肝脏是蛋鸡体内脂质代谢的核心器官，体内脂肪合成的主要场所。在蛋鸡产蛋期，1/2以上的脂肪被运送到卵巢中用于形成蛋黄，在卵巢雌激素刺激下，肝脏内脂肪合成更加旺盛，其脂肪的合成量几乎等同于自身重量^[1]。尤其是高产蛋鸡，几乎每天要产1枚蛋，肝脏代谢负担沉重，极易发生代谢性氧化损伤，导致各种肝脏代谢性综合征的发生，其中以脂肪肝出血综合征(FLHS)最为人们所关注。FLHS是产蛋鸡常见的一种营养代谢性疾病，其主要原因是脂肪在肝细胞内过量沉积，从而影响肝脏的正常功能，严重的甚至引起肝细胞破裂，最终导致肝内出血而死亡。随着蛋鸡养殖业向集约化、规模化发展，该病的发生呈逐年升高的趋势。蛋鸡发病初期一般体况良好，鸡群中不易发现，一旦患病，需要长期治疗和调控，较难出现产蛋高峰，给蛋鸡养殖业带来较大的经济损失。

吡咯喹啉醌(PQQ)是20世纪70年代发现的一种新型类维生素，几乎存在于所有的生物组织中，在动植物体内发挥重要生理作用。作为电子传递体，PQQ是继黄素核苷酸和烟酰胺核苷酸之后发现的氧化还原酶新辅酶；作为重要营养素，饲粮中添加PQQ可促进动物生长发育，提高动物繁殖能力，改善体内脂质代谢^[4]；作为抗氧化剂，PQQ被认为是活性氧(ROS)清除剂，有很强的自由基清除能力，能提高机体抗氧化能力，减少氧化损伤。此前大量研究表明，PQQ对四氯化碳、乙醇等引起的肝损伤具有很好的保护作用^[5]。本实验室前期研究结果表明，PQQ能显著提高蛋鸡体内的抗氧化能力^[6]。而蛋鸡体内脂质代谢紊乱和自由基水平升高引起的氧化损伤在FLHS的形成中发挥重要作用^{[2, 3]}。鉴于其调节脂质代谢和抗氧化能力对肝脏功能的重要意义，PQQ可能对蛋鸡肝脏健康和预防脂肪肝具有积极作用。本试验通过研究不同添加水平PQQ对人工诱导(饲喂高能低蛋白质饲粮)FLHS蛋鸡的生产性能、蛋品质、血浆脂质代谢、抗氧化能力及肝脂率的影响，确定PQQ调控蛋鸡脂肪肝疾病的功效，探讨PQQ在预防蛋鸡脂肪肝发生过程中的作用，为通过营养调控途径防治蛋鸡FLHS提供理论依据和参考。 1 材料与方法 1.1 试验材料

PQQ由微生物发酵制成，纯度>99.9%，由上海医学生命科学研究中心有限公司提供。

选择产蛋率、体重相近的29周龄海兰褐蛋鸡288只，随机分成4个组，每组6个重复，每个重复12只鸡。Ⅰ组为对照组，饲喂玉米-豆粕型基础饲粮；Ⅱ组为病理模型组，饲喂高能低蛋白质饲粮；Ⅲ和Ⅳ组为PQQ预防组，分别在Ⅱ组基础上添加0.08和0.16 mg/kg的PQQ。预试期1周，正试期4周。

参照NRC(1994)和我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)，结合海兰褐蛋鸡饲养手册配制玉米-豆粕型粉状基础饲粮；高能低蛋白质饲粮除代谢能、粗蛋白质含量不参照上述标准外，其他均依此配制而成。饲粮组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) % 项目 Items 基础饲粮 Basal diet 高能低蛋白质饲粮 High-energy low-protein diet 原料 Ingredients 玉米 Corn 62.92 64.37 豆粕 Soybean meal 26.23 18.50 石粉 Limestone 8.89 9.00 鸡油 Chicken fat 6.00 预混料 Premix1) 1.96 2.13 合计 Total 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 代谢能 ME/(MJ/kg) 11.03 12.75 粗蛋白质 CP 16.20 13.00 钙 Ca 3.44 3.50 总磷 TP 0.54 0.50 有效磷 AP 0.36 0.34 赖氨酸 Lys 0.788 0.735 蛋氨酸 Met 0.360 0.352 1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets: VA 8 000 IU，VD 2 200 IU，VE 30 IU，VK 2 mg，硫胺素 thiamine 1 mg，核黄素 riboflavin 5.5 mg，泛酸钙 calcium pantothenate 13 mg，烟酸 niacin 36 mg，吡哆醇 pyridoxine 8 mg，生物素 biotin 0.5 mg，叶酸 folic acid 0.5 mg，VB12 0.02 mg，Mn 65 mg，I 1 mg，Fe 60 mg，Cu 8 mg，Zn 66 mg，Se 0.3 mg，CaH3PO4 130 g，NaCl 30 g。 2)营养水平为计算值。Nutrient levels were calculated values.

表1 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) %

采用半开放式鸡舍3层立体笼养，人工补光加自然光照，光照强度20 lx，光照时间16 h/d；相对湿度50%～90%，自然通风与横向负压通风结合。每天布料2次，匀料4次，自由采食和饮水。每日捡蛋2次，清粪2次，每周消毒1次。常规免疫和管理。

在试验期，每天以重复为单位记录产蛋数和蛋重，计算平均蛋重和产蛋率，每2周以重复为单位计算平均日采食量(ADFI)和料蛋比。分别于试验的第2和4周末，每个重复采10枚蛋，测定蛋品质。试验结束时，每重复随机选取体重相近的蛋鸡，屠宰，翅静脉采血，3 000 r/min离心10 min，制备血浆，-30 ℃冻存；取5 g肝组织，锡箔纸包装，液氮速冻，-80 ℃保存。

采用蛋壳强度分析仪(Orka Technology Ltd.)测定蛋壳强度；SONOVA蛋品质自动分析仪(Orka Technology Ltd.)测定蛋白高度、哈氏单位和蛋黄颜色；蛋壳厚度测定仪(Orka Technology Ltd.)测定蛋壳厚度；蛋形指数测定仪(Fujihira Industry Co.,Ltd.)测定蛋形指数。

参照Folch等^[7]的方法，稍作修改。常温解冻-80 ℃保存的肝样，称取2 g，剪碎，LGJ-12冷冻干燥机冻干，称重。用20倍体积的氯仿-甲醇(2∶ 1，V/V)匀浆，清洗匀浆机管，洗液倒入匀浆液中。向匀浆液中加入0.2倍体积的0.37%氯化钾溶液，混匀，静置，待液体分层，过滤分开2层溶液，上层液体用氯仿-甲醇-水(3∶ 48∶ 47，V/V)溶液洗2次。取上层液体氮气吹干，称重。计算公式如下：

采用甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶-4-氨基氨替比林争酚法(GPO-PAP法)测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量；采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，试剂盒购自北京北化康泰临床试剂有限公司；采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定丙二醛(MDA)含量，采用比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

所有数据经Excel 2003处理，采用SPSS 16.0的one-way ANONA程序统计分析，Duncan氏法多重比较，用LSD法进行不同组间两两比较，P<0.05为差异显著。

由表2可知，各组之间的产蛋率和平均蛋重在各试验期差异均不显著(P>0.05)。PQQ对ADFI影响显著(P<0.05)，对试验1～2周料蛋比也有影响显著(P<0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 PQQ对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of PQQ on performance of laying hens 项目 Items 时间 Time/Week 组别 Groups SEM P值 P-value Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 产蛋率 1～2 93.33 92.69 93.27 93.97 0.60 0.91 Laying rate/% 1～4 91.02 91.04 91.36 92.71 0.58 0.71 平均蛋重 1～2 60.87 60.92 60.31 61.27 0.27 0.68 Average egg weight/g 1～4 58.87 59.33 58.41 59.22 0.25 0.59 平均日采食量 1～2 117.54b 135.71a 119.51b 126.38b 2.15 <0.01 Average daily feed intake/g 1～4 117.72b 132.67a 118.20b 122.38b 1.99 0.03 料蛋比 1～2 2.10b 2.39a 2.13b 2.21b 0.03 <0.01 Feed/egg 1～4 2.20b 2.43a 2.35ab 2.37ab 0.04 0.17 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。 In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表2 PQQ对蛋鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of PQQ on performance of laying hens

试验1～2周，与对照组相比，Ⅱ组ADFI提高了15.46%(P<0.05)，料蛋比提高了13.81%(P<0.05)；与Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅳ组的ADFI分别降低了11.94%和6.87%(P<0.05)，料蛋比分别降低了10.88%和7.53%(P<0.05)；Ⅲ、Ⅳ组间的ADFI和料蛋比差异不显著(P>0.05)。

试验1～4周，Ⅱ组的ADFI和料蛋比显著高于对照组(P<0.05)，对照组与Ⅲ、Ⅳ组之间差异不显著(P>0.05)。

由此可见，饲粮添加PQQ可降低高能低蛋白质饲粮引起的蛋鸡ADFI和料蛋比的升高。

由表3可知，PQQ对蛋壳强度、蛋壳厚度和蛋形指数无显著影响(P>0.05)，但对蛋白高度、哈氏单位、蛋黄颜色有影响显著(P<0.05)。

表3(Table 3)

表3 PQQ对蛋鸡蛋品质影响 Table 3 Effects of PQQ on egg quality of laying hens 项目 Items 时间 Time/Week 组别 Groups SEM P值 P-value Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 蛋壳强度 2 43.63 43.02 46.80 43.31 0.70 0.16 Eggshell strength/(N/m2) 4 43.76 43.65 44.97 40.42 0.77 0.19 蛋壳厚度 2 0.41 0.42 0.42 0.42 0.004 0.45 Eggshell thickness/mm 4 0.43 0.43 0.44 0.44 0.002 0.77 蛋形指数 2 1.31 1.30 1.31 1.31 0.004 0.90 Egg shape index 4 1.30 1.30 1.31 1.30 0.005 0.86 蛋白高度 2 6.55a 5.89b 6.58a 6.79a 0.12 <0.01 Albument height/mm 4 6.65a 5.64b 6.57a 6.51a 0.11 <0.01 蛋黄颜色 2 6.46a 6.00b 6.44a 6.88a 0.13 0.03 Yolk color 4 6.36a 5.57b 5.78ab 5.89ab 0.12 0.02 哈氏单位 2 77.01a 70.95b 79.15a 80.44a 0.97 <0.01 Haugh unit 4 78.96a 72.44b 79.38a 78.26a 0.74 <0.01

表3 PQQ对蛋鸡蛋品质影响 Table 3 Effects of PQQ on egg quality of laying hens

试验第2和4周时，与Ⅰ组相比，Ⅱ组蛋白高度显著降低(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ组与Ⅰ组差异不显著(P>0.05)。试验第2周时，与Ⅰ组相比，Ⅱ组蛋黄颜色虽略降低但无显著差异(P>0.05)，Ⅲ、Ⅳ组与Ⅰ组差异不显著(P>0.05)；试验第4周时，Ⅱ组蛋黄颜色与Ⅰ组相比显著降低了12.42%(P<0.05)，与Ⅲ、Ⅳ组相比差异不显著(P>0.05)，Ⅰ组与Ⅲ、Ⅳ组之间无显著差异(P>0.05)。对于哈氏单位，试验第2和4周时，Ⅱ组与其他3组相比显著降低(P<0.05)，Ⅰ组与Ⅲ、Ⅳ组之间无显著差异(P>0.05)。

由此可见，饲粮添加PQQ可提高高能低蛋白质饲粮引起的蛋白高度、哈氏单位和蛋黄颜色的降低，达到与对照组相当的水平。 2.3 PQQ对蛋鸡肝脂率、血浆脂质代谢和抗氧化能力的影响

由表4可知，与Ⅰ组相比，Ⅱ组肝脂率显著提高了88.19%(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ组肝脂率与Ⅰ组相比没有显著差异(P>0.05)。因此，高能低蛋白质饲粮引起的肝脏脂肪含量升高在添加PQQ后得到明显改善。

与Ⅰ组相比，Ⅱ组血浆TG和TC含量显著提高了37.08%和30.03%(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ组血浆TG、TC含量与Ⅰ组相比差异不显著(P>0.05)；与Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅳ组血浆TG和TC含量显著降低(P<0.05)，Ⅲ、Ⅳ组之间血浆TG、TC含量差异不显著(P>0.05)。

血浆HDL-C含量各组之间未见显著差异(P>0.05)；Ⅱ组血浆LDL-C含量和LDH活性较其他各组显著升高(P<0.05)，其他各组之间差异不显著(P>0.05)。

与Ⅰ组相比，Ⅱ组血浆MDA含量显著提高了42.03%(P<0.05)，血浆SOD活性显著降低了17.13%(P<0.05)，Ⅲ组血浆MDA含量没有显著差异(P>0.05)，而Ⅳ组血浆MDA含量显著提高了36.88%(P<0.05)。与Ⅱ组相比，Ⅲ、Ⅳ组血浆SOD活性显著提高(P<0.05)；Ⅲ、Ⅳ组之间血浆SOD活性没有显著差异(P<0.05)，Ⅲ组血浆MDA含量较Ⅳ组显著提高了15.13%(P<0.05)。

由此可见，高能低蛋白质饲粮引起的肝脂率升高，血浆TG、TC、LDL-C、MDA含量和LDH活性的升高及SOD活性降低，在添加PQQ后得到改善，PQQ添加量为0.08和0.16 mg/kg时没有明显差异。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 PQQ对蛋鸡肝脂率、血浆脂质代谢和抗氧化能力的影响 Table 4 Effects of PQQ on liver fat rate, plasma lipid metabolism and antioxidant ability of laying hens 项目 Items 组别 Groups SEM P值 P-value Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 肝脂率 Liver fat rate/% 15.58b 29.32a 15.25b 16.55b 1.49 <0.01 甘油三酯 TG/(mmol/L) 11.22b 15.38a 8.25b 10.63b 0.78 <0.01 总胆固醇 TC/(mmol/L) 3.03b 3.94a 2.77b 3.19b 0.13 <0.01 高密度脂蛋白胆固醇 HDL-C/(mmol/L) 1.57 1.54 1.55 1.58 0.03 0.97 低密度脂蛋白胆固醇 LDL-C/(mmol/L) 1.72b 2.68a 1.40b 1.61b 0.13 <0.01 乳酸脱氢酶 LDH/(U/mL) 4 035.35b 5 125.99a 3 635.95b 3 456.19b 173.16 <0.01 丙二醛 MDA/(nmol/mL) 6.40b 9.09a 6.74b 8.76a 0.37 <0.01 超氧化物歧化酶 SOD/(U/mL) 274.49a 234.35b 274.33a 269.56a 6.21 0.04

表4 PQQ对蛋鸡肝脂率、血浆脂质代谢和抗氧化能力的影响 Table 4 Effects of PQQ on liver fat rate, plasma lipid metabolism and antioxidant ability of laying hens

蛋鸡采食高能低蛋白质饲粮后，肝脂含量逐渐增加；而脂蛋白合成减少，破坏了肝脏、血液和脂肪细胞之间脂质代谢的动态平衡，导致大量脂肪以甘油三酯的形式在肝内蓄积。此外，蛋鸡处于产蛋高峰期时，肝脏超负荷代谢，使其损伤加重。代谢能12.81 MJ/kg、粗蛋白质12.90%的饲粮即可复制蛋鸡FLHS模型^[2]，可用鸡油提高饲粮能量诱发FLHS^[1]。本试验通过添加6%鸡油配制高能低蛋白质饲粮(代谢能12.75 MJ/kg，粗蛋白质13.00%)，试验组蛋鸡肝脂率比对照组高出88.19%，与Yousefi等^[8]和曹华斌等^[9]的研究结果一致。

本试验表明，高能低蛋白质饲粮饲喂4周，蛋鸡ADFI显著升高，料蛋比在试验1～2周和1～4周均显著升高；产蛋率、平均蛋重未见明显下降；PQQ添加组ADFI和料蛋比显著降低。研究表明，用代谢能12.55 MJ/kg、粗蛋白质14.95%的饲粮饲喂94周龄海兰W-36蛋鸡12周并未引起产蛋率的改变，且ADFI和平均蛋重在前8周也未见变化^[8]；用代谢能12.87 MJ/kg、粗蛋白质13.10%的饲粮饲喂180日龄伊莎蛋鸡42 d，即可显著降低产蛋率^[10]。本试验未影响产蛋性能，由于高能低蛋白质饲粮中添加的是鸡油，蛋鸡采食鸡油后，直接沉积到肝脏中，对肝脏损伤程度较小；也可能与试验蛋鸡刚进入产蛋高峰期、体况较好有关；还可能与蛋鸡维持繁殖机能(产蛋)的本能有关。此外，高能低蛋白质饲粮饲喂周期较短，可能延长试验周期将会观测到产蛋率的变化，对此有待于进一步研究。高能低蛋白质饲粮组蛋鸡ADFI显著升高，可能与脂肪肝蛋鸡肝脏脂质代谢能力受损，短期内维持产蛋率和鸡蛋中脂蛋白的沉积需要摄入更多的饲粮有关。而PQQ添加组ADFI较对照组略有增加但无显著差异，可能与PQQ可提高机体对蛋白质的利用效率有关。研究表明，PQQ能促进啮齿动物主要在线粒体内代谢的氨基酸(如丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸等)的合成，提高机体内的蛋白质水平^[11]。PQQ在蛋鸡体内代谢也可能存在类似情形，这可在一定程度上弥补饲粮蛋白质相对不足的影响。此外，本试验表明，PQQ可逆转高能低蛋白质饲粮导致的鸡蛋蛋白高度、蛋黄颜色和哈氏单位降低情况，改善鸡蛋品质，这也间接表明PQQ可促进鸡体内蛋白质代谢。基于Steinberg等^{[12, 13]}在小鼠试验中观察到生长和繁殖性能改善的结果，结合本试验PQQ可正面调节蛋鸡蛋品质的结果，可以推测PQQ对动物的繁殖性能具有裨益。

脂肪肝会造成蛋鸡肝脏脂肪代谢紊乱，体内脂质代谢指标的升高会影响肝功能^{[2, 8]}，以TG含量升高为主要特征。本试验中高能低蛋白质饲粮组蛋鸡血浆TG、TC、LDL-C含量显著升高，与前人报道^[14]一致。LDH是存在于细胞质中的糖酵解酶，肝脏代谢严重异常时，其活性显著升高^[15]，本试验中高能低蛋白质饲粮引起蛋鸡血浆LDH活性显著升高，补充PQQ后，血浆LDH活性降至正常水平，表明饲粮PQQ能保护肝脏细胞免受损伤。体内脂质代谢主要有2种途径：1)增加线粒体内脂肪酸β-氧化；2)增加体内脂蛋白合成，促进肝细胞内TG转运。PQQ能提高与脂质代谢相关的重要基因如脂肪酸结合蛋白(FABP)、过氧化物酶体增殖激活物受体-γ(PPAR-γ)等的表达，促进肝细胞内脂肪酸β-氧化，改善体内脂质代谢，减少肝内脂质堆积，降低肝细胞功能损伤^{[5, 16]}，改善肝脏内脂质代谢异常。本试验结果与PQQ能改善小鼠体内脂质和能量代谢水平，减少血浆TG、TC和游离脂肪酸含量的结果^[5]相同。

SOD是生物体内重要的抗氧化酶，在活性氧清除系统中第一个发挥作用。MDA是检测脂质过氧化程度的主要指标，间接反映细胞内损伤程度。本试验中高能低蛋白质饲粮引起蛋鸡体内血浆SOD活性降低和MDA含量升高，与机体内抗氧化能力降低在蛋鸡FLHS形成机制中起重要作用的报道^[3]一致。本研究表明，PQQ可显著抑制高能低蛋白质饲粮引起的血浆SOD活性降低和MDA含量升高，与本实验室前期的研究结果(PQQ可显著提高蛋鸡抗氧化能力)^[6]一致。PQQ可能通过其还原形式(PQQH2)与细胞内的超氧化物直接反应清除自由基，或通过调控体内抗氧化酶活性和基因表达实现其抗氧化作用。PQQH2清除超氧阴离子和羟自由基的能力比抗坏血酸高50～100倍^[17]。此外，本实验室前期研究表明，PQQ能通过刺激过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子-1α(PGC-1α)和呼吸因子-2(NRF-2)信号通路增加蛋鸡体内抗氧化酶活性，从而减少氧化损伤^[18]。

① 饲粮添加0.08和0.16 mg/kg PQQ可显著缓解高能低蛋白质饲粮引起的蛋鸡采食量和料蛋比的升高，改善蛋品质，提高蛋鸡生产性能。

② 饲粮添加0.08和0.16 mg/kg PQQ可显著降低蛋鸡肝脏内脂肪沉积，改善肝脏内脂质代谢，提高机体抗氧化能力。