2. 河南农业科学院畜牧兽医研究所, 郑州 450002
, SUN Quanyou2, LI Jie1, XU Bin2, WEI Fengxian2, WANG Linyi2, BAI Jie2, LU Min2, LI Shaoyu1,2
2. Institute of Animal Science, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China
饲用抗生素为畜牧业的发展做出了巨大的贡献，与此同时也带来了很多问题，抗生素的残留和细菌的耐药性引起了广泛的社会关注，因此，开发新型的绿色、安全、无公害饲料添加剂来替代抗生素是畜牧业发展的必然趋势。抗菌肽和姜黄素都具有提高动物生长性能和动物机体免疫力等方面的作用和功能。姜黄素是从植物根茎中提取的一类多酚类物质，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗微生物等作用。Sa等[1]研究表明，姜黄素对多种疾病都有预防作用。Mrro等[2]报道，姜黄素可以减少心肌肌球蛋白诱导的大鼠自身免疫性心肌炎炎症损伤面积。孙全友等[3]报道，姜黄素在肉鸡生产中与其他一些微生态制剂配合使用比单一使用能取得更好的效果。杜淑环等[4]报道，抗菌肽是生物体经诱导产生的具有抗菌活性的一类小分子多肽，具有抗菌谱广、抗菌活性高、不易产生耐药性、不破坏生物体细胞、无免疫原性等特点。Xiong等[5]研究表明，抗菌肽与抗生素联合使用可以提高抗生素的治疗效果，在很大程度上降低了抗生素的用量。以往的试验研究多集中在添加单一物质的研究上，两者合用的研究还未见报道。本试验拟通过在肉仔鸡饲粮中添加抗菌肽和姜黄素，研究抗菌肽和姜黄素单独或联合使用时对肉仔鸡生长性能、免疫器官指数、外周血淋巴细胞转化率和血清免疫球蛋白含量的影响，探讨抗菌肽和姜黄素之间是否存在协同作用，为其进一步的推广与应用提供理论依据。
试验所用抗菌肽为天蚕素抗菌肽，主要成分为枯草芽孢杆菌(2.5×107 CFU/g)，由林州市中农颖泰林州生物科园有限公司生产；姜黄素为百维素，主要成分为姜黄素，含量为10%，由广州市科虎生物技术研究开发中心生产；抗生素为速大肥，主要成分为维吉尼霉素，含量为50%，由美国辉宝有限公司比利时生产厂生产。
试验选取健康、体重均匀的1日龄爱拔益加(AA)肉仔鸡360只，随机分为5个处理，每个处理6个重复，每个重复12只鸡。各处理初始体重无显著差异(P>0.05)。对照组饲喂基础饲粮，抗生素组、抗菌肽组、姜黄素组和抗菌肽+姜黄素组分别在基础饲粮中添加35 g/t速大肥、200 g/t抗菌肽、200 g/t百维素和200 g/t抗菌肽+200 g/t百维素。饲养试验在河南省农业科学院畜牧兽医研究所肉仔鸡试验基地进行，采用常规笼养，试验期为21 d。肉鸡饲养过程中自由采食和饮水，鸡舍通风良好，光照、温度、湿度和免疫程序按AA肉仔鸡饲养管理操作章程进行。每天观察试验鸡生长健康状况，并记录试验数据。
以玉米-豆粕型饲粮为基础饲粮，参照中华人民共和国农业行业标准肉仔鸡饲养标准(NY/T 33—2004)营养需要配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。
 | 表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % |
试验鸡进鸡舍时，称取其初始体重，在21日龄空腹称量各重复鸡体重和饲料消耗量。称量前1天20:00断料，空腹12 h，第2天08:00称量各重复鸡重量。同时，详细记录各组给料量、剩余料量，记录鸡只死亡数量，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。
在21日龄，每重复随机抽取1只体重相近的鸡，屠宰后分别采摘脾脏、胸腺、法氏囊，并剔除附着的组织用滤纸吸干血水后称鲜重，计算其免疫器官指数。计算公式为：
免疫器官指数(%)=(免疫器官鲜重／宰前空腹活重)×100。于试验期第21天，每个重复选取1只体重相近的鸡，用肝素抗凝管采集新鲜鸡血2 mL。在灭菌10 mL离心管中各加入1∶ 2～1∶ 3体积的鸡淋巴细胞分离液，然后沿管壁缓缓加入全血，水平离心机离心30 min(25 ℃、3 000 r/min)，吸收白色的淋巴细胞层，转入另一无菌离心管，加入RPMI-1640完全培养液2～3 mL，吹散淋巴细胞，洗涤3次，每次离心10 min(25 ℃、3 000 r/min)，弃上清，然后将细胞悬浮于2 mL RPMI-1640完全培养液中，用台盼蓝染色，计数活细胞数(>95%)，调整细胞浓度为1×107个/mL。在96孔细胞培养板上每孔加入190 μL细胞悬液，然后加入刀豆蛋白A(ConA)45 μg/mL或脂多糖(LPS)25 μg/mL，培养体系为200 μL，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养72 h。细胞培养结束前4 h，每孔加入5 mg/mL噻唑蓝(MTT)溶液10 μL，继续培养。培养结束后，每孔加入100 μL 10%十二烷基磺酸钠(SDS)和0.04 mol/L HC1溶液，放入培养箱中继续培养2 h后取出，用酶标仪检测每孔在570 nm的光密度(OD)值。
于试验期第21天，每重复选取1只体重相近的鸡，翅静脉采血，3 000 r/min离心15 min，分装血清，于-20 ℃保存备用。血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)的含量采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定。
试验数据采用Excel 2003和SPSS 13.0软件进行单因子方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法多重比较，试验数据以平均值±标准差表示。P<0.05和P<0.01分别为差异显著和极显著。
由表2可见，在平均日采食量方面，抗生素组、姜黄素组和抗菌肽+姜黄素组均极显著高于对照组(P<0.01)；姜黄素组和抗菌肽+姜黄素组显著高于抗菌肽组(P<0.05)，但与抗生素组无显著差异(P>0.05)；抗生素组和抗菌肽组之间差异不显著(P>0.05)。
| 表2 抗菌肽和姜黄素对1～21日龄肉仔鸡生长性能的影响 Table 2 Effects of antimicrobial peptide and curcumin on growth performance of broilers aged from 1 to 21 days |
在平均日增重方面，抗生素组、抗菌肽组、姜黄素组和抗菌肽+姜黄素组均极显著高于对照组(P<0.01)，4组之间无显著差异(P>0.05)。
在料重比方面，抗菌肽组极显著低于对照组、抗生素组、姜黄素组和抗菌肽+姜黄素组(P<0.01)，4组之间无显著差异(P>0.05)。
由表3可见，脾脏指数方面，抗生素组、抗菌肽组、抗菌肽+姜黄素组均极显著高于对照组和姜黄素组(P<0.01)，抗菌肽组、抗生素组和抗菌肽+姜黄素组之间无显著差异(P>0.05)，对照组和姜黄素组之间无显著差异(P>0.05)。
| 表3 抗菌肽和姜黄素对21日龄肉仔鸡免疫器官指数的影响
Table 3 Effects of antimicrobial peptide and curcumin on immune organ indices of broilers aged 21 days %
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胸腺指数方面，抗菌肽+姜黄素组极显著高于对照组和抗生素组(P<0.01)，显著高于抗菌肽组和姜黄素组(P<0.05)，抗生素组、抗菌肽组、姜黄素组和对照组之间无显著差异(P>0.05)。
法氏囊指数方面，姜黄素组和抗菌肽+姜黄素组均极显著高于对照组(P<0.01)，抗菌肽+姜黄素组显著高于抗生素组和抗菌肽组(P<0.05)，但与姜黄素组无显著差异(P>0.05)，姜黄素组显著高于抗生素组(P<0.05)，抗生素组、抗菌肽组和对照组之间无显著差异(P>0.05)。
由表4可见，B淋巴细胞转化率方面，抗菌肽组、姜黄素组和抗菌肽+姜黄素组均极显著高于对照组和抗生素组(P<0.01)，抗菌肽组和姜黄素组均显著高于抗菌肽+姜黄素组(P<0.05)，抗生素组与对照组之间无显著差异(P>0.05)。
| 表4 抗菌肽和姜黄素对21日龄肉仔鸡淋巴细胞转化率的影响
Table 4 Effects of antimicrobial peptide and curcumin on lymphocyte transformation rates of broilers aged 21 days %
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T淋巴细胞转化率方面，抗生素组、抗菌肽组、姜黄素组和抗菌肽+姜黄素组均极显著高于对照组(P<0.01)，抗菌肽组、姜黄素组、抗菌肽+姜黄素组和抗生素组之间无显著差异(P>0.05)。
由表5可见，抗菌肽+姜黄素组的血清IgG含量极显著高于对照组、抗生素组、抗菌肽组和姜黄素组(P<0.01)，抗生素组、抗菌肽组和姜黄素组的血清IgG含量均极显著高于对照组(P<0.01)，但抗生素组、抗菌肽组和姜黄素组之间的血清IgG含量无显著差异(P>0.05)。
| 表5 抗菌肽和姜黄素对21日龄肉仔鸡血清免疫球蛋白含量的影响
Table 5 Effects of antimicrobial peptide and curcumin on serum immunoglobulin contents of broilers aged 21 days g/L
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抗生素组的血清IgM和IgA含量极显著高于对照组和抗菌肽组(P<0.01)，但与姜黄素组和抗菌肽+姜黄素组之间无显著差异(P>0.05)。抗菌肽组、姜黄素组、抗菌肽+姜黄素组和对照组之间血清IgM和IgA含量无显著差异(P>0.05)，但抗菌肽组、姜黄素组、抗菌肽+姜黄素组血清IgA含量较对照组分别提高了9%、18%和18%，血清IgM含量较对照组分别提高了1%、13%和13%。
本试验中，抗菌肽+姜黄素组与其他试验组相比可以极显著地提高肉仔鸡的平均日采食量和平均日增重，抗菌肽组的料重比极显著低于其余4组。试验结果表明，在饲粮中单独或联合使用抗菌肽和姜黄素都可以提高肉仔鸡的生长性能和饲料利用率。抗菌肽和姜黄素都是具有替代抗生素类药物作用的新一代保健促生长剂，具有广谱的抗菌特性，同时可提高动物健康水平和生长性能，目前已有很多的研究报道。陈香等[8]研究表明，在断奶仔猪饲粮中添加天蚕素抗菌肽显著提高了仔猪的平均日增重，降低了料重比。Wu等[9]报道，在饲粮中添加抗菌肽的断奶仔猪在接种大肠杆菌后，与对照组相比显著提高了平均日增重。刘莉如等[10]研究表明，饲粮中添加350 mg/kg抗菌肽可以显著提高海兰褐蛋用仔公鸡的生长性能。李婉雁等[11]报道，在肉鸡的基础饲粮中添加5.00 g/kg的姜黄粉，能显著提高试验鸡的全期增重并降低料重比，提高生长性能。祝国强等[12]研究表明，在肉鸡饲粮中添加200 mg/kg姜黄素能显著提高肉鸡全期增重，显著降低料重比。本试验在肉仔鸡饲粮中单独添加抗菌肽或姜黄素时，都能提高肉仔鸡的生长性能，其原因可能是抗菌肽具有广谱抗菌和杀菌作用，可以抑制肉仔鸡肠道有害微生物的产生，改善其肠道微生态环境，姜黄素也有较强的抑菌作用，还可以刺激胃分泌黏蛋白，从而保护胃黏膜免于受损，直接或间接地增强了肠道对营养物质的消化吸收功能，从而提高了肉仔鸡的生长性能。本试验中，抗菌肽+姜黄素组极显著提高了肉仔鸡的生长性能，而且效果要优于抗菌肽或姜黄素的单独使用，这可能是因为姜黄素与抗菌肽联合使用具有协同作用，但其作用机理仍有待进一步研究。
脾脏是禽类最大的外周免疫器官，参与机体体液免疫，能分泌特异性抗体，产生大量的淋巴细胞和丰富的B淋巴细胞。胸腺主要参与机体细胞免疫，主要产生T淋巴细胞、单核巨噬细胞和少量B淋巴细胞等其他组织细胞。法氏囊是家禽所特有的中枢免疫器官，是形成血清抗体系统的细胞成长和分化的部位，主导体液免疫。免疫器官的发育和重量的增减情况是由于其自身细胞生长发育和分裂所致，所以免疫器官重量的增加在很大程度上反映了机体免疫功能的增强；免疫器官的重量减少就意味着机体免疫状况的衰退。因此，胸腺、脾脏和法氏囊的生长发育状态在一定程度上反映着整个机体免疫水平的高低[13]。
研究表明，在动物饲粮中添加抗菌肽和姜黄素都提能高动物免疫功能。王秀青等[14]报道，在肉鸡饮水中分别添加4和6 mL/L重组基因工程抗菌肽Cecropin B，与对照组相比，在21、28日龄时可以显著提高鸡的胸腺指数、脾脏指数和法氏囊指数。雷岷等[15]研究表明，在肉兔饲粮中添加抗菌肽可显著提高肉兔脾脏指数和胸腺指数，促进免疫器官发育。胡忠泽等[16]研究表明，在肉鸡饲粮中添加姜黄素可以显著提高肉鸡的胸腺指数和法氏囊指数，表明姜黄素可以促进肉鸡免疫器官的发育，最终提高肉鸡的免疫力。李婉雁等[11]也报道，在肉鸡的基础饲粮中添加5.00 g/kg姜黄粉，可以提高胸腺指数和脾脏指数，促进肉鸡免疫器官的发育和改善免疫力。
本研究结果表明，添加抗菌肽和姜黄素都能够促进肉仔鸡的免疫器官发育，提高肉仔鸡的免疫器官指数，进而增强肉仔鸡的免疫功能。其原因可能是抗菌肽可作用于宿主细胞，刺激动物免疫器官的生长发育，激活机体免疫功能，姜黄素可以显著增加超氧化物歧化酶(SOD)的活性，提高机体清除氧自由基的能力，从而起到保护机体组织和延缓器官衰老的作用，还可能作为抗原刺激机体产生免疫反应，进而提高了肉仔鸡的免疫器官指数。
动物机体的淋巴细胞增殖反应是衡量细胞免疫能力的一项重要指标，也是研究肉鸡的免疫功能及防御疫病机制一个重要方面。T淋巴细胞、B淋巴细胞是机体主要的淋巴细胞，在机体免疫应答发生发展的过程中主要参与细胞免疫应答与体液免疫应答。在丝裂原ConA或LPS的刺激下，淋巴细胞的代谢和形态发生一系列变化，进一步转化为淋巴母细胞进行分裂增殖，因此淋巴细胞的增殖程度已经成为检测机体免疫功能的有效指标。其中ConA是T淋巴细胞增殖的刺激原，T淋巴细胞在胸腺内分化成熟，然后向血液及外周免疫器官(脾脏)迁移，经抗原刺激而增殖，主要介导机体细胞免疫[17, 18]。LPS为B淋巴细胞增殖的刺激原，B淋巴细胞是机体唯一产生抗体免疫球蛋白的免疫活性细胞，在法氏囊中分化成熟后迁移到外周免疫器官中定居、繁衍，转化为浆细胞，从而产生抗体，主要介导机体体液免疫。
抗菌肽能提高机体的先天性微生物防御反应的生物活性，姜黄素的免疫调节作用机制可能与抑制免疫细胞核转录因子κB(NF-κB)的活化有关。Scott等[19]报道，抗菌肽在宿主免疫反应不同阶段表现出多种作用，能促进辅助性T淋巴细胞趋化因子的产生及辅助性T淋巴细胞的增殖；张洪波[20]研究表明，抗菌肽可以通过对靶细胞的凋亡、基因转录及巨噬细胞、树突状细胞和其他抗原递呈细胞趋化性的调节作用，调节宿主细胞因子的产生和B淋巴细胞及T淋巴细胞的抗原特异性免疫应答而作用于先天及获得性免疫。胡忠泽等[16]报道，饲粮中添加250、500 mg/kg姜黄素都显著提高了肉鸡T淋巴细胞转化率，表明姜黄素具有增强机体的细胞免疫功能。李新建等[17]研究表明，姜黄素在0~6.25 μmol/L范围可促进ConA和LPS诱导的小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖。本研究结果表明，饲粮中添加抗菌肽和姜黄素都能够提高肉仔鸡外周血B淋巴细胞和T淋巴细胞转化率，这说明抗菌肽和姜黄素有提高肉仔鸡机体细胞免疫功能，增强机体特异性免疫应答。
免疫球蛋白是具有抗体活性以及与抗体相关的一类球蛋白，是体液免疫应答中最主要的免疫效应分子。家禽体内的免疫球蛋白主要是IgA、IgG和IgM。IgA存在于血清、胆汁和其他分泌液中。IgG是以单体形式存在，是血清中含量最多的免疫球蛋白，占血清免疫球蛋白总量的75％～80％，是主动免疫后机体所产生的主要抗体，在体液免疫中最为重要。IgM以五聚体形式存在，是血清中分子质量最大的免疫球蛋白，在机体初期免疫防护中占有重要地位[21]。血清免疫球蛋白含量的变化是反映动物免疫功能的重要标志。在本试验中，肉仔鸡饲粮中单独添加抗菌肽或姜黄素时，都能提高肉仔鸡血清免疫球蛋白含量，其原因可能是免疫球蛋白是由淋巴细胞分泌产生的，免疫球蛋白的产生也是一个蛋白质合成的过程，需要多种氨基酸参与，抗菌肽是一种小肽，可以分解成多种氨基酸，因而可能有利于提供更平衡的氨基酸水平，促进免疫球蛋白的合成，姜黄素的免疫调节作用可以减缓组织和细胞的衰退，促进了免疫球蛋白的产生，从而提高机体的免疫功能。
饲粮中添加抗菌肽和姜黄素可以显著提高肉仔鸡的生长性能和免疫功能，联合添加比单独添加效果更好，说明天蚕素抗菌肽和姜黄素之间存在一定的协同作用。
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