反刍动物瘤胃内生成的甲烷(CH4)以嗳气的形式释放到大气中。一方面，CH4能占摄入饲料总能的2%~15%，瘤胃中CH4的产生降低了饲料能量的利用效率[1]；另一方面，CH4是温室气体。反刍动物产生的CH4大约占释放到大气中CH4总量的15%，其对地球温室效应的影响占所有影响因素的15%~20%[2]。因此，减少反刍动物CH4产量不仅有利于提高反刍动物对饲料能量的利用效率，而且也有利于缓解地球的温室效应。
稻草是我国重要的粗饲料资源。稻草的粗纤维含量高，粗蛋白质含量低，适口性差，消化率低。反刍动物对未加工处理稻草的消化率一般仅为50%左右。秸秆氨化技术经济实用，简单易行。研究表明，利用尿素对稻草进行氨化处理，能够提高稻草的粗蛋白质含量，降低粗纤维含量，提高干物质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的瘤胃降解率[3]。李兵等[4]研究结果显示，随着尿素水平的提高，氨化稻草的可消化性提高，但瘤胃发酵的CH4产量也同时提高。如何应用氨化技术，在提高反刍动物对稻草的消化率的同时，使氨化稻草在瘤胃发酵过程中的CH4产量不增加或减少，是应该用秸秆氨化技术面临的重要问题。
延胡索酸是生物体三羧酸循环的中间产物，延胡索酸还原菌能够把延胡索酸还原成琥珀酸，进一步形成丙酸[5]。延胡索酸二钠(disodium fumarate,DF)是有效的氢气(H2)受体，能够促进丙酸生成，降低CH4产量[6]。因而，延胡索酸有利于降低瘤胃CH4的产量。López等[7]研究表明，延胡索酸二钠能够降低CH4产量，提高饲料干物质消化率。Carro等[8]研究表明，延胡索酸二钠能够提高体外发酵挥发性脂肪酸(volatile fatty acids,VFA)产量，降低CH4产量。Wood等[9]研究结果显示，进行包被处理的延胡索酸能够降低瘤胃发酵CH4产量。本试验拟研究延胡索酸二钠对氨化稻草体外瘤胃发酵CH4和VFA产量的影响。
以使用0(未处理)、4%、6%的尿素氨化处理的稻草作为饲料样品。氨化稻草的制作按照李兵等[4]的方法进行：称取1 kg风干稻草，切短至2 cm左右；将40 g尿素溶解于400 mL自来水，配制成10%(质量体积比 )的尿素溶液。量取40 mL 10%的尿素溶液，均匀喷洒在100 g稻草上，使尿素溶液与秸秆混合均匀，制备4%尿素处理的氨化稻草。量取60 mL 10%的尿素溶液，均匀喷洒在100 g稻草上，制备6%尿素处理的氨化稻草。将稻草装入广口瓶，每个处理分别使用10个广口瓶，每个瓶为1个重复。将广口瓶密封，保存在避光处28 d。环境平均温度为21.4 ℃(7.8~31.3 ℃)。氨化过程完成后，取出稻草，制备成风干样品，粉碎过1 mm网筛备用。
延胡索酸二钠，相对分子质量160.04，分析纯，纯度98%。
试验采用3×5双因素设计，即3个[0(未处理)、4%、6%]尿素水平氨化处理稻草和体外发酵液中5个(0、2%、4%、8%、12%)延胡索酸二钠添加水平。每个处理设置10个重复，每批发酵样品设置3个空白。
选用2头体况良好，体重相近，安装永久性瘤胃瘘管，平均体重约为550 kg的西门塔尔牛作为瘤胃液供体。试验牛的饲粮包括精饲料2.0 kg/d,粗饲料7.0 kg/d。精饲料组成为：玉米58%、豆粕20%、小麦麸18%、碳酸氢钙2%、食盐1%、微量元素预混料1%。粗饲料为干羊草。每天将饲粮分为相等的2份，分别在07：00和17:00喂牛。瘤胃液供体牛拴系饲养，自由饮水。饲喂15 d后，第16天时开始采集瘤胃液。
采用Menke等[10]的体外产气法进行发酵。使用内径为32 mm、长200 mm、体积最大刻度为100 mL的玻璃注射器作为发酵器。使用能够准确控温的生化培养箱(SHP-150，上海培因实验仪器有限公司)作为控温装置。
缓冲液A：称取CaCl2·2H2O 13.2 g、MnCl2·4H2O 10.0 g、CoCl2·6H2O 1.0 g和FeCl3·6H2O 8.0 g，溶解于100 mL蒸馏水中。缓冲液B：称取NaHCO3 35 g和NH4HCO3 4 g，溶解于1 000 mL蒸馏水中。缓冲液C：称取Na2HPO4 5.7 g、KH2PO4 6.2 g和MgSO4·7H2O 0.6 g,溶解于1 000 mL蒸馏水中。
还原剂溶液：将4 mL 1 mol/L NaOH和625 mg Na2S·9H2O添加于95 mL蒸馏水中，制备成溶液，混合均匀。还原剂溶液需现配现用。
缓冲液的混合顺序为：400 mL蒸馏水、0.1 mL缓冲液A、200 mL缓冲液B、200 mL缓冲液C、40 mL还原剂溶液。
在早晨饲喂后2 h，分别从2头供体牛的瘤胃中采取瘤胃液250 mL，经4层纱布过滤、混匀后放入保温瓶中，迅速带回实验室，测定其pH。将瘤胃液与混合缓冲液以1∶ 2的体积比例装入试剂瓶中，混合均匀，置于39 ℃水浴恒温箱中保温，并持续通入二氧化碳(CO2)。
样品总产气量为试验处理注射器48 h总产气量与空白处理注射器48 h总产气量之差。
利用气相色谱仪(TP-2060T,北京北分天普仪器技术有限公司)测定气体样品中的CH4、CO2和H2产量。
发酵结束后，采集5 mL发酵液，装入50 mL离心管内，在15 000×g下离心15 min。准确吸取上清液1 mL于2 mL离心管中，并加入250 μL 25%(质量体积比)的偏磷酸溶液充分混合，在15 000×g下再次离心15 min，吸取2 μL上清液,应用气相色谱仪测定VFA产量。
式中：Y样品为样品48 h产气量(mL/g)或VFA产量(μmol/g)；Y试验为试验处理发酵液48 h产气量(mL/g)或VFA产量(μmol/g)；Y空白为空白处理48 h产气量(mL/g)或VFA产量(μmol/g)；DM为样品干物质含量(g)。
应用SAS 9.0统计分析软件的one-way ANOVA对各处理的数据进行方差分析，差异显著者采用Duncan氏法进行多重比较。统计分析模型为：
Yij=μ+αi+βj+εij。式中：Yij表示观测值；μ表示所有观测值的平均值；αi表示尿素氨化稻草第i水平的处理效果(i=1、2、3)；βj表示延胡索酸二钠第j水平的处理效果(j=1、2、3、4、5、6)；εij表示随机误差。
从表1可以看出，延胡索酸二钠提高了未处理和氨化稻草体外瘤胃发酵的总产气量和CO2产量,其中2%延胡索酸二钠显著提高了未处理稻草的总产气量(P<0.05)，12%延胡索酸二钠显著提高了6%尿素氨化稻草的总产气量(P<0.05)。12%延胡索酸二钠显著降低了4%尿素氨化稻草的H2产量(P<0.05)。延胡索酸二钠降低了CH4/总产气量和CH4/总挥发性脂肪酸(TVFA)，其中8%和12%延胡索酸二钠显著降低了4%尿素氨化稻草的CH4/总产气量(P<0.05)，12%延胡索酸二钠显著降低了6%尿素氨化稻草的CH4/总产气量(P<0.05)，2%、4%、8%和12%延胡索酸二钠显著降低了未处理稻草的CH4/TVFA(P<0.05),12%延胡索酸二钠显著降低了4%尿素稻草的CH4/TVFA(P<0.05)。
 | 表1 延胡索酸二钠对氨化稻草体外瘤胃发酵产气量的影响(干物质基础)
Table 1 Effects of DF on gas production of ammoniated rice straw after in vitro rumen fermentation (DM basis)
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随尿素水平的提高，稻草的总产气量和CO2产量显著提高(P<0.05)，CH4/总产气量和CH4/TVFA显著下降(P<0.05)，但其他指标没有显著变化(P>0.05)。
尿素水平对各指标均存在显著影响(P<0.05)，延胡索酸二钠添加水平对除H2产量外的各指标影响均显著(P<0.05)，尿素和延胡索酸二钠对总产气量、CH4产量、CH4/总产气量、CH4/TVFA均存在显著的交互作用(P<0.05)。
从表2可以看出，延胡索酸二钠降低了未处理和氨化稻草的乙酸/丙酸，其中2%、4%、8%和12%的延胡索酸二钠显著降低了未处理和6%尿素氨化稻草乙酸/丙酸(P<0.05)，8%和12%的延胡索酸二钠显著降低了4%尿素氨化稻草乙酸/丙酸(P<0.05)。延胡索酸二钠提高了丙酸产量，其中，8%和12%的延胡索酸二钠显著提高了未处理和4%尿素氨化稻草的丙酸产量。总体上，延胡索酸二钠能够降低乙酸和丁酸产量，仅8%延胡索酸二钠显著降低了6%尿素氨化稻草的乙酸产量(P<0.05)，2%、4%、8%和12%的延胡索酸二钠仅显著降低了6%尿素氨化稻草的丁酸产量(P<0.05)。TVFA产量未呈现一致性规律。
| 表2 延胡索酸二钠对氨化稻草体外瘤胃发酵VFA产量的影响(干物质基础) Table 2 Effects of DF on VFA production of ammoniated rice straw after in vitro rumen fermentation (DM basis) |
随着尿素水平的提高，TVFA、乙酸、丙酸和丁酸的产量显著提高(P<0.05)。
尿素水平对除丁酸/TVFA外的各指标均存在显著影响(P<0.05)，延胡索酸二钠添加水平对除TVFA产量外的各指标均存在显著影响(P<0.05)，但是二者仅对乙酸、丙酸和TVFA产量的影响存在显著交互作用(P<0.05)。
López等[7]的体外发酵试验表明，延胡索酸二钠添加水平为5~10 mmol/L时，提高了饲粮的总产气量，降低了CH4产量，对H2产量没有显著影响。Carro等[8]报道，延胡索酸二钠添加水平为4~10 mmol/L时，降低了饲粮体外发酵的CH4产量，但对总产气量没有影响。本试验向每个注射器发酵液中添加的延胡索酸二钠水平分别为0、0.83、1.67、3.33、5.01 mmol/L。结果显示，延胡索酸二钠能够显著提高未处理和氨化稻草体外发酵的总产气量和CO2产量，没有降低CH4的绝对产量，但是能够显著降低其相对产量，即CH4/总产气量和CH4/TVFA。本试验结果与上述报道一致。总产气量是衡量饲料可消化性的重要指标。延胡索酸二钠提高了未处理和氨化稻草总产气量，说明延胡索酸二钠有促进纤维素消化的作用[6]。延胡索酸二钠降低了未处理以及4%和6%尿素氨化稻草CH4相对产量的原因，可能是延胡索酸二钠促进了延胡索酸还原菌的生长，从而与产CH4菌竞争H2，减少了CH4的相对产量[5]。这说明，延胡索酸二钠不仅能够降低饲粮的CH4产量，而且也能够降低未处理和氨化稻草瘤胃发酵CH4的相对产量。
López等[7]应用自由采食苜蓿干草并补饲300 g精饲料的绵羊瘤胃液对饲粮进行体外发酵，结果显示，延胡索酸二钠提高了乙酸和丙酸的产量。Carro等[8]的研究也显示，延胡索酸二钠提高了饲粮体外发酵乙酸、丙酸和TVFA的产量，降低了乙酸/丙酸。本试验结果表明，延胡索酸二钠能够显著降低未处理和氨化稻草的乙酸/丙酸，显著提高丙酸产量，显著降低乙酸和丁酸产量。与前者结果一致。这说明，延胡索酸二钠是有效的H2受体，能够促进丙酸生成，降低CH4产量[6]。
一般情况下，粗饲料在瘤胃中发酵的乙酸产量显著高于丙酸产量。但粗饲料在瘤胃中发酵的乙酸和丙酸实际产量与粗饲料的结构性碳水化合物(纤维素、半纤维素、木质素、果胶)和非结构性碳水化合物(淀粉、可溶性糖)的含量及其可发酵程度密切相关。本试验结果显示，稻草发酵的乙酸产量仅略高于丙酸产量。这可能是由于稻草是低质粗饲料，其结构性碳水化合物可发酵程度较低。
在生产实践中，使用未处理和氨化稻草饲喂反刍动物时，可通过向饲粮中添加适量的延胡索酸二钠抑制瘤胃中CH4的产生，但仍需要应用动物试验研究确定在不同饲粮条件下延胡索酸二钠的适宜添加水平。
延胡索酸二钠提高了未处理和氨化稻草体外发酵的总产气量，降低了乙酸/丙酸和CH4的相对产量，可用于未处理和氨化稻草瘤胃CH4减排。
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