此，若是长期用高精料饲粮饲喂奶牛，尽管奶牛血浆内毒素含量升高，但是部分奶牛有可能产生内毒素耐受现象。另外，Goff等[20]指出，甲状旁腺素、前列腺素以及造骨细胞分泌IL-6以刺激破骨细胞，使之加强破骨作用，从而提高血浆中钙和无机磷含量。动物体钙和磷的平衡主要受2种激素影响：一种是由甲状旁腺分泌的甲状旁腺激素，它可促使骨盐溶解以提高血钙含量，血浆甲状旁腺激素含量主要受到血浆钙含量的调控；另一种是在肾脏内产生的1，25-二羟维生素D3，它是维生素D3的活性形式。本研究是在饲喂奶牛8周后进行的血样采集，这个时候部分奶牛可能产生内毒素耐受现象，加之奶牛自身体液调节影响，因此本研究中HCS组的血浆钙和磷含量并未降低。
① 血浆内毒素含量随着饲粮精粗比的升高而升高，而与饲粮营养水平及饲粮粗饲料组成关系不大。
② 血浆NEFA、铜、钙和磷含量随着饲粮精粗比的升高而升高，血浆β-羟丁酸、锰含量随着饲粮精粗比的升高而下降，且它们与血浆内毒素含量有着密切关系。血浆游离氨基酸总体上受到饲粮营养水平和精粗比的综合影响。
③ 饲粮精粗比会影响血浆中内毒素含量，后者进而引起血浆部分代谢产物含量的变化。这种变化可能会对动物健康状况和生产性能产生影响，值得进一步深入研究。
| [1] | KHAFIPOUR E, KRAUSE D O, PLAIZIER J C.A grain-based subacute ruminal acidosis challenge causes translocation of lipopolysaccharide and triggers inflammation[J]. Journal of Dairy Science, 2009, 92(3):1060-1070. ( 2)
|
| [2] | ZEBELI Q, DUNN S M, AMETAJ B N.Perturbations of plasma metabolites correlated with the rise of rumen endotoxin in dairy cows fed diets rich in easily degradable carbohydrates[J]. Journal of Dairy Science, 2011, 94(5):2374-2382. (2)
|
| [3] | AMETAJ B N, EMMANUEL D G V, ZEBELI Q, et al.Feeding high proportions of barley grain in a total mixed ration perturbs diurnal patterns of plasma metabolites in lactating dairy cows[J]. Journal of Dairy Science, 2009, 92(3):1084-1091. (5)
|
| [4] | ZEBELI Q, DUNN S M, AMETAJ B N.Strong associations among rumen endotoxin and acute phase proteins with plasma minerals in lactating cows fed graded amounts of concentrate[J]. Journal of Animal Science, 2010, 88(4):1545-1553. (4)
|
| [5] | WALDRON M R, NONNECKE B J, ISHIDA T N, et al.Effect of lipopolysaccharide infusion on serum macromineral and vitamin D concentrations in dairy cows[J]. Journal of Dairy Science, 2003, 86(11):3440-3446. (3)
|
| [6] | WAGGONER J W, LÖEST C A, TURNER J L, et al.Effects of bacterial endotoxin and dietary protein on serum hormones and plasma amino acids in growing steers[J]. American Society of Animal Science, 2007, 58:348-351. (4)
|
| [7] | WAGGONER J W, LÖEST C A, MATHIS C P, et al.Effects of rumen-protected methionine supplementation and bacterial lipopolysaccharide infusion on nitrogen metabolism and hormonal responses of growing beef steers[J]. Journal of Animal Science, 2009, 87(2):681-692. (4)
|
| [8] | ANDERSEN P H, BERGELIN B, CHRISTENSEN K A.Effect of feeding regimen on concentration of free endotoxin in ruminal fluid of cattle[J]. Journal of Animal Science, 1994, 72(2):487-491. (1)
|
| [9] | DOUGHERTY R W, COBURN K S, COOK H M, et al.Preliminary study of appearance of endotoxin in circulatory system of sheep and cattle after induced grain engorgement[J]. American Journal of Veterinary Research, 1975, 36(6):831-832. (1)
|
| [10] | 张瑞阳, 王东升, 朱伟云, 等.奶牛静脉血内毒素浓度及其与产奶量的相关性[J]. 动物营养学报, 2012, 24(5):822-827. (1)
|
| [11] | 吴永霞.不同日粮模式对奶山羊和奶牛血中内毒素含量及免疫活化状态的影响[D]. 硕士学位论文.重庆:西南大学, 2012:31-41. (1)
|
| [12] | WALDRON M R, NISHIDA T, NONNECKE B J, et al.Effect of lipopolysaccharide on indices of peripheral and hepatic metabolism in lactating cows[J]. Journal of Dairy Science, 2003, 86(11):3447-3459. (2)
|
| [13] | 张石蕊, 易学武, 贺喜, 等.不同精粗比全混合日粮饲养技术对南方奶牛采食行为、产奶性能和血清游离氨基酸的影响[J]. 草业学报, 2008, 17(3):23-30. (2)
|
| [14] | WU G, FANG Y Z, YANG S, et al.Glutathione metabolism and its implications for health[J]. The Journal of Nutrition, 2004, 134(3):489-492. (1)
|
| [15] | REEDS P J, JAHOOR F.The amino acid requirements of disease[J]. Clinical Nutrition, 2001, 20(Suppl.1):15-22. (1)
|
| [16] | 巩庆亮.不同精料日粮对奶牛瘤胃需氧及兼性厌氧菌和矿物质元素代谢的影响[D]. 硕士学位论文.泰安:山东农业大学, 2008:47-55. (1)
|
| [17] | BLACK S, KUSHNER I, SAMOLS D.C-reactive protein[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279:48487-48490. (1)
|
| [18] | WANG L M, COLÓN W.Effect of zinc, copper, and calcium on the structure and stability of serum amyloid A[J]. Biochemistry, 2007, 46(18):5562-5569. (2)
|
| [19] | PETZL W, GVNTHER J, PFISTER T, et al.Lipopolysaccharide pretreatment of the udder protects against experimental Escherichia coli mastitis[J]. Innate Immunity, 2012, 18(3):467-477. (2)
|
| [20] | GOFF J P, REINHARDT T A, HORST R L.Enzymes and factors controlling vitamin D metabolism and action in normal and milk fever cows[J]. Journal of Dairy Science, 1991, 74(11):4022-4032. (1)
|