随着人们消费水平的提高，肉类产品在人类膳食结构中的比例不断增加，消费者对猪肉品质也提出了更高的要求。为了提高经济效益，人们通常采用遗传选育和营养调控等手段提高猪的生长速度和瘦肉率，却造成了皮下和内脏脂肪沉积过多、胴体品质下降^{[ 1,2 ]}。另外，由于养殖生产中抗生素、化学药物的大量使用，导致畜产品中出现药物残留，严重危害着人类健康。因此，研发绿色、高效饲料添加剂用于养猪生产，在不影响或提高生长性能的同时，促进骨骼肌生长、适度增加肌内脂肪含量、减少皮下和内脏脂肪沉积，已成为现代养猪业的发展方向^{[ 3,4 ]}。L-精氨酸(Arg)作为一种重要的碱性氨基酸，不仅是蛋白质合成的重要原料，也能调节动物机体的营养代谢^{[ 5 ]}。例如，饲粮添加Arg能够刺激线粒体的生物合成，增加葡萄糖和脂肪酸的氧化，有效降低肥胖大鼠的白色脂肪含量；能够通过增加机体一氧化氮合成、诱生生长激素、调节肌醇和甘油磷酸胆碱等途径，显著提高肥育猪的瘦肉率和肌内脂肪含量、显著降低胴体脂肪率，从而改善肉质^{[ 5,6,7 ]}。目前，关于N-氨甲酰谷氨酸(NCG)也开展了大量研究，发现它作为尿素循环中鸟氨酸生成瓜氨酸的中间体N-乙酰谷氨酸(NAG)的类似物，可刺激机体内源性Arg的合成，促进肠道对营养物质的消化吸收，有效提高仔猪机体蛋白质合成和生长激素水平，改善机体氨基酸平衡，提高仔猪生长性能^{[ 8,9 ]}。由于外源性Arg在养猪生产中的应用一直受到价格因素的制约，因此通过在饲粮中添加NCG调控内源性Arg的合成从而增加机体内Arg的供给是一种经济、有效的策略。环江香猪是我国著名的小型地方猪种，具有抗逆性强、肉质优良等特点。笔者前期研究发现，在环江香猪饲粮中添加Arg后，平均日增重和瘦肉率分别提高15.4％和15.0％，脂肪率和背最长肌粗脂肪含量分别降低34.6％和35.1％^{[ 10 ]}，料重比和背膘厚也有降低趋势；在环江香猪日粮中添加NCG后，屠宰率提高9.6％，脂肪率和均膘厚分别降低31.4％和29.3％，瘦肉率和眼肌面积均有增加趋势^{[ 11 ]}。可见，Arg和NCG均可一定程度上改善环江香猪的肉质，但对其改善肉质的机制却没有深入研究。因此，本试验进一步比较研究了Arg和NCG对环江香猪背最长肌脂肪酸组成以及肝脏和背最长肌中脂质代谢相关基因表达的影响，旨在探讨Arg和NCG调控肉质的作用机制，为其在养猪生产中的应用提供依据。 1 材料与方法 1.1 基础饲粮

参照NRC(1998)推荐的猪营养需要并结合陆川猪的饲粮配方配制本试验基础饲粮，其组成及营养水平见表1^{[ 10 ]}。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 原料 Ingredients 含量 Content 营养水平 Nutrient levels2) 含量 Content 玉米 Corn 47.0 消化能 DE/(MJ/kg) 12.90 小麦麸 Wheat bran 22.0 粗蛋白质 CP 14.70 大米 Rice 15.0 钙 Ca 0.90 大豆粕 Soybean meal 10.0 总磷 TP 0.65 鱼粉 Fish meal 2.0 赖氨酸 Lys 0.68 预混料 Premix1) 4.0 L-精氨酸 L-Arg 0.16 合计 Total 100.0 L-丙氨酸 L-Ala 0.74 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provides the following per kg of diet: VA 12 040 IU，VD32 112 IU，VE 29.7 IU，VK32.8 mg，VB11.2 mg，VB27.1 mg，VB61.3 mg，VB120.03 mg，烟酸 nicotinic acid 42.9 mg，泛酸 pantothenic acid 21.6 mg，叶酸 folic acid 0.44 mg，生物素 biotin 0.12 mg，胆碱 choline 320 mg，Fe 80 mg，Cu 40 mg，Zn 140 mg，Mn 52 mg，I 0.56 mg，Co 1.4 mg，Se 0.33 mg，Ca 8 mg，P 0.8 mg。 2)消化能为计算值，其余均为实测值。DE is a calculated value,and the others are measured values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

饲养试验在广西环江县东兴镇某香猪养殖场进行，时间为2009年10月11日至2009年11月25日。试验选用24头初始体重为(28.14±3.45) kg的环江香猪(公母各占1/2)，按体重相近原则随机分为3组，即对照组、Arg组和NCG组，每组4个重复，每个重复2头猪。对照组在基础饲粮中添加1.71%的L-丙氨酸(L-Ala，等氮对照，因为L-Ala既无毒性，也不是内源性精氨酸合成的底物，可被机体的多个组织分解代谢)，Arg组和NCG组分别在基础饲粮中添加0.83%L-Arg+0.88%的米糠、0.08%NCG+1.71%L-Ala^{[ 10 ]}。试验期为45 d，每天饲喂2次(08:00和17:00)，日饲喂量为香猪初始体重的3%，自由饮水，其他按猪场计划进行免疫和常规管理。

饲喂45 d后，称量体重，颈动脉放血处死试猪，采集肝脏和背最长肌，液氮速冻后-80 ℃保存，用于实验室分析。

取背最长肌冻干样品用石油醚-乙醚(1∶ 1，v/v)提取脂肪后，用1 mL氢氧化钾-甲醇液(0.4 mol/dL)酯化30 min，然后热水浴浓缩，加水分层，取500 μL上层液用气相色谱-质谱(GC-MS)联用法测定，由微机按面积归一化法自动计算脂肪酸各组分含量。

采用Trizol法提取肝脏和背最长肌的总RNA，经紫外分光光度计测得A260/A280值在1.8～2.0之间，琼脂糖凝胶电泳法评价RNA的质量。参照Fermentas反转录试剂盒说明书分别准确量取1.0 μg各样品的总RNA进行逆转录合成cDNA，并以此为模板采用实时荧光定量PCR方法测定乙酰CoA羧化酶α(ACCα)、脂肪酸合成酶(FAS)、脂蛋白脂酶(LPL)和过氧化物酶增生物激活受体γ(PPARγ)mRNA的表达量。引物采用Primer 5.0软件设计，PCR引物序列见表2。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，在ABI 7900HT PCR仪上进行PCR反应，反应体系为10 μL，其中包括0.5 μL cDNA模板、5 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix、0.2 μL ROX(TaKaRa)和0.3 μL 10 μmol/L目的基因的上、下游引物，用无酶无菌水补足至10 μL。反应采用2步法，其条件为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。每个反应体系设置2个重复，每次循环的最后一步收集SYBR Green荧光，循环结束时从60 ℃开始绘制熔解曲线。根据目的基因和β-actin的阈值循环(Ct)，采用2^-△△Ct法^{[ 17 ]}计算样品中各脂质代谢相关基因mRNA的相对表达量。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 PCR引物序列 Table 2 Sequences of primers for PCR 目的基因 Target genes 引物序列 Primer sequences β-肌动蛋白 上游 Forward： 5′-AGACCACCTTCAACTCCATCAT-3′ β-actin 下游 Reserve： 5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3′ 乙酰CoA羧化酶α 上游 Forward： 5′-TCCCAGTGCAAGCAGTATG-3′ ACCα 下游 Reserve： 5′-TGCCAATCCACACGAAGAC-3′ 脂肪酸合成酶 上游 Forward： 5′-GTCCTGCTGAAGCCTAACTC-3′ FAS 下游 Reserve： 5′-TCCTTGGAACCGTCTGTG-3′ 脂蛋白脂酶 上游 Forward： 5′-CAAACTTGTGGCTGCCCTAT-3′ LPL 下游 Reserve： 5′-GTGGACATTGTTGGGAGGAT-3′ 过氧化物酶增生物激活受体γ 上游 Forward： 5′-CGCTGACCAAAGCAAAGGC-3′ PPARγ 下游 Reserve： 5′-CCACGGAGCGAAACTGACAC-3′

表2 PCR引物序列 Table 2 Sequences of primers for PCR

结果以“平均值±标准误”表示，用SPSS 17.0软件进行Duncan氏多重比较。以P<0.05作为差异显著性判断标准。

由表3可知，与对照组相比，饲粮添加Arg显著降低了背最长肌C18∶ 0含量(P＜0.05)，饲粮添加NCG也降低了背最长肌C18∶ 0含量(P>0.05)；其他脂肪酸含量各组间差异均不显著(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 Arg和NCG对环江香猪背最长肌脂肪酸含量的影响 Table 3 Effects of Arg and NCG on fatty acid content in longissimus dorsi of Huanjiang mini-pigs % 脂肪酸Fatty acids Arg组Arg group NCG组NCG group 对照组Control group C16∶0 24.9±2.5 27.3±3.1 27.5±2.9 C16∶1 3.8±0.5 4.0±0.4 3.3±0.4 C18∶0 13.2±0.9b 15.6±1.7ab 19.3±1.9a C18∶1 46.1±3.8 43.9±3.5 39.7±3.4 C18∶2 12.0±1.3 9.2±1.2 10.2±1.5 同行数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。 In the same row,values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 Arg和NCG对环江香猪背最长肌脂肪酸含量的影响 Table 3 Effects of Arg and NCG on fatty acid content in longissimus dorsi ofHuanjiang mini-pigs %

由表4可知，与对照组相比，饲粮添加Arg显著下调了肝脏ACCα mRNA表达、显著上调了PPARγ mRNA表达(P＜0.05)，饲粮添加NCG显著下调了肝脏ACCα和LPL mRNA表达、显著增加了FAS/LPL值(P＜0.05)；NCG组环江香猪肝脏PPARγ mRNA表达量也显著低于Arg组、FAS/LPL值显著高于Arg组(P＜0.05)；FAS mRNA表达量各组间差异均不显著(P>0.05)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 Arg和NCG对环江香猪肝脏脂质代谢相关基因表达的影响 Table 4 Effects of Arg and NCG on liver gene expression related to lipid metabolism of Huanjiang mini-pigs 项目 Items Arg组 Arg group NCG组 NCG group 对照组 Control group 乙酰CoA羧化酶α ACCα 0.17±0.02b 0.18±0.03b 1.00±0.14a 脂肪酸合成酶 FAS 1.02±0.11 0.79±0.13 1.00±0.13 脂蛋白脂酶 LPL 1.31±0.17a 0.45±0.07b 1.00±0.09a 过氧化物酶增生物激活受体γ PPARγ 2.70±0.22a 0.87±0.12b 1.00±0.14b 脂肪酸合成酶/脂蛋白脂酶 FAS/LPL 0.78±0.14b 1.78±0.24a 1.00±0.15b

表4 Arg和NCG对环江香猪肝脏脂质代谢相关基因表达的影响 Table 4 Effects of Arg and NCG on liver gene expression related to lipid metabolism of Huanjiang mini-pigs

由表5可知，与对照组相比，饲粮添加Arg显著下调了背最长肌ACCα和PPARγ mRNA表达(P＜0.05)；饲粮添加NCG显著下调了背最长肌ACCα、FAS和LPL mRNA表达(P＜0.05)，显著上调了PPARγ mRNA表达(P＜0.05)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 Arg和NCG对环江香猪背最长肌脂质代谢相关基因表达的影响 Table 5 Effects of Arg and NCG on gene expression related to lipid metabolism in longissimus dorsi of Huanjiang mini-pigs 项目 Items Arg组 Arg group NCG组 NCG group 对照组 Control group 乙酰CoA羧化酶α ACCα 0.20±0.03b 0.02±0.00b 1.00±0.17a 脂肪酸合成酶 FAS 0.96±0.19a 0.46±0.08b 1.00±0.15a 脂蛋白脂酶 LPL 0.84±0.13ab 0.48±0.08b 1.00±0.16a 过氧化物酶增生物激活受体γ PPARγ 0.25±0.05c 2.12±0.28a 1.00±0.18b 脂肪酸合成酶/脂蛋白脂酶 FAS/LPL 1.14±0.21 0.96±0.15 1.00±0.17

表5 Arg和NCG对环江香猪背最长肌脂质代谢相关基因表达的影响 Table 5 Effects of Arg and NCG on gene expression related to lipid metabolism in longissimus dorsi of Huanjiang mini-pigs

脂肪主要在肝脏组织中合成，然后通过血液循环运输到脂肪和肌肉等组织中沉积。体脂的沉积是动物贮存能量的主要方式，其沉积量取决于脂肪的合成代谢与分解代谢速度的高低。大量研究表明，ACC、FAS、LPL和PPARγ等在脂质代谢调节过程中起着关键作用^{[ 12 ]}。目前，国内外关于Arg和NCG影响环江香猪肝脏和背最长肌脂质代谢相关基因表达的研究尚属空白。

ACC和FAS是机体肝脏、脂肪等组织合成脂肪酸的两个关键酶。ACC在脂肪酸合成的第一步反应中，催化乙酰CoA羧化成丙二酰CoA；FAS则催化从乙酰CoA、丙二酰CoA合成长链脂肪酸的反应^{[ 13,14 ]}。因此，ACC和FAS可以通过调节脂肪酸合成过程而影响脂质代谢平衡。本研究结果表明，饲粮添加Arg可显著下调肝脏和背最长肌ACCα mRNA表达，饲粮添加NCG可显著下调肝脏ACCα以及背最长肌ACCα、FAS mRNA表达，提示Arg和NCG均可降低肝脏和背最长肌的脂肪酸合成，这与其对胴体脂肪率、背膘厚的降低作用一致^{[ 10,11 ]}。LPL作为甘油三酯代谢的限速酶，主要催化乳糜微粒和超低密度脂蛋白(VLDL)中的甘油三酯水解为脂肪酸^{[ 15 ]}。相关报道指出，饲喂高胆固醇膳食后，家兔血清LPL活性增强^{[ 16 ]}。在本试验中，饲粮添加NCG可显著下调肝脏和背最长肌LPL mRNA表达，提示NCG可能有抑制甘油三酯水解作用。饲粮添加NCG可显著提高肝脏中FAS/LPL值，而饲粮添加Arg对FAS/LPL值的影响不大，说明NCG和Arg对脂质代谢的调控作用不同，其具体机制尚需进一步研究。

PPAR作为核受体超家族成员中的一员，与脂质代谢紊乱、肥胖、糖尿病等多种疾病的发生有关，是脂质代谢过程中的重要转录因子。也有研究表明，敲除小鼠肝脏组织PPARγ基因可以保护其免受脂肪肝的损害^{[ 17 ]}；高脂饲粮可下调大鼠肝脏组织PPARγ mRNA的表达^{[ 18 ]}。在本研究中，饲粮添加Arg可显著上调肝脏PPARγ mRNA表达，这与Arg或其代谢物可上调脂肪细胞PPARγ表达的结果一致^{[ 18 ]}；饲粮添加Arg显著下调了背最长肌PPARγ mRNA表达，这与Arg能够增加生长猪肌内脂肪含量的研究结果一致^{[ 19 ]}；饲粮添加NCG可显著上调背最长肌PPARγ mRNA表达，提示NCG除了激活内源性Arg生成外，可能还存在其他作用途径。

另外，饲粮添加Arg可显著降低背最长肌中饱和脂肪酸C18∶ 0的含量，并有增加不饱和脂肪酸C18∶ 1含量的趋势，可能是因为Arg激活了形成油酸的关键酶——硬脂酰辅酶A^{[ 20 ]}。油酸还可促进背最长肌中葡萄糖的氧化^{[ 21 ]}，从而减少其他组织用于脂肪酸合成的葡萄糖循环^{[ 22 ]}。过高的饱和脂肪酸会转化成胆固醇，引起动脉粥样硬化^{[ 23 ]}。饲粮添加Arg后不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比例得到改善，从而调节了脂肪酸在体内的代谢情况，这与Tan等^{[ 19 ]}的研究结果一致。

饲粮添加Arg可能直接或通过其代谢产物，显著下调肝脏ACCα以及背最长肌ACCα和PPARγ mRNA表达、显著上调肝脏PPARγ mRNA表达；饲粮添加NCG可通过刺激机体内源性Arg产生或其他途径，显著下调肝脏ACCα和LPL mRNA表达以及背最长肌ACCα、FAS和LPL mRNA表达，显著上调PPARγ mRNA表达，显著增加FAS/LPL值。NCG对肝脏PPARγ mRNA表达和FAS/LPL值的调控作用强于Arg。