黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是从天然中草药黄芪中提取的一种多糖，具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤作用，且安全无毒，无耐药性。APS作为一种免疫促进剂或免疫调节剂在人医临床已广泛应用，作为饲料添加剂能改善动物生长性能^{[ 1,2 ]}，增强机体免疫功能^{[ 3,4 ]}，被认为是一种新型的饲料添加剂。已有研究表明，APS能够提高机体免疫细胞因子白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌^{[ 5,6,7 ]}，进而提高机体的免疫功能。一氧化氮(NO)是由诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)催化L-精氨酸生成，它可调节多种免疫活性介质的合成，进而影响机体的免疫功能。巨噬细胞中可表达iNOS，产生大量的NO、细胞因子及细菌毒素。体外法研究表明，细胞培养液中添加APS能显著促进小白鼠腹腔巨噬细胞NO产生，显著增加仔猪外周血淋巴细胞NO产生，增强iNOS活性^{[ 8,9,10 ]}，从而促进免疫功能。有限的体内试验研究也表明，饲粮中添加APS可提高大鼠血清中NO含量^{[ 11 ]}，显著促进小鼠巨噬细胞iNOS mRNA的表达和NO的产生^{[ 12 ]}。但目前关于APS对肉仔鸡免疫功能影响的研究尤其是分子机制的研究鲜见报道。因此，本试验旨在通过研究饲粮APS添加量对肉仔鸡血清IL-1、IL-2、TNF-α、NO含量和iNOS活性及小肠iNOS mRNA表达的影响，探讨APS对肉仔鸡免疫功能的影响机制，为开发绿色、无毒的APS饲料添加剂提供理论依据。

试验采用单因子完全随机试验设计，选择1日龄健康艾维茵肉仔鸡300只，随机分为5组，每组6个重复，每个重复10只鸡，公母各占1/2。对照组饲喂基础饲粮，不添加APS；试验组分别在基础饲粮中添加0.1%、0.5%、1.0%和2.0%的APS，试验期42 d。各组鸡初始体重经方差检验差异不显著(P>0.05)。APS购自陕西中鑫生物技术有限公司，为黄色精细粉末，多糖含量50%。基础饲粮以玉米和豆粕为主要原料，按照肉仔鸡生长发育阶段配制，分1～21日龄和22～42日龄2阶段进行，基础饲粮组成及营养水平见表1。所有试验饲粮均以粉料形式饲喂。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) % 项目 Items 1～21日龄 1 to 21 days of age 22～42日龄 22 to 42 days of age 原料 Ingredients 玉米 Corn 52.69 58.98 豆粕 Soybean meal 40.00 33.80 豆油 Soybean oil 3.00 3.00 石粉 Limestone 1.10 1.80 磷酸氢钙 CaHPO4 1.90 1.25 食盐 NaCl 0.37 0.37 蛋氨酸 Met 0.19 0.07 赖氨酸 Lys 0.05 0.03 预混料 Premix1) 0.70 0.70 合计 Total 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 代谢能 ME/(MJ/kg) 12.71 12.78 粗蛋白质 CP 21.37 18.99 钙 Ca 1.08 1.03 总磷 TP 0.62 0.55 赖氨酸 Lys 1.25 1.10 蛋氨酸 Met 0.54 0.39 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diets: Fe (as ferrous sulfate) 80 mg，Zn (as zinc sulfate) 80 mg，Mn (as manganese sulfate) 80 mg，Cu (as copper sulfate) 8 mg，I (as calcium iodate) 0.35 mg，Se (as sodium selenite) 0.15 mg，VA 3 000 IU，VD 1 250 IU，VE 15 IU，VK 2.2 mg，VB1 1.5 mg，VB2 8.0 mg，VB6 2.5 mg，VB12 0.011 mg，烟酸 niacin 44 mg，泛酸 pantothenic acid 11 mg，叶酸 folic acid 0.9 mg，生物素 biotin 0.11 mg，胆碱 choline 550 mg。 2)代谢能为计算值，其余为实测值。ME was a calculated value,while the others were measured values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

试验鸡采用单层笼养，鸡笼采用红外线加热装置自动控温，试验期内保持23 h/d恒定光照，机械通风，试验第1～3天内舍温保持在33 ℃，之后每周降低3 ℃，鸡舍温度达到24 ℃后保持恒定不变。自由采食，自由饮水，按常规免疫程序进行免疫，其余同肉仔鸡常规饲养管理。

于15、28、42日龄，对各组鸡进行称重、结料，计算平均日增重和料重比；分别于28、42日龄08:00从每重复中随机抽取1只鸡，每组6只鸡(公母各占1/2)，翅静脉采血10 mL于普通采血管中，在4 ℃下3 000 r/min离心10 min制备血清，-20 ℃冷冻保存，用于血清IL-1、IL-2、TNF-α、NO含量及iNOS活性的测定；然后宰杀，于冰浴上迅速剪取十二指肠、空肠、回肠组织，用生理盐水冲洗干净，分装于1.5 mL Eppendorf管中，迅速放入液氮中，冷冻后转入-80 ℃低温冰箱冻存用于总RNA的提取。

生长性能指标包括平均体重、平均日增重和料重比。

血清IL-1、IL-2和TNF-α含量采用放射免疫分析法测定，测定仪器为γ-911全自动放射免疫计数仪(中国科技大学实业总公司)，试剂盒由北京华英生物技术研究所提供。

血清NO含量和iNOS活性采用分光光度法测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。

肉仔鸡小肠总RNA按提取试剂盒说明进行提取。取1 μL总RNA溶液，用无RNase水稀释100倍后，在多功能酶标仪上测定总RNA浓度，进行RNA纯度检测。取3 μL总RNA溶液与2 μL 6×Loading Buffer混合，以DNA Marker DL2000作为标准品对照，于2.0% 琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件：电压为100 V，时间为10 min，结束后利用凝胶成像分析系统检测RNA完整性。按照试剂盒要求，将RNA反转录合成cDNA，低温保存。

根据GenBank中鸡iNOS和β-肌动蛋白(β-actin)基因序列，为防止基因组DNA污染，以跨内含子为基本原则，分别利用DNAStar、Primer 5.0和Oligo 6.0软件，综合设计PCR引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成，引物序列iNOS，登录号：U46504；上游引物：5′-AGGCCAAACATCCTGGAGGTC-3′，下游引物：5′-TCATAGAGACGCTGCTGCCAG-3′；产物大小：371 bp。β-actin，登录号：NM_205518；上游引物：5′-GCCAACAGAGAGAAGATGACAC-3′，下游引物：5′-GTAACACCATCACCAGAGTCCA-3′；产物大小：118 bp。

采用FastFire qPCR PreMix试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增的检测。PCR反应体系为20 μL，其中2×FastFire qPCR PreMix为10 μL，PCR上游引物(10 μmol/L)为0.6 μL，PCR下游引物(10 μmol/L)为0.6 μL，模板(cDNA溶液)为2 μL，dH₂O为6.8 μL。

在同一反应程序下进行目的基因(iNOS)和内标基因(β-actin)的实时荧光定量PCR。根据目的基因和内标基因上、下游引物给定的解链温度优化退火温度，利用四步法程序消除非特异性产物及引物二聚体对实时荧光定量PCR的影响^{[ 13 ]}，采用二次读板法测定荧光值。反应程序：95.0 ℃预变性1 min，95.0 ℃变性5 s，62.0 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸6 s，72.0 ℃读板，82.0 ℃二次读板，进行45个循环反应。PCR程序结束后，系统自动绘制熔解曲线，从70.0 ℃逐渐升高到95.0 ℃，监测系统每0.5 ℃读取荧光值1次，自动生成熔解曲线。反应结束后，PCR产物于-20 ℃保存备用。取5 μL PCR产物于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，以DNA Marker DL2000为标准品对照，电泳条件：电压为100 V，时间为20 min，结束后在凝胶成像系统中检测PCR产物分子质量。PCR产物经单一熔解曲线峰进行确定，并送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列分析。

试验采用SYBR Green Ⅰ荧光染料法进行实时荧光定量PCR扩增的检测，iNOS mRNA在组织中的表达量用2^-△Ct方法进行计算。

试验数据利用Excel 2003以及SAS 9.0软件的回归分析程序进行统计，对不同APS的处理效应进行一次线性和二次曲线回归分析，P<0.05表示回归关系显著，0.05≤P≤0.10表示回归关系趋于显著。

由表2可知，整个试验期间，各APS添加组肉仔鸡的平均体重和平均日增重均高于对照组，料重比均低于对照组(除29～42日龄的0.1%和2.0%APS组外)，其中以1.0%APS组效果最佳，但当APS的添加量增加到2.0%时，肉仔鸡的平均体重和平均日增重呈降低趋势，料重比呈升高趋势。线性回归分析结果表明，在29～42日龄时，随着APS添加量的增加，肉仔鸡平均日增重呈一定的二次曲线增加趋势(P＝0.100)；1～14日龄和15～28日龄期间，随着APS添加量的增加，肉仔鸡平均料重比呈一定的一次线性剂量依赖关系(P＝0.092；P=0.106)，而平均体重与APS添加量没有显著的剂量依赖关系(P＞0.05)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 APS对肉仔鸡生长性能的影响 Table 2 Effects of APS on growth performance of broilers 项目 Items 日龄 Day of age APS添加量 APS supplemental level SEM P值 P-value 0 0.1% 0.5% 1.0% 2.0% 一次 Linear 二次 Quadratic 平均体重 Average body weight/g 14 452.20 465.91 477.12 497.54 462.02 9.56 0.272 0.127 28 1 259.52 1 281.15 1 337.86 1 372.24 1 305.27 50.82 0.273 0.221 42 2 219.13 2 246.18 2 340.65 2 439.55 2 293.08 98.74 0.401 0.203 平均日增重 ADG/(g/d) 1~14 29.12 30.10 30.90 32.36 29.82 0.582 0.128 0.235 15~28 57.68 58.23 61.48 62.48 60.23 2.150 0.250 0.301 29~42 68.54 68.93 71.63 76.24 70.56 4.251 0.212 0.100 料重比 F/G 1~14 1.35 1.33 1.30 1.26 1.29 0.018 0.092 0.202 15~28 1.91 1.90 1.82 1.80 1.83 0.052 0.106 0.216 29~42 2.14 2.14 2.13 2.07 2.15 0.120 0.593 0.254

表2 APS对肉仔鸡生长性能的影响 Table 2 Effects of APS on growth performance of broilers

由表3可知，各APS添加组的肉仔鸡血清IL-1、IL-2和TNF-α含量相对于对照组均有不同程度的升高(除2.0%组TNF-α含量外)，APS对血清细胞因子含量的影响呈剂量依赖关系。随APS添加量的增加，42日龄血清IL-1和TNF-α含量呈显著二次曲线增加(P=0.045，P=0.038)，28日龄血清IL-2含量呈现的二次曲线增加趋势趋于显著(P=0.056)。从总体上看，血清IL-1、IL-2和TNF-α含量以0.5%和1.0%APS组较高；其中IL-1含量以1.0%APS组最高，TNF-α含量以0.5%APS组最高。当APS添加量提高到2.0%时，各试验阶段肉仔鸡血清IL-1、IL-2和TNF-α含量均有不同程度的降低。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 APS对肉仔鸡血清IL-1、IL-2和TNF-α含量的影响 Table 3 Effects of APS on the contents of IL-1,IL-2 and TNF-α in serum of broilers ng/mL 项目 Items 日龄 Day of age APS添加量 APS supplemental level SEM P值 P-value 0 0.1% 0.5% 1.0% 2.0% 一次 Linear 二次 Quadratic 白细胞介素-1 IL-1 28 0.152 0.168 0.182 0.190 0.161 0.018 0.274 0.382 42 0.141 0.157 0.193 0.215 0.146 0.016 0.182 0.045 白细胞介素-2 IL-2 28 6.58 7.26 8.45 8.98 7.06 0.733 0.287 0.056 42 6.82 7.94 8.66 8.18 7.42 0.525 0.324 0.152 肿瘤坏死因子-α TNF-α 28 0.877 0.924 1.162 1.025 0.838 0.023 0.512 0.102 42 0.790 0.944 1.286 0.978 0.713 0.012 0.351 0.038

表3 APS对肉仔鸡血清IL-1、IL-2和TNF-α含量的影响 Table 3 Effects of APS on the contents of IL-1,IL-2 and TNF-α in serum of broilers ng/mL

由表4可知，在整个试验期，各APS添加组肉仔鸡的血清NO含量和iNOS活性均高于对照组(除42日龄时2.0%APS组的NO含量外)，其中以1.0%APS组最高；当APS添加量提高到2.0%时，血清NO含量和iNOS活性均有不同程度的降低。回归统计结果表明，42日龄血清NO含量和iNOS活性均随APS添加量的增加而增加，并呈显著二次曲线剂量依赖关系(P=0.024，P=0.047)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 APS对肉仔鸡血清NO含量及iNOS活性的影响 Table 4 Effects of APS on NO content and iNOS activity in serum of broilers 项目 Items 日龄 Day of age APS添加量 APS supplemental level SEM P值 P-value 0 0.1% 0.5% 1.0% 2.0% 一次 Linear 二次 Quadratic 一氧化氮 NO/(μmol/L) 28 6.42 8.56 10.73 11.85 8.11 1.47 0.153 0.113 42 9.63 11.74 15.84 17.47 9.18 1.22 0.356 0.024 诱导型一氧化氮合成酶 iNOS/(U/mL) 28 8.54 9.66 10.73 12.96 9.79 1.85 0.520 0.386 42 9.58 11.07 14.45 15.68 10.63 1.46 0.373 0.047

表4 APS对肉仔鸡血清NO含量及iNOS活性的影响 Table 4 Effects of APS on NO content and iNOS activity in serum of broilers

由表5可知，在试验各期，各APS添加组肉仔鸡小肠的iNOS mRNA表达均高于对照组(除42日龄2.0%组的空肠外)，其中以1.0%APS组最高。当APS添加量提高到2.0%时，肉仔鸡小肠iNOS mRNA表达均呈不同程度的降低。回归统计分析结果表明，28和42日龄时，随APS添加量的增加，肉仔鸡十二指肠iNOS mRNA表达分别呈现显著二次曲线增加(P=0.025)和二次曲线增加趋势(P=0.082)；28和42日龄时，空肠iNOS mRNA表达随APS添加量的增加分别呈现显著二次曲线增加(P=0.045)和二次曲线增加趋势(P=0.078)；42日龄时，回肠的iNOS mRNA表达随APS添加量的增加呈现显著二次曲线增加趋势(P=0.010)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 APS对肉仔鸡小肠iNOS mRNA表达的影响 Table 5 Effects of APS on iNOS mRNA expression in small intestine of broilers 项目 Items 日龄 Day of age APS添加量 APS supplemental level SEM P值 P-value 0 0.1% 0.5% 1.0% 2.0% 一次 Linear 二次 Quadratic 十二指肠 Duodenum 28 0.035 7 0.042 8 0.051 0 0.062 6 0.040 0 0.010 0.392 0.025 42 0.021 1 0.024 6 0.029 8 0.032 9 0.022 4 0.005 0.276 0.082 空肠 Jejunum 28 0.024 3 0.028 9 0.034 2 0.042 0 0.026 2 0.008 0.486 0.045 42 0.013 8 0.018 5 0.022 9 0.027 5 0.012 6 0.003 0.264 0.078 回肠 Ileum 28 0.022 7 0.023 9 0.026 8 0.029 4 0.023 6 0.004 0.163 0.128 42 0.011 0 0.018 8 0.025 7 0.037 2 0.015 3 0.003 0.385 0.010

表5 APS对肉仔鸡小肠iNOS mRNA表达的影响 Table 5 Effects of APS on iNOS mRNA expression in small intestine of broilers

已有研究表明，APS可显著提高肉仔鸡平均日增重，降低料重比，对肉仔鸡生长性能有促进作用^{[ 1 ]}。吕美^{[ 14 ]}研究认为，肉仔鸡饲粮中添加0.2%和0.3%的APS可显著提高平均日增重，降低料重比。王俊丽等^{[ 2 ]}试验结果也表明，APS对试验前期肉仔鸡生长性能有显著影响，其中以1 000和2 000 mg/kg组效果较好，且高剂量APS对肉仔鸡的生长性能可能会产生负面影响。本试验结果表明，在整个试验期间，各APS添加组肉仔鸡的平均体重和平均日增重均高于对照组，其中以1.0%APS组效果最佳。但当APS的添加量增加到2.0%时，促生长效果减弱，提示适量的APS对肉仔鸡生长性能有促进效果，而高添加量则促生长效果呈降低趋势。也有研究认为，APS对肉仔鸡的生长性能无显著影响^{[ 4,15 ]}。产生不同结果的原因可能是不同的APS分子质量、溶解度、黏度、一级结构和高级结构导致的不同生物活性造成^{[ 16 ]}。

IL-1主要是由活化的单核/巨噬细胞分泌的多功能细胞因子，在免疫反应过程中，能刺激T淋巴细胞分泌IL-2并表达其受体，协同IL-2促进淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的产生。IL-2主要由辅助T细胞CD⁺₄细胞产生，可促进T细胞的生长与增殖，是保障机体正常免疫功能的关键环节。TNF-α是活化巨噬细胞释放的另一细胞因子，不仅能够抗肿瘤，而且对多种免疫和炎症反应的效应细胞都有调节作用。有研究表明，APS可促进小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α的分泌^{[ 7 ]}，提高创伤小鼠脾淋巴细胞IL-2 mRNA水平，促进IL-2的生成^{[ 17 ]}。也有研究认为，APS可显著提高雏鸡巨噬细胞活性，并诱导其分泌IL-1^{[ 5 ]}。陈洪亮^{[ 6 ]}试验也证明，APS能促进肉仔鸡脾脏T淋巴细胞IL-2的分泌，且促进作用与APS的添加量有关，与刘永杰等^{[ 18 ]}研究结果一致。

研究也表明，巨噬细胞分泌的免疫细胞因子释放到血液中，血清TNF-α、IL-2等含量升高，机体免疫功能增强，说明血清中免疫细胞因子水平也可反映机体的免疫功能^{[ 19 ]}。罗燕等^{[ 20 ]}研究认为，APS能显著提高鸡血清中IL-2含量。肖顺汉等^{[ 21 ]}研究表明，50和100 mg/kg APS可提高荷瘤小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-6、白细胞介素-12(IL-12)和TNF-α含量。毛晓峰^{[ 8 ]}研究也表明，APS可减缓脂多糖(LPS)刺激的猪血浆白细胞介素-1β(IL-1β)，前列腺素E2和皮质醇含量的降低，并呈一次线性关系。本试验研究显示，APS对血清细胞因子含量的影响呈剂量依赖关系，血清IL-1、IL-2和TNF-α含量随APS添加剂量的增加而增加，42日龄血清IL-1和TNF-α含量呈显著二次曲线增加，其中以0.5%和1.0%APS组较高。当APS添加量提高到2.0%时，各试验阶段肉仔鸡血清IL-1、IL-2和TNF-α含量均有不同程度的降低。这说明饲粮中添加APS可促进肉仔鸡免疫细胞因子的分泌，刺激机体的细胞免疫功能，但也暗示了APS对肉仔鸡细胞免疫功能的促进作用有一阈值，超过这一阈值则促进作用呈降低趋势，引起这个结果的原因尚不清楚。

NO是一种重要的信使分子，广泛存在于动物机体的组织细胞中，具有重要的生理活性作用。NO由iNOS催化L-精氨酸产生，具有抗微生物活性及抑制广谱原虫、真菌、细菌和病毒作用，是非特异性免疫反应的重要因子。iNOS在炎症、应激等状态下，或TNF-α、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-l、IL-2等刺激下都可以诱导巨噬细胞、平滑肌细胞等表达iNOS mRNA，再翻译成iNOS，促进NO的分泌。

许多研究已经证明，多糖作为免疫增强剂或免疫调节剂，可促进巨噬细胞iNOS mRNA表达，使iNOS活性增强，NO分泌增加，从而增强机体免疫功能。Nose等^{[ 22 ]}研究指出，甘草多糖能促进体外培养的鼠腹膜巨噬细胞分泌NO。香菇多糖对小鼠腹腔巨噬细胞NO生成具有明显的促进作用，且呈剂量依赖关系^{[ 23 ]}，香菇多糖也可增加脾细胞增殖、IL-2产生、脾细胞NO产生及细胞溶质的钙释放，且呈剂量依赖关系^{[ 24 ]}。王瑾雯等^{[ 25 ]}研究发现，云芝多糖能促进巨噬细胞iNOS mRNA的表达，使mRNA转录和蛋白质合成增加。Li等^{[ 26 ]}研究表明，壳聚糖可促进肉仔鸡血清NO合成，增强小肠iNOS mRNA表达及活性，且呈剂量依赖关系。

有关APS对动物NO分泌和iNOS活性的研究主要采用体外法进行。胡庭俊等^{[ 10 ]}研究发现，APS能显著促进小白鼠腹腔巨噬细胞NO生成，与姚金凤等^{[ 9 ]}研究结果一致。毛晓峰^{[ 8 ]}试验表明，APS能显著增加仔猪外周血淋巴细胞NO产生，增强iNOS活性，并呈二次剂量依赖关系。曹丽萍等^{[ 27 ]}研究认为，低APS添加量可促进鲤的头肾巨噬细胞产生NO，高APS添加量却表现为抑制作用。有限的体内研究结果也表明，饲喂APS可提高大鼠血清中NO含量^{[ 11 ]}。苏岭等^{[ 28 ]}试验证明，饲粮中添加APS可提高鲫鱼组织中NO含量与一氧化氮合酶(NOS)活性。张晋强等^{[ 12 ]}研究也表明，饲粮中添加APS(100和200 mg/kg)可显著促进小鼠巨噬细胞iNOS mRNA表达和NO产生。

但关于APS对肉仔鸡iNOS mRNA表达及活性影响的研究报道极少。本试验研究表明，APS可提高肉仔鸡血清NO含量和iNOS活性，促进小肠iNOS mRNA表达，以上指标均在42日龄时呈显著二次曲线增加，其中以1.0%APS组最高。由此可以推测，APS可能是通过调控iNOS mRNA的表达和iNOS的合成，影响NO的分泌，进而调节肉仔鸡的免疫功能。当APS添加量提高到2.0%时，各指标均有不同程度的降低，提示APS对肉仔鸡免疫功能的影响有一定的剂量依赖关系，高APS添加量对肉仔鸡免疫功能的促进作用减弱，但其确切作用机制有待于进一步探讨。

① 饲粮中添加APS可提高肉仔鸡平均体重和平均日增重，降低料重比，对肉仔鸡的生长性能有促进作用，其中以1.0%APS组效果最佳，当APS添加量提高到2.0%时，效果减弱。

② 饲粮中添加APS可提高血清IL-1、IL-2和TNF-α含量，42日龄血清IL-1和TNF-α含量呈显著二次曲线增加，其中以0.5%和1.0%APS组效果较佳，当APS添加量提高到2.0%时，各试验阶段肉仔鸡血清IL-1、IL-2和TNF-α含量均有不同程度的降低。

③ 饲粮中添加APS可提高肉仔鸡血清NO含量和iNOS活性，促进小肠iNOS mRNA表达，以上指标均在42日龄时呈显著二次曲线增加，其中以1.0%APS组最高，当APS添加量提高到2.0%时，各指标均有不同程度的降低。