泰和乌骨鸡原产于江西省泰和县，具有乌皮、乌肉、乌骨等十大特征，是我国特有的珍贵家禽^{[ 1 ]}，它集药、补、食三大功能于一体，对人体具有特殊的滋补功能，可调节生理机能，提高机体的免疫力。泰和乌骨鸡最显著的特征是其体内含有大量的黑色素。《本草纲目》^{[ 2 ]}中记载：乌骨鸡的入药效果与其鸡皮、骨、肉中黑色的深浅有关，其颜色愈黑者，入药愈佳。大量研究表明，乌骨鸡黑色素具有预防癌变与衰老、抗氧化、抗紫外线、提高机体免疫力和调节内分泌等多种功能^{[ 3,4,5,6,7 ]}。

乌骨鸡体内的黑色素是酪氨酸在酶的催化下，经过一系列复杂的生物化学反应而形成的，酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)是黑色素生成的关键酶和限速酶，其基因在体内的表达量和酶活性决定着黑色素合成的速度和产量^{[ 7,8 ]}。酪氨酸酶是一种铜结合金属酶，化学结构为铜结合糖蛋白^{[ 9 ]}，其活性中心由2个含铜离子(Cu²⁺)位点构成^{[ 10 ]}。由此推断，饲粮中铜水平可能会影响乌骨鸡体内黑色素的含量及相关酶(如酪氨酸酶)的活性。目前，国内外尚未见到有关于饲粮铜添加水平对9~12周龄泰和乌骨鸡生产性能、组织黑色素合成及相关指标影响的报道。为此，本试验旨在通过研究饲粮铜添加水平对9~12周龄泰和乌骨鸡生产性能和组织黑色素含量及相关酶活性的影响，为确定泰和乌骨鸡饲粮适宜铜添加水平和饲养标准的制定提供参考依据。 1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计

选用健康、体重相近的57日龄泰和乌骨鸡270只，随机分成6组，每组3个重复，每个重复15只鸡，采用单因子试验设计方法，饲喂在基础饲粮中分别添加0、5、15、30、60、125 mg/kg铜的饲粮，饲养至84日龄，试验期4周。铜源为饲料级硫酸铜(CuSO₄·5H₂O，纯度98%，含铜25%)。

基础饲粮参考NRC(1999)家禽营养需要和本实验室以往泰和乌骨鸡营养需要研究结果进行配制，其组成及营养水平见表1，基础饲粮中铜含量为4.80 mg/kg(实测值)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 原料 Ingredients 含量 Content 营养水平 Nutrient levels 含量 Content 玉米 Corn 70.5 代谢能 ME/(MJ/kg) 12.05 豆粕 Soybean meal 20.0 粗蛋白质 CP 17.05 鱼粉 Fish meal 1.0 钙 Ca 0.94 菜籽粕 Rapeseed meal 5.0 有效磷 AP 0.51 磷酸氢钙 CaHPO4 1.7 蛋氨酸 Met 0.30 石粉 Limestone 1.0 铜 Cu/(mg/kg)2) 4.80 食盐 NaCl 0.3 预混料 Premix1) 0.5 合计 Total 100.0 1)预混料可为每千克饲粮提供The premix provides the following per kg of the diet：VA 5 500 IU，VD3 650 IU，VE 35 mg，VK3 2.5 mg，核黄素 riboflavin 7.5 mg，泛酸 pantothenic acid 18.6 mg，尼克酸 niacin 45.0 mg，生物素 biotin 0.25 mg，VB12 100 μg，Mn 180 mg，Fe 240 mg，Zn 120 mg，I 0.3 mg，Se 0.5 mg。 2)实测值Determined values。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

试验于2010年7月6日至2010年8月2日在江西农业大学动物科技学院动物营养研究基地进行。试验各组饲养条件完全相同。采取随机分层立体饲养，自由采食，自由饮水。定期清理打扫鸡舍卫生并消毒，每天冲洗饮水器。 1.4 测定指标与方法 1.4.1 生产性能指标

于57、84日龄清晨(空腹12 h)称重，记录各重复的饲料消耗量，计算平均日增重、平均日采食量和料重比。

84日龄时，从每个重复中随机选2只(共36只)健康状况良好、接近平均体重的乌骨鸡，于清晨(空腹12 h)称重后，翅静脉采集血液约5 mL于20 mL EP管中，室温静置30 min后，3 500 r/min离心3 min，取得血清并分装，-20 ℃冰箱保存，用于血清酪氨酸酶活性的测定。

采血后立即宰杀，采集胸肌、皮肤样品后，打开腹腔，取肝脏、肾脏，并剔除上面的结缔组织，各组织取样量2.0 g左右，置于-20 ℃冰箱保存，用于组织中酪氨酸酶活性的测定。测定前取各组织块约0.5 g于冰冷生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入10 mL的小烧杯内。用移液管取9倍组织块重量的预冷的0.86%生理盐水于烧杯中，用眼科小剪刀尽快剪碎组织块，最后用组织捣碎机(10 000 r/min)研磨制成10%组织匀浆，将制备好的10%组织匀浆用低温低速离心机(2 000 r/min)离心10 min，将离心好的匀浆留上清液(弃下面沉淀)后置-20 ℃冰箱保存备用。

酪氨酸酶活性的测定参照李洪武等^{[ 11 ]}和邓君等^{[ 12 ]}的方法，并稍加改进：取0.5 mL 5 mmol/L的L-多巴于5 mL的EP管中，然后加入0.1 mol/L的磷酸盐缓冲液2.4 mL，37 ℃温育10 min后，加入0.1 mL血清或组织匀浆液混匀，立即置于721型分光光度计475 nm处测定吸光度A值(A_{475 nm})，连续读数5 min，并记录。以A_{475 nm}每分钟增加或减少0.001为1个酶活力单位。

组织中黑色素含量参照Ozeki等^{[ 13 ]}的方法，并稍加改进，准确称取组织10 mg于玻璃管，加入90%的Soluene-350溶液10 mL，盖上塞子后放入100 ℃的沸水中水浴，待组织完全溶解完、溶液呈黄色时，立即置于UV755B紫外可见分光光度计500 nm处测定吸光度A值(A_{500 nm})，根据吸光度值比较组织样品的黑色素含量。

所有数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 13.0软件对数据进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较。

由表2可知，泰和乌骨鸡平均日增重和平均日采食量随饲粮铜添加水平的提高呈现先增加后下降的趋势，料重比以30 mg/kg组最低，但各组间均无显著差异(P>0.05)。由此说明，在本试验的铜添加水平范围内，其饲粮水平的变化对9~12周龄泰和乌骨鸡的生产性能无显著影响。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 饲粮铜添加水平对9~12周龄泰和乌骨鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of dietary copper supplemental level on performance of Taihe silky fowls aged 9 to 12 weeks 饲粮铜添加水平 Dietary copper supplemental level/(mg/kg) 平均日增重 Average daily gain/g 平均日采食量 Average daily feed intake/g 料重比 Ratio of feed to gain 0 9.25±1.43 39.17±2.24 4.59±1.31 5 9.86±2.07 40.62±0.10 4.59±0.60 15 9.93±0.88 41.77±0.06 4.32±0.58 30 11.25±0.46 41.97±5.60 3.61±0.06 60 9.50±3.01 40.99±3.87 4.21±0.09 125 8.90±0.86 40.50±2.08 4.30±0.71 同列数据肩标字母相同或无肩标字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P<0.01)。下表同。 In the same column，values with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

表2 饲粮铜添加水平对9~12周龄泰和乌骨鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of dietary copper supplemental level on performance of Taihe silky fowls aged 9 to 12 weeks

由表3可知，除肌肉外，饲粮中添加适量铜水平显著或极显著影响9~12周龄泰和乌骨鸡血清和组织器官中酪氨酸酶活性(P<0.05或P<0.01)，并呈现出随饲粮铜添加水平的提高呈先上升后下降的趋势，且以30 mg/kg组最高。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 饲粮铜添加水平对9~12周龄泰和乌骨鸡血清和组织酪氨酸酶活性的影响 Table 3 Effects of dietary copper supplemental level on tyrosinase activity in serum and tissues of Taihe silky fowls aged 9 to 12 weeks 饲粮铜添加水平 Dietary copper supplemental level/(mg/kg) 血清 Serum/ (U/mL) 肝脏 Liver/ (U/mg prot) 肾脏 Kidney/ (U/mg prot) 皮肤 Skin/ (U/mg prot) 肌肉 Muscle/ (U/mg prot) 0 2.33±0.58Aab 10.40±1.41a 4.00±1.73a 2.00±1.00a 3.67±1.52 5 3.33±1.08Aab 11.50±2.12a 4.10±1.41a 2.33±0.58a 4.00±1.50 15 4.50±1.54Ab 12.00±2.49a 5.33±2.52a 4.67±1.53a 4.33±1.53 30 7.00±2.00Bc 14.50±0.71b 7.67±1.15b 6.33±2.31b 5.50±1.36 60 2.67±1.08Aab 13.00±1.41a 4.00±1.24a 4.67±2.31a 5.00±1.29 125 1.33±0.58Aa 11.30±1.00a 4.33±1.31a 4.00±2.65a 3.62±1.41

表3 饲粮铜添加水平对9~12周龄泰和乌骨鸡血清和组织酪氨酸酶活性的影响 Table 3 Effects of dietary copper supplemental level on tyrosinase activity in serum and tissues of Taihe silky fowls aged 9 to 12 weeks

在血清酪氨酸活性方面，30 mg/kg组极显著高于其他组(P<0.01)，15 mg/kg组显著高于125 mg/kg组(P<0.05)，其他各组之间差异不显著(P>0.05)。

在肝脏、肾脏、皮肤酪氨酸活性方面，30 mg/kg组显著高于其他组(P<0.05)，其他各组之间差异不显著(P>0.05)。

由表4可知，除皮肤外，饲粮中添加适量铜水平显著或极显著影响9~12周龄泰和乌骨鸡组织黑色素的含量(P<0.05或P<0.01)，并呈现出组织黑色素含量随饲粮铜添加水平的提高先升后降的变化趋势，且以30 mg/kg最高。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 饲粮铜添加水平对9~12周龄泰和乌骨鸡不同组织中黑色素含量(A500 nm)的影响 Table 4 Effects of dietary copper supplemental level on melanin content (A500 nm) in different tissues of Taihe silky fowls aged 9 to 12 weeks 饲粮铜添加水平 Dietary copper supplemental level/(mg/kg) 肝脏 Liver 肾脏 Kidney 皮肤 Skin 肌肉 Muscle 0 0.27±0.05a 0.23±0.03a 0.39±0.07 0.11±0.03Aa 5 0.34±0.06a 0.23±0.02a 0.42±0.26 0.19±0.09ABa 15 0.38±0.11a 0.29±0.06a 0.44±0.17 0.28±0.18Bb 30 0.65±0.26b 0.44±0.07b 0.59±0.14 0.74±0.05Cc 60 0.38±0.07a 0.28±0.07a 0.43±0.01 0.13±0.02Aa 125 0.40±0.06a 0.24±0.01a 0.40±0.10 0.13±0.04Aa

表4 饲粮铜添加水平对9~12周龄泰和乌骨鸡不同组织中黑色素含量(A500 nm)的影响 Table 4 Effects of dietary copper supplemental level on melanin content (A500 nm) in different tissues of Taihe silky fowls aged 9 to 12 weeks

在肝脏和肾脏黑色素含量方面，30 mg/kg组显著高于其他组(P<0.05)，其他各组之间差异均不显著(P>0.05)。

在肌肉黑色素含量方面，30 mg/kg组极显著高于其他组(P<0.01)，15 mg/kg组极显著高于0、5、60、125 mg/kg组(P<0.01)，其他各组之间差异均不显著(P>0.05)。 2.4 组织酪氨酸酶活性与组织黑色素含量之间的 相关性

由表5可知，泰和乌骨鸡血清、组织酪氨酸酶活性与组织黑色素含量均呈正相关关系。除血清酪氨酸酶活性与肝脏黑色素含量的相关性以及肌肉酪氨酸酶活性与肌肉黑色素含量的相关性未达显著水平(P>0.05)外，其余指标之间均存在显著或极显著的正相关关系(P<0.05或P<0.01)。

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 泰和乌骨鸡组织酪氨酸酶活性与组织黑色素含量之间的Pearson相关系数 Table 5 Pearson’s correlation coefficients between tyrosinase activity and melanin content in tissues (n=18) 组织酪氨酸酶活性 Tyrosinase activity in tissues 黑色素含量 Melanin content 肝脏 Liver 肾脏 Kidney 皮肤 Skin 肌肉 Muscle 血清 Serum 0.797 7 0.900 7* 0.926 9** 0.941 3** 肝脏 Liver 0.897 9* 肾脏 Kidney 0.958 1** 皮肤 Skin 0.801 0* 肌肉 Muscle 0.753 0 *和* *分别表示相关系数显著性P<0.05和P<0.01 * and * * indicate the significance of correlation coefficient with P<0.05 and P<0.01,respectively.

表5 泰和乌骨鸡组织酪氨酸酶活性与组织黑色素含量之间的Pearson相关系数 Table 5 Pearson’s correlation coefficients between tyrosinase activity and melanin content in tissues (n=18)

回归分析表明，平均日增重、料重比、血清和组织酪氨酸酶活性以及组织黑色素含量均随饲粮铜添加水平的增加而呈二次曲线变化(表6)，但二次曲线回归模型均未达显著水平(P>0.05)。根据上述指标与铜添加水平所拟合的二次曲线回归模型，泰和乌骨鸡组织取得最大酪氨酸酶活性和黑色素含量时饲粮适宜的铜添加水平为50~72 mg/kg。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 指标与饲粮铜添加水平间的二次曲线回归模型 Table 6 Quadratic regression models of indexes vs. copper supplemental level 指标 Indexes 回归模型 Regression model 决定系数 Coefficient (R2) P值 P-value 饲粮铜适宜添加水平 Optimal copper supplemental level/(mg/kg) 平均日增重 Average daily gain Y=4.548 0+0.0253X-0.000 2X2 0.434 3 0.425 5 63.25 料重比 Ratio of feed to gain Y=4.519 0-0.022 5X+0.000 2X2 0.637 9 0.217 9 56.25 血清酪氨酸酶活性 Serum tyrosinase activity Y=3.175 5+0.014 4X-0.000 2X2 0.5794 0.420 6 36.00 肝脏酪氨酸酶活性 Liver tyrosinase activity Y=10.916 3+0.095 7X-0.000 7X2 0.696 3 0.167 4 68.36 肾脏酪氨酸酶活性 Kidney tyrosinase activity Y=4.513 3+0.040 6X-0.000 4X2 0.167 8 0.759 1 50.75 皮肤酪氨酸酶活性 Skin tyrosinase activity Y=2.501 5+0.101 4X-0.000 7X2 0.608 1 0.245 3 72.43 肌肉酪氨酸酶活性 Muscle tyrosinase activity Y=3.775 2+0.051 9X-0.000 4X2 0.840 4 0.063 8 64.88 肝脏黑色素含量 Melanin content in liver Y=0.322 9+0.005 7X-0.000 04X2 0.293 4 0.594 0 71.25 肾脏黑色素含量 Melanin content in kidney Y=0.243 5+0.003 7X-0.000 03X2 0.385 3 0.481 9 61.67 皮肤黑色素含量 Melanin content in skin Y=0.414 5+0.003 0X-0.000 03X2 0.332 4 0.545 5 50.00 肌肉黑色素含量 Melanin content in muscle Y=0.204 0+0.007 0X-0.000 06X2 0.210 8 0.701 1 58.33

表6 指标与饲粮铜添加水平间的二次曲线回归模型 Table 6 Quadratic regression models of indexes vs. copper supplemental level

铜作为动物体内多种酶的辅助因子，与动物健康的密切关系早已引起专家学者的深切关注。自从发现高铜可以提高育肥猪的生产性能以来，许多学者研究了高铜对动物生产性能的影响，家禽方面也不例外，但有关家禽对铜的需要量试验报道结果存在较大差异。吴建设等^{[ 11 ]}的研究结果表明，饲粮中铜添加水平可显著影响1日龄艾维茵肉仔鸡的生产性能。吴觉文等^{[ 12 ]}研究发现，高剂量铜对试验仔鸡前期没有明显的促生长作用，对后期的生长有促进作用。胡叶华^{[ 13 ]}研究认为，饲粮含铜25 mg/kg能改善产蛋性能，75~150 mg/kg能显著增加肉鸡体增重。本课题组前期研究发现，饲粮添加适量铜能够显著提高5~8周龄泰和乌骨鸡的生产性能，当添加量为30 mg/kg时，泰和乌骨鸡的生产性能达到最佳水平^{[ 14 ]}。本试验结果表明，基础饲粮(本底铜含量为4.80 mg/kg)中添加0、5、15、30、60、125 mg/kg铜，无论是平均日增重还是饲料转化率，饲粮中铜添加水平均未对9~12周龄泰和乌骨鸡产生显著影响。常新耀等^{[ 15 ]}研究认为，在玉米-豆粕型饲粮中添加不同水平的硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)，试验鸡各阶段及整个试验期的生产性能没有随饲粮铜水平的增加而有明显改善，与对照组相比差异均不显著。周桂莲等^{[ 16 ]}研究发现肉仔鸡对铜的需要量因发育阶段、品种等不同而存在差异，鸡对铜的需要量因品种、生产目的、分析指标和测定方法不同而各异。本试验结果与常新耀等^{[ 15 ]}、周桂莲等^{[ 16 ]}、本课题组前期研究^{[ 14,17 ]}结果相一致，即饲粮添加铜(5~125 mg/kg)对1~4周龄泰和乌骨鸡生产性能无显著影响。产生这些结果的原因主要可能与家禽品种、动物周龄、饲粮种类、铜摄入量及其他营养物质水平高低有关。

泰和乌骨鸡组织黑色素是由酪氨酸经酪氨酸酶的作用，经过复杂的生物转化形成而来。酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶和关键酶，至少具有酪氨酸羟化酶和多巴氧化酶2种活性，酪氨酸酶在体内的活性和表达量决定黑色素合成的速度和产量，高水平的酪氨酸酶活性导致真黑素产生^{[ 18 ]}。多年以来，酪氨酸酶一直受到国内外学者的关注，其研究涉及到多个学科和领域。根据杨舒黎等^{[ 19 ]}对云南乌骨羊酪氨酸酶的分析可知，较高水平的酪氨酸酶可以导致大量黑色素的产生，从而导致乌骨羊乌骨、乌肉、乌血。酪氨酸酶是一个以铜离子为辅基的金属酶，其辅基铜离子为该酶活性所必需，该酶分子中含有2个铜离子的结合位置。铜缺乏动物酪氨酸酶的活性下降，从而使酪氨酸转化为黑色素的催化过程受阻，黑色素的合成减少，导致皮肤与毛发色泽减退^{[ 20 ]}。郭德威等^{[ 21 ]}研究表明，当铜离子遭到作为配位体的无机阴离子封阻时酪氨酸酶的活性将受到不同程度的抑制，而且对铜离子的封阻作用愈强，对酪氨酸酶活性的抑制作用就愈大。陈丽凤等^{[ 22 ]}研究发现，在一定浓度范围内，铜离子能够上调酪氨酸酶活性，但铜离子浓度超过一定范围时，则抑制酪氨酸酶活性，且抑制作用随铜离子浓度的增加而增强。本研究发现，饲粮添加一定水平的铜能够显著提高乌骨鸡机体内酪氨酸酶的活性，且组织酪氨酸酶活性随饲粮铜水平的增加呈先上升后下降的趋势。不同组织达到最佳酪氨酸酶活性时饲粮铜适宜添加水平有所不同(50~72 mg/kg)。本试验结果与郭德威等^{[ 21 ]}、陈丽凤等^{[ 22 ]}的研究结果一致。相应地，乌骨鸡组织黑色素含量随饲粮铜添加水平变化趋势与组织酪氨酸酶活性的变化趋势相一致。酪氨酸酶是机体黑色素合成的关键酶和限速酶，其基因在体内的表达量和酶活性决定着黑色素合成的速度和产量^{[ 9,23 ]}。本研究结果表明，泰和乌骨鸡血清、组织酪氨酸酶活性与组织黑色素含量呈显著的正相关关系。由此提示，在适宜铜添加水平内，饲粮添加铜可通过提高血液和组织酪氨酸酶活性并进而提高组织黑色素的合成。

① 饲粮添加铜(5~125 mg/kg)对9~12周龄的泰和乌骨鸡生产性能无显著影响。

② 饲粮中添加适宜水平的铜可显著提高组织酪氨酸酶活性和组织黑色素含量。

③ 乌骨鸡维持组织最佳黑色素沉积时，玉米-豆粕型饲粮适宜铜添加水平为50~72 mg/kg。