锌是仔猪的必需微量元素之一，补锌对增强断奶仔猪抗病能力和改善其生长性能具有重要作用。乳酸锌是一种新型有机锌盐，具有性质稳定、水溶性好、易吸收的特点，已成为仔猪生产中的重要有机锌源^[1]。乳酸锌具有促进动物生长发育和增强免疫功能等作用，可诱导机体金属硫蛋白(metallothioneins,MTs) mRNA表达上调，研究乳酸锌对仔猪组织急性期蛋白(acrte phase protein，APP)的影响和小肠保护作用具有重要科学意义。Castillo等^[2]研究发现，乳酸锌具有促进动物生长和预防断奶仔猪腹泻的作用。而Vahjen等^[3]报道，以氧化锌为锌源在饲粮中添加膳食锌有利于改善仔猪肠道健康。Philcox等^[4]研究表明在饲粮缺锌的情况下大鼠体内MTs含量降低。以氧化锌为锌源在饲粮中添加3 000 mg/kg的锌显著提高仔猪肝脏中MTs的含量^[5]，有利于预防断奶仔猪发生腹泻^[6]。早期断奶仔猪免疫功能不健全，病原微生物容易侵袭机体，从而导致仔猪发生疾病。Nabuurs等^[7]提出，小肠结构与腹泻之间具有密切关系，断奶后仔猪小肠绒毛长度变短、隐窝加深，导致消化吸收功能紊乱。早期断奶使仔猪处于强烈应激状态，可能引起MTs和APP的分泌量发生改变，对仔猪的肠道健康产生影响。本试验旨在研究乳酸锌对“杜洛克×长白×约克”(duroc×landrace×york,DLY)仔猪小肠形态学的影响，探索乳酸锌对仔猪组织金属硫蛋白1(MT1)和APP mRNA表达的诱导表达作用，为乳酸锌的应用提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 试验设计

试验选用初始体重为(7.5±0.5) kg的35日龄健康DLY仔猪24头(公母各占1/2)，试验猪随机分为对照组和试验组，每组12个重复，每个重复1头猪。对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂在基础饲粮中添加乳酸锌，使锌添加量达到100 mg/kg的试验饲粮。试验期为25 d。

参照NRC(2012)猪营养需要推荐量配制基础饲粮，基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % 项目 Items 含量 Content 原料 Ingredients 玉米 Corn 65.94 豆粕 Soybean meal 22.76 大豆浓缩蛋白 Soy protein concentrate 5.00 米糠 Rice Bran 1.88 葡萄糖 Glucose 0.60 豆油 Soybean oil 0.40 磷酸氢钙 CaHPO4 1.26 石粉 Limestone 0.54 食盐 NaCl 0.30 赖氨酸 Lys 0.27 蛋氨酸 Met 0.05 预混料 Premix1) 1.00 合计 Total 100.00 营养水平 Nutrient levels2) 消化能 DE/(MJ/kg) 14.32 粗蛋白质 CP 19.00 钙 Ca 0.60 有效磷 Ap 0.38 赖氨酸 Lys 1.15 蛋氨酸+半胱氨酸 Met+Cys 0.65 苏氨酸 Thr 0.77 色氨酸 Trp 0.21 锌 Zn/(mg/kg) 25.42 1)预混料为每千克饲粮提供The premix provided the following per kg of diet:Fe (FeSO4·7H2O) 100 mg，Cu (CuSO4·5H2O) 60 mg，Mn (MnSO4·H2O) 40 mg，Se (Na2SeO3·5H2O) 0.3 mg，I (KI) 0.14 mg，VA 1 750 IU，VD3 200 IU，VE 11 IU,VK3 0.50 mg，VB6 1.50 mg，VB12 15.00 μg，生物素 biotin 0.05 mg，胆碱 choline 0.40 mg，叶酸 folic acid 0.30 mg，烟酸 nicotinic acid 12.50 mg，泛酸 pantothenic acid 9.00 mg，核黄素riboflavin 3.00 mg，硫胺素 thiamine 1.00 mg，亚油酸 linoleic acid 10.00 mg。 2)消化能为计算值，其余为实测值。DE was a calculated value， while the others were measured values.

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

试验猪饲喂时间为每天的08:00、12:00、16:00和20:00，每次喂料量以料槽中有少量余料为宜，自由饮水。猪舍温度25～28 ℃，舍内相对湿度65%～70%。

测定试验开始和结束时试验猪体重，统计采食量，计算平均日增重、平均日采食量、料重比和腹泻率。其中腹泻率计算公式如下：

试验结束时，屠宰所有试验猪，共24头。迅速采集十二指肠、空肠和回肠中段3 cm左右，保存于福尔马林中，参照陈恒灿等^[8]的方法进行处理和观察小肠形态学变化。

在屠宰后15 min内采集肝脏、胰脏、脾脏、肾脏、十二指肠、空肠和回肠7种组织，液氮速冻，-80 ℃保存，用于检测MT1、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、触珠蛋白(haptoglobin,HP)、α1-酸性糖蛋白(α1-acid glycoprotein,AGP)和血清淀粉样蛋白A(serum amyloid-A protein,SAA) mRNA表达量。 1.3.4 实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)

本试验RT-qPCR采用Eva GreenⅠ染料法，反应在RT-qPCR仪(CFX96^TM Real-Time System,Bio-Rad公司)上进行。按照预先筛选好的RT-qPCR反应条件和体系进行扩增。RT-qPCR反应体系为20 μL：SsoFast^TM EvaGreen Supermix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA模板2 μL，然后加灭菌去离子水至20 μL。常规PCR反应条件：预变性94 ℃ 3 min；变性94 ℃ 30 s、退火30 s、延伸 72 ℃ 1 min、循环数33；延伸72 ℃ 10 min。目的基因MT1、CRP、HP、AGP、SAA、18S rRNA、β肌动蛋白(β-actin)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的退火温度分别为57.0、57.0、57.9、57.1、55.5、52.0、57.0和55.7 ℃。基因引物设计采用引物设计系统(PE Applied Biosystems公司)。各基因引物序列见表2。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 实时荧光定量PCR引物 Table 2 Primers for RT-qPCR 目的基因 Target genes 引物序列 Primer Sequences (5′—3′) 产物长度 Product size/bp 基因库序列号 GenBank No. β-肌动蛋白 β-actin 上游 Forward 下游 Reserve TCTGGCACCACACCTTCT TGATCTGGGTCATCTTCTCAC 114 XM_003124280 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH 上游 Forward 下游 Reserve ACATCAAGAAGGTGGTGAAG ATTGTCGTACCAGGAAATGAG 178 AF017079.1 18S rRNA 上游 Forward 下游 Reserve GCGGCTTTGGTGACTCTA CTGCCTCCTTGGATGTG 194 AF518197.1 C-反应蛋白 CRP 上游 Forward 下游 Reserve CAGATTCTGGGAACGGTGAC CAGGAGGCACCTTTGGGATT 115 NM_213844 触珠蛋白 HP 上游 Forward 下游 Reserve CTTGTGGGCTACGTGTCTGG CTCTTGGGTGTCTTCTTCTCTGG 120 NM_214000 α1-酸性糖蛋白 AGP 上游 Forward 下游 Reserve CCACAAGTCAGAAATCACATACACC CTCCTTCTCCTTCTCCTTCTTCCT 116 XM_001928727 血清淀粉样蛋白A SAA 上游 Forward 下游 Reserve CCCCAACCACTTCAGACCT AGGCAGCTCAGTACTTGTC 117 NM_001044552 金属硫蛋白1 MT1 上游 Forward 下游 Reserve CTGCACGTGCAAAGCCTGC CTTCCCCAGACTTCAGGCA 144 NM_001001266

表2 实时荧光定量PCR引物 Table 2 Primers for RT-qPCR

小肠组织的MT1以β-actin为内参基因进行相对定量，APP均是以18S rRNA、GAPDH和β-actin共同为内参基因进行相对定量。MT1基因的研究已经较多，本试验参考前人研究采用β-actin作为内参；APP的研究报道较少，为保证结果的尽量准确则以18S rRNA、GAPDH和β-actin共同为内参基因进行校正。结果以mRNA表达量来表示，相对荧光定量计算方法采用Pfaffl^[9]方法计算。所有数据均采用Excel 2003进行整理，采用SPSS 17.0统计软件进行统计处理，各组织间的mRNA表达量采用Duncan氏法进行多重比较。

由表3可见，添加乳酸锌显著提高了仔猪平均日增重和平均日采食量(P<0.05)，显著降低了料重比(P<0.05)；对腹泻率没有显著影响(P>0.05)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 乳酸锌对仔猪生长性能的影响 Table 3 Effects of zinc lactate on growth performance of piglets 项目 Items 平均日增重 Average daily gain/g 平均日采食量 Average daily feed intake/g 料重比 Feed/gain 腹泻率 Diarrhea rate/% 对照组 Control group 299.62±19.18 601.23±27.59 2.01±0.12 8.36 试验组 Experimental group 339.88±23.74* 652.12±21.26* 1.92±0.14* 3.02 *表示差异显著(P<0.05)，* *表示差异极显著(P<0.01)。下表同。 * mean significant difference (P<0.05), and * * mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.

表3 乳酸锌对仔猪生长性能的影响 Table 3 Effects of zinc lactate on growth performance of piglets

由表4可见，在饲粮中添加乳酸锌，极显著增加了仔猪十二指肠、空肠和回肠的绒毛长度(P<0.01)，极显著降低了隐窝深度(P<0.01)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 乳酸锌对仔猪小肠形态学的影响 Table 4 Effects of zinc lactate on intestinal morphology of piglets 组织 Tissues 指标 Indices 对照组 Control group 试验组 Experimental group 十二指肠 Duodenum 绒毛长度 VL/μm 421.50±40.48 520.36±45.44** 隐窝深度 CD/μm 298.38±19.36 243.41±20.36** 绒毛长度/隐窝深度 VL/CD 1.41±0.10 2.13±0.13** 空肠 Jejunum 绒毛长度 VL/μm 355.50±31.46 447.47±39.44** 隐窝深度 CD/μm 244.28±21.28 216.33±19.38** 绒毛长度/隐窝深度 VL/CD 1.45±0.11 2.06±0.12** 回肠 Ileum 绒毛长度 VL/μm 329.47±29.45 439.40±38.38** 隐窝深度 CD/μm 234.63±19.37 210.58±18.50** 绒毛长度/隐窝深度 VL/CD 1.40±0.12 2.08±0.11**

表4 乳酸锌对仔猪小肠形态学的影响 Table 4 Effects of zinc lactate on intestinal morphology of piglets

由图1可知，空肠MT1 mRNA表达量极显著高于十二指肠和回肠(P<0.01)，十二指肠和回肠间MT1 mRNA表达差异不显著(P>0.05)。添加乳酸锌显著或极显著提高了十二指肠、空肠和回肠MT1 mRNA表达量(P<0.05或P<0.01)。

图 1(Figure 1)

Fig. 1

图1 仔猪小肠中MT1 mRNA表达趋势 Fig.1 Expression trend of MT1 mRNA in small intestine of piglets

由图2可见，胰脏的CRP mRNA表达量极显著高于其他组织(P<0.01)，空肠和回肠CRP mRNA表达量极显著低于其他组织(P<0.01)。添加乳酸锌极显著提高了肝脏、肾脏、胰腺、脾脏、十二指肠、空肠和回肠CRP mRNA表达量(P<0.01)。

图 2(Figure 2)

Fig. 2

图2 仔猪不同组织中CRP mRNA表达趋势 Fig.2 Expression trend of CRP mRNA in different tissues of piglets

由图3可见，肝脏、肾脏和胰脏的HP mRNA表达量极显著高于其他组织(P<0.01)，脾脏、十二指肠、空肠和回肠HP mRNA表达量极显著低于其他组织(P<0.01)。添加乳酸锌极显著提高了肝脏、肾脏、胰腺、脾脏、十二指肠、空肠和回肠HP mRNA表达量(P<0.01)。

图 3(Figure 3)

Fig. 3

图3 仔猪不同组织中HP mRNA表达趋势 Fig.3 Expression trend of HP mRNA in different tissues of piglets

由图4可见，胰脏的AGP mRNA表达量极显著高于其他组织(P<0.01)，脾脏AGP mRNA表达量极显著低于其他组织(P<0.01)。添加乳酸锌极显著提高了肝脏、胰腺、脾脏、十二指肠和回肠AGP mRNA表达量(P<0.01)；但添加乳酸锌极显著降低了肾脏和空肠AGP mRNA表达量(P<0.01)。

图 4(Figure 4)

Fig. 4

图4 仔猪不同组织中AGP mRNA表达趋势 Fig.4 Expression trend of AGP mRNA in different tissues of piglets

由图5可见，空肠的SAA mRNA表达量极显著高于除胰腺的其他组织(P<0.01)，脾脏SAA mRNA表达量极显著低于其他组织(P<0.01)。添加乳酸锌极显著提高了肝脏、脾脏、肾脏、胰腺、十二指肠和回肠SAA mRNA表达量(P<0.01)；但添加乳酸锌极显著降低了空肠SAA mRNA表达量(P<0.01)。

图 5(Figure 5)

Fig. 5

图5 仔猪不同组织中SAA mRNA表达趋势 Fig.5 Expression trend of SAA mRNA in different tissues of piglets

由图6可见，对照组肝脏、肾脏和胰腺中CRP、HP、AGP、SAA mRNA表达量均较高，脾脏中这4个mRNA均微量表达。小肠中除十二指肠SAA，空肠AGP、SAA，回肠SAA mRNA表达较高外，其他均为微量表达。对照组(图6-a图)表达谱中以胰腺的CRP mRNA的表达量最高，其次是空肠的SAA mRNA的表达量。试验组(图6-b图)CRP、HP、AGP、SAA mRNA在大部分组织中表达量都上升，脾脏除CRP外其他3个mRNA微量表达。小肠组织中除十二指肠中HP、SAA，空肠中AGP、SAA，回肠CRP、AGP和SAA mRNA表达量较高外，其他均微量表达。b图表达谱中，以胰腺的HP mRNA表达量最高，其次是胰腺的CRP mRNA表达量。

图 6(Figure 6)

Fig. 6

图6 CRP、HP、AGP和SAA mRNA在仔猪不同组织中表达谱 Fig.6 The expression profiles of CRP, HP, AGP and SAA mRNA in different tissues of piglets

本试验结果显示，在饲粮中添加乳酸锌，断奶仔猪腹泻率降低了63.8%，平均日增重增加了13.4%，平均日采食量增加了8.5%，料重比降低了4.5%。这一结果与Castillo等^[2]研究乳酸锌对断奶仔猪促生长和预防腹泻的报道一致。结果显示，乳酸锌是改善仔猪生长性能的有效锌源。

在饲粮中添加乳酸锌，极显著增加了仔猪十二指肠、空肠和回肠绒毛长度，明显降低了隐窝深度。Carlson等^[10]研究发现，高剂量氧化锌能增加断奶仔猪的小肠中MTs含量，从而增加肠道膜抗氧化能力，维持小肠刷状缘膜完整性，但添加高剂量锌可导致环境污染。与Vahjen等^[3]和Carlson等^[10]报道锌有利于改善仔猪肠道健康一致，本试验结果表明，乳酸锌明显改善了仔猪的肠道健康状况。本试验乳酸锌添加量较低，表明在断奶仔猪饲粮应用乳酸锌可降低环境污染。 3.3 小肠黏膜MT1 mRNA表达规律

小肠是消化吸收饲料养分的主要场所，也是机体重要的免疫器官。本次试验结果发现，添加乳酸锌时，仔猪十二指肠、空肠和回肠MT1 mRNA mRNA表达量分别为对照组的1.58、2.07和1.44倍。断奶仔猪小肠组织中MT1 mRNA表达量由高到低依次为：空肠、十二指肠、回肠。本研究结果与Philcox等^[4]、许梓荣等^[5]和韩国全等^[1]报道一致。在饲粮中添加乳酸锌，显著提高了断奶仔猪MT1 mRNA在小肠黏膜中的表达水平。结果提示，乳酸锌诱导仔猪小肠黏膜MT1 mRNA表达上调是保护仔猪肠道健康的一种重要方式。

在仔猪的各个组织中均检测到CRP mRNA的存在。试验组仔猪组织中CRP mRNA的表达量明显高于对照组，其中胰腺、肾脏和回肠提高尤为显著。试验组仔猪CRP mRNA表达量由高到低依次为：胰腺、肾脏、回肠、肝脏、脾脏、空肠和十二指肠。其中，胰腺mRNA表达量最高，十二指肠mRNA表达量最低。对照组仔猪CRP mRNA表达量由高到低依次为：胰腺、肝脏、肾脏和空肠。胰腺mRNA表达量最高，脾脏、十二指肠和回肠mRNA微量表达。杨照勇等^[11]认为，CRP是机体重要的防御分子。结合本试验结果，乳酸锌诱导组织CRP mRNA表达上调，可能是改善断奶仔猪健康的一种重要方式。

HP是仔猪健康状态的重要标识之一。本研究表明，添加乳酸锌，仔猪HP mRNA表达量明显高于对照组。试验组仔猪HP mRNA表达量由高到低依次为：胰腺、肾脏、肝脏、十二指肠、回肠、空肠和脾脏。其中，胰腺mRNA表达量最高，而脾脏mRNA微量表达。对照组HP mRNA表达量由高到低依次为：肝脏、胰腺、肾脏、十二指肠和空肠。肝脏mRNA表达量最高，脾脏和回肠mRNA微量表达。Langlois等^[12]研究表明结合珠蛋白还具有重要的免疫调节功能。结合珠蛋白具有结合血红蛋白、抗感染、促进血管生成等作用^[13]。HP mRNA表达量变化提示饲粮添加乳酸锌有利于仔猪免疫力的增强。

张建江等^[14]报道，细菌感染者AGP mRNA表达量明显增高，由此推测AGP mRNA表达量的增高有利于提高机体的抗病力。试验组HP mRNA表达量由高到低依次为：胰腺、回肠、肝脏、肾脏、空肠、十二指肠和脾脏。其中，胰腺mRNA表达量最高，而脾脏mRNA微量表达。对照组AGP mRNA表达量由高到低依次为：胰腺、回肠、肾脏、空肠、肝脏、回肠和十二指肠。胰腺mRNA表达量最高，脾脏mRNA微量表达。本试验结果表明，试验组仔猪组织AGP mRNA表达量明显高于对照组，但肾脏和空肠AGP mRNA表达量低于对照组，结果提示，AGP对不同组织作用方式可能存在差异。

许美芳等^[15]报道，SAA在机体发生炎症的保护性防御中发挥重要作用。本试验结果显示，添加乳酸锌时，仔猪大部分组织SAA mRNA表达量明显高于对照组，但空肠组织SAA mRNA表达量低于对照组；仔猪SAA mRNA表达量由高到低依次为：肾脏、空肠、肝脏、胰腺、十二指肠、回肠和脾脏。其中，肾脏mRNA表达量最高，脾脏mRNA表达量最低。未添加乳酸锌时，仔猪组织SAA mRNA表达量由高到低依次为：空肠、肝脏、回肠、十二指肠、肾脏和胰腺。空肠mRNA表达量最高，脾脏mRNA微量表达。结合本试验结果，乳酸锌对组织SAA mRNA的诱导表达可能是影响机体防御能力的方式之一。

综上所述，APP是仔猪健康的重要标识，可为仔猪健康和疾病诊断提供科学信息，不同组织APP mRNA表达差异与其生物学作用密切相关。在仔猪饲粮中添加乳酸锌，极显著增加了小肠绒毛长度和降低隐窝深度，显著提高了小肠黏膜MT1 mRNA表达水平，乳酸锌对仔猪肠道具有保护作用；通过乳酸锌诱导仔猪组织CRP、HP、AGP和SAA mRNA表达上调，可增强仔猪抗病能力，从而改善仔猪的生长性能。 4 结 论

① 饲粮中添加乳酸锌，极显著增加仔猪小肠绒毛长度和降低隐窝深度。乳酸锌改善仔猪肠道健康，促进饲料养分的消化吸收和利用。

② 饲粮中添加乳酸锌可诱导仔猪十二指肠、空肠和回肠黏膜MT1 mRNA表达上调，促进锌的转运。

③ 饲粮中添加乳酸锌，可诱导仔猪组织CRP、HP、AGP和SAA mRNA表达上调；其中以胰腺、肝脏、肾脏和空肠表达量较高。本研究结果显示，乳酸锌诱导机体APP mRNA表达上调，可能是影响仔猪肠道和机体健康的重要方式之一。