2. 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室, 呼和浩特 010018;
3. 内蒙古农牧业科学院动物营养研究所, 呼和浩特 010031
2. Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease, Ministry of Agriculture, Hohhot 010018, China;
3. Animal Nutrition Institute, Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010031, China
酵母菌及其培养物类产品在反刍动物上的应用已有许多报道[ 1,2 ]，但由于其所用的发酵饲料配方不同、发酵工艺各异，致使这类产品的质量不稳定，使用效果也参差不齐，这些不足大大制约了酵母类添加剂的推广和应用。以固态发酵技术来研制反刍动物的生物饲料已有多年的历史，但多数研究往往以发酵饲料中活菌数或粗蛋白质含量作为评定产品质量的指标[ 3,4 ]。近几年的研究表明，酵母菌在发酵过程中产生的活性物质对调控瘤胃发酵功能起着重要作用，学者们认为酵母培养物主要是通过其中的代谢产物来提高瘤胃中微生物的数量和活力，从而改善瘤胃发酵，提高饲料的消化和利用效率，最终起到提高动物生产性能的作用[ 5,6,7 ]。进一步研究发现，酵母代谢物中起主要功效的组分为多糖、维生素、有机酸、消化酶、促生长因子和丰富的氨基酸等[ 8 ]，这些活性物质具有良好的适口性，能够增强免疫力及促进动物的生长。也有学者就植物提取物[ 9,10 ]、活性寡糖[ 11 ]、酵母β-葡聚糖[ 12 ]等活性物质在反刍动物上的应用进行了研究，这些研究强调的是单一添加剂的某些生物活性功效，事实上各种活性物质之间存在组合效应，我们应当以“营养活性物质组学”[ 13 ]的概念来研究酵母代谢产物中营养活性物质的功效，而不是单单研究某一种活性物质功效的大小。基于上述理论，本试验以酵母菌发酵后产生的β-葡聚糖、甘露聚糖、有机酸等活性物质为衡量指标，对复合菌固态发酵培养基及发酵工艺进行优化，为其在反刍动物上的应用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 培养基酵母菌活化培养基：包括麦芽汁培养基、酵母菌计数培养基、虎红琼脂培养基、枯草活化培养基、营养肉汤培养基，均购自广东环凯微生物科技有限公司。
固态发酵培养基：以麸皮、玉米皮、玉米粉、米糠、豆粕、棉籽粕、无机盐为原料按试验设计的要求混合成固态发酵培养基。
1.2 试验菌株产朊假丝酵母菌SC18、BY株及枯草芽孢杆菌A15株均来源于内蒙古农业大学兽医学院反刍动物微生态制剂课题组菌种库。 1.3 复合菌固态发酵培养基的优化
复合菌固态发酵培养基优化条件中7种因子及界限分别为：麸皮40%~70%，玉米皮10%~25%，玉米粉3%~20%，米糠2%~14%，棉籽粕1%~7%，豆粕2%~14%，无机盐0.5%~3.5%；其中无机盐组分为硫酸铵[(NH4)2SO4]∶ 磷酸二氢钾(KH2PO4)∶ 硫酸镁(MgSO4)=14∶ 5∶ 1[ 14 ]。使用DPS数据处理系统V14.10高级版软件，采用7因子14处理(N1~N14)，离心系数α为0.5的有上下限约束的混料试验设计方法优化固态发酵培养基组成，设计方案见表1。按表1设计，称取各组分于不锈钢发酵盒中，每个样品发酵总量为500 g，每个处理3个重复，共计45个样本，含水量为45%，将活化好的产朊假丝酵母菌SC18、BY株及枯草芽孢杆菌A15株菌液按2∶ 2∶ 1比例，以10%接种量接入固态发酵培养基中，充分混合后，放置双层纱布于发酵盒口以透气，于30 ℃恒温培养箱中发酵48 h后，发酵盒的4个角及中央5个位置共取样50 g，均匀混合后，用于后续试验测定。
 | 表1 复合菌固态发酵培养基组分的混料试验设计方案 Table 1 The mixing experiment design of components of compound bacteria solid-state fermentation medium % |
复合菌固态发酵培养基发酵工艺条件及界限为：pH 5.0~8.0，温度26~38 ℃，时间24~55 h，含水量40%~60%。使用DPS数据处理系统V14.10高级版软件中的均匀设计法优化固态发酵工艺参数，可得到4因子7水平14处理(M1~M14)的均匀设计表U14(74)，设计方案见表2。按1.3优化的发酵配方，称取各组分于不锈钢发酵盒中，每个样品发酵总量为500 g，将活化好的复合菌液以10%的比例接种，30 ℃发酵48 h后，发酵盒的4个角及中央5个位置共取样50 g，均匀混合后，用于后续试验测定。
| 表2 发酵工艺优化的均匀试验设计方案 Table 2 The uniform experiment design of optimized fermentation process |
测定发酵料中的活菌数及β-葡聚糖、甘露聚糖、有机酸等活性物质含量。
1.5.1 菌落计数采用平板倾注法[ 15 ]计数。
1.5.2 葡聚糖、甘露聚糖的测定酵母破壁：采用涡流微珠破壁法[ 16 ]测定。
硫酸水解：用72%的硫酸溶液处理[ 17 ]。同时分别称取葡聚糖和甘露聚糖各5.00、6.25、7.50、8.75、10.00、12.50、15.00 mg做校正，硫酸水解后使多糖终含量分别为0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.50、0.60 mg/mL。
单糖含量测定：采用液相色谱-示差折光检测器测定样品及校正多糖中甘露糖和葡萄糖含量[ 18,19 ]。
结果计算：以校正多糖的含量为横坐标，峰面积为纵坐标制备校正曲线，得出回归方程。样品的峰面积代入回归方程中计算得到酵母β-葡聚糖及甘露聚糖含量。
1.5.3 有机酸的测定采用安捷伦LC1100液相色谱仪测定有机酸含量[ 20 ]。
1.6 统计分析数据采用Excel 2003进行整理，采用SAS 9.0进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。
2 结 果 2.1 复合菌固态发酵培养基优化结果根据混料试验设计方案(表1)和混料试验结果(表3)，采用DPS数据处理系统V14.10高级版软件对酵母菌数及活性物质含量等因变量和因子水平试验数据进行偏最小二乘回归分析，充分考虑7个变量的优化并使各指标含量均达最高来建立数学模型，最终得出各因素组合最优发酵配方，如表4所示。通过上述软件分析得出最优组合：活菌数7.08×106 CFU/g、葡聚糖含量261.83 mg/g、甘露聚糖含量176.20 mg/g、酒石酸含量1.08 mg/g、苹果酸含量14.54 mg/g、柠檬酸含量1.87 mg/g、丁二酸含量5.19 mg/g。
| 表 3 混料试验结果Table 3 Results of the mixing experiment |
| 表 4 复合菌固态发酵培养基优化结果Table 4 Results of optimization compound bacteria solid-state fermentation mediu |
采用DPS数据处理系统对均匀试验设计方案(表2)及均匀试验结果(表5)进行偏最小二乘回归分析，使各指标含量均达最高，建立数学模型，最终得出最优发酵工艺，如表6所示。通过上述软件分析得出最优工艺组合：活菌数6.71×108 CFU/g、葡聚糖含量279.83 mg/g、甘露聚糖含量156.82 mg/g、酒石酸含量2.78 mg/g、苹果酸含量8.28 mg/g、柠檬酸含量1.34 mg/g、丁二酸含量2.54 mg/g。
| 表 5 均匀试验结果Table 5 Results of the uniform experimen |
| 表 6 复合菌固态发酵工艺优化结果Table 6 Results of optimization compound bacteria solid-state fermentation process |
选用偏最小二乘回归分析建模[ 21 ]，建模时，提取不同潜变量个数其相应的数据标准化后模型的误差平方和及相应组分下的模型拟合决定系数(determination coefficient,R2)，如表7所示。潜变量个数为6时，误差平方和最小，且R2全部大于70%，所以选取潜变量个数为6。
| 表7 数据标准化后模型误差平方和及决定系数 Table 7 The error sum square and determination coefficient of model under standardizing data |
R2全部大于70%表明理论上各回归方程的拟合程度较好，但是对模型检验最好的方法是试验验证。本试验按照筛选的配方进行发酵，测定活菌数及各种活性物质含量，与模型预测值进行比较，结果如表8所示，活菌数及甘露聚糖、苹果酸、柠檬酸、总有机酸含量的实测值高于预测值，葡聚糖含量实测值低于预测值，但以上指标实测值与预测值差异均不显著(P>0.05)，验证了数学模型的良好性。而酒石酸含量的实测值显著高于预测值(P<0.05)，丁二酸含量的实测值显著低于预测值(P<0.05)。
| 表8 模型预测与验证试验结果 Table 8 Results of model prediction and verification test |
本试验选用含有多个因素(试验指标)的均匀试验设计，采用偏最小二乘回归分析建模[ 22 ]，潜变量为5时，R2全部大于75%，各回归方程的拟合程度较好。
按筛选的工艺进行发酵，测定活菌数及各种活性物质含量，对模型进行验证。结果如表9所示，其中活菌数及葡聚糖、苹果酸、丁二酸、总有机酸含量的实测值高于预测值，甘露聚糖含量的实测值低于预测值，但以上指标实测值与预测值间差异均不显著(P>0.05)，验证了数学模型的良好性，只有酒石酸及柠檬酸含量的实测值均显著低于预测值(P<0.05)。
| 表9 模型预测与验证试验结果 Table 9 Results of model prediction and verification test |
3 讨 论 3.1 复合菌固态发酵工艺的确定
本试验以麸皮、玉米皮、棉籽粕、米糠等物质作为复合菌固态发酵的原料，使这些农副产物转化为复合菌生长的基质，为复合菌生长提供营养，促进活性物质的产生，既节约成本，又绿色、环保。
由于复合菌的生长及代谢产物合成对温度的敏感性[ 23 ]，所以温度是保证微生物生长和产物合成的重要因素，发酵过程中对温度的控制尤为重要。本试验的复合菌包括2株产朊假丝酵母菌及1株枯草芽孢杆菌，由于不同菌种对温度需求差异大，所以温度是固态发酵的关键控制点。多次试验及科学的数据分析表明，复合菌在30 ℃条件下发酵46 h，既能促进酵母菌的生长，又能保证枯草芽孢杆菌的活性，此时产生的活菌数及活性物质含量达到最优。
底物含水量的多少对微生物的生长及其代谢能力有重要影响。含水量低将降低营养物质传输、微生物生长、酶稳定性和基质膨胀；含水量高将导致颗粒结块、通气不畅和染菌[ 24 ]。通常，在一定范围内，活性物质的含量随着含水量的增加而增加，本试验表明，含水量为60%的固态发酵培养基中活菌数及活性物质含量最高。
不同菌种对培养基pH的需求不同，酵母菌最适pH为4.0～5.0，而复合菌中的枯草芽孢杆菌最适pH为7.2左右，二者对pH要求差异显著，所以需要通过试验优化复合菌最适pH。本试验优化pH的结果为8.0，在此条件下，有利于枯草芽孢杆菌优先繁殖，将固态发酵料中的大量淀粉分解为酵母可利用的单糖，为酵母繁殖奠定营养基础。随着发酵过程的进行，固态发酵料中的有机酸大量产生，造成pH下降，尤其在发酵中后期，过低的pH会抑制枯草芽孢杆菌生长，此时酵母菌是发酵料中的主力菌，因而本试验工艺在发酵初期适当提高了固态培养基pH。
3.2 软件选用及试验设计本试验测定了活菌数及葡聚糖、甘露聚糖、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸含量这7个指标，属于多因素分析。试验设计与数据处理时从多因素综合分析选出最优发酵配方和发酵工艺。常用的SAS和SPSS等统计软件在进行数据处理及回归方程的拟合时，不能由回归方程直接给出因素间的最佳组合[ 25 ]。而DPS数据处理系统中的均匀试验设计是研究多因素多水平试验最优组合的一种试验设计方法，其可用较少的试验次数完成复杂的因素和水平间的最优搭配。均匀试验设计比正交试验适用范围广，试验次数少，而且试验点更具代表性，尤其在试验结果数值小的情况下，均匀试验设计和分析的过程采取数据变换的方法，利用其回归模型来完成数据的分析并得到最佳组合，此法操作简单，实用性强。因而，本试验选择DPS数据处理系统来进行试验设计。
3.3 数学模型的拟合性本试验测定的活菌数及甘露聚糖、酒石酸含量3个指标的R2未达到80%，同时，2个验证试验中的酒石酸、柠檬酸、丁二酸含量的实测值与预测值差异显著，说明模型对多指标综合模拟程度不可能都达到最高值，这是因为本试验含有7个因变量，且7个因变量中有些指标是相互抑制的，也就是说，选取一个模型模拟7个因素的回归方程，使菌体产生的7个指标全部达到峰值，这是非常困难的。葡聚糖、甘露聚糖和总有机酸含量是本研究的主要指标，以其结果进行三因素的数据分析表明模型模拟程度良好，R2全部大于80%。
4 结 论① 复合菌固态发酵培养基优化配方为：麸皮52.69%、玉米皮20.45%、玉米粉16.07%、米糠4.09%、棉籽粕1.86%、豆粕3.99%、无机盐0.85%[(NH4)2SO4 0.60%、KH2PO4 0.21%、MgSO4 0.04%]。
② 优化发酵工艺为：含水量60%、pH 8.0、温度30 ℃、时间46 h；此时复合菌培养物中活菌数达6.71×108 CFU/g，且活性物质组含量最优，其中葡聚糖含量279.83 mg/g、甘露聚糖含量156.82 mg/g、酒石酸含量2.78 mg/g、苹果酸含量8.28 mg/g、柠檬酸含量1.34 mg/g、丁二酸含量2.54 mg/g。
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