近年来，我国水产养殖业迅猛发展，养殖模式趋于集约化，经常出现饲料营养不平衡造成养殖鱼类营养代谢病(如脂肪肝)以及各种应激引起的机体抗氧化能力降低的现象，导致机体健康水平低下，使生长受阻，甚至造成死亡，严重影响养殖业的经济效益。通过在饲料中添加能调节血脂水平和增强抗氧化能力的天然活性物质来提高机体的健康状况，对提高养殖效益具有重要的现实意义。葡多酚(grape proanthocyanidins,GPC)又称葡萄原花青素，是存在于葡萄中的一种具有生物活性的天然植物多酚，在葡萄的皮、籽中含量丰富，现已可进行规模化生产。近年来，大量研究证实GPC具有降血脂、抗氧化、抗辐射、保护心血管及免疫调节等多种生物学活性，其中降血脂和抗氧化是最为重要的生物学活性，可提高机体的健康水平[ 1,2,3,4 ]。GPC在动物饲粮中的应用仅见于肉仔鸡方面的报道，研究发现适量添加GPC可促进肉仔鸡生长，提高日增重，降低料重比[ 5,6 ]。GPC在鱼类饲料中的应用还鲜见报道，其降血脂和抗氧化作用的效果也有待研究。因此，本试验拟在吉富罗非鱼(genetic improvement of farmed tilapia，GIFT，Oreochromis niloticus)饲料中添加GPC，探讨其对吉富罗非鱼生长性能、肠道消化酶活性、血脂水平和肝胰脏抗氧化能力的影响，为GPC作为水产饲料添加剂的应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与试验设计试验在集美大学水产学院鱼类养殖试验场进行，试验用吉富罗非鱼购于福建省漳州市水产开发中心。暂养2周后，将300尾健康无病、规格均匀、平均体重为(8.25±0.07) g的吉富罗非鱼随机分为5组(每组4个重复，每个重复15尾鱼)，分别投喂在基础饲料中添加0(对照组)、200、400、600和800 mg/kg GPC(购于南京泽朗医药科技有限公司，含量为98%)的试验饲料。试验期为7周。
1.2 基础饲料与饲养管理基础饲料根据SC/T 1025—2004《罗非鱼配合饲料》配制，其组成及营养水平见表1。所有饲料原料粉碎过40目筛，混合均匀后挤压成直径为3 mm的颗粒料，自然风干后置于自封袋中，-20 ℃冷冻保存。
 | 表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) % |
试验鱼以重复为单位饲养于120 cm×60 cm×70 cm的水族箱中，实际水体积约为100 L，开循环水系统，24 h充气。日投饵量为鱼体重的3.0%～5.0%，每日投喂3次(08:00、13:00和18:00)，每次饱食投喂，饲料基本无浪费。投喂30 min后吸取残饵和粪便，日换水量为30%。试验用水为曝气自来水，光照为自然光源，增氧机持续增氧。每天监测水质状况，试验期间水温22～28 ℃，pH 7.5±0.3，溶氧浓度>7.0 mg/L，氨氮浓度<0.2 mg/L。
1.3 样品采集与组织匀浆的制备试验结束后，禁食24 h，捞取每个水族箱中所有试验鱼称总重；每重复随机选择6尾规格一致的试验鱼，麻醉后尾静脉取血，采集后立即离心(3 000 r/min，10 min)，取血清保存于-80 ℃冰箱。采血后的试验鱼解剖，取肝胰脏和肠道，液氮速冻后-80 ℃冷冻保存。
将保存于-80 ℃的肝脏和肠道组织样品在冰上解冻，取组织块1～3 g在0.86%冰冷生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入匀浆玻璃管中，按比例(1 g样品∶ 10 mL生理盐水)加入0.86%冰冻生理盐水，用玻璃匀浆机匀浆(10 s/次，间隙30 s，连续3～5次)。将制备好的10%组织匀浆在4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液分装到1.5 mL离心管中。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 生长指标生长指标计算公式如下:
增重率(weight gain rate,WGR,%)=100×(Wt-W0)/W0； 特定生长率(specific growth rate,SGR,%/d)=100×(lnWt－lnW0)/t； 饲料系数(feed conversion ratio,FCR,)=F/(Wt-W0)； 摄食率(feeding rate,FR,%)=100×F/>[(W0+Wt)/2]/t； 日摄食量(daily feed intake,DFI,g/尾)=F/t； 存活率(survival rate,SR,%)=100×Nf/Ni。式中：W0为初始体重(initial body weight,IBW)，g/尾；Wt为终末体重(final body weight,FBW)，g/尾；F为平均每尾鱼摄食饲料总量(风干样重)，g；t为饲喂天数，d；Ni为初始鱼尾数，尾；Nf终末鱼尾数，尾。
1.4.2 肠道消化酶活性肠道蛋白酶活性的测定采用福林-酚试剂法，以磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液调节pH，680 nm处测吸光度值。肠道脂肪酶和淀粉酶活性采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定。
1.4.3 血脂水平采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒测定血清总胆固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平。
1.4.4 肝胰脏抗氧化指标肝胰脏总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过 氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒进行测定。
1.5 统计与分析所有试验数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示，用SPSS 17.0分析软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，若存在显著差异，则采用Duncan氏法进行多重比较，P<0.05表示差异显著。
2 结 果 2.1 饲料中添加GPC对吉富罗非鱼生长性能的影响由表2可知，各GPC添加组的FBW、WGR、SGR和DFI均显著高于对照组(P<0.05)，FCR则显著低于对照组(P<0.05)，各GPC添加组间无显著差异(P>0.05)。各组间FR和SR无显著差异(P>0.05)。
| 表2 饲料中添加GPC对吉富罗非鱼生长性能的影响 Table 2 Effects of GPC supplementation on growth performance of GIFT |
由表3可知，各GPC添加组肠道脂肪酶和蛋白酶活性均显著高于对照组(P<0.05)，各GPC添加组间无显著差异(P>0.05)。各组间肠道淀粉酶活性无显著差异(P>0.05)。
| 表3 饲料中添加GPC对吉富罗非鱼肠道消化酶活性的影响 Table 3 Effects of GPC supplementation on intestinal digestive enzyme activities of GIFT U/mg prot |
由表4可知，400、600和800 mg/kg添加组血清TC和LDL-C水平显著低于对照组(P<0.05)，400、600和800 mg/kg添加组间无显著差异(P>0.05)。各GPC添加组血清TG水平均显著低于对照组(P<0.05)，各GPC添加组间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，各GPC添加组血清HDL-C水平均显著升高(P<0.05)，各GPC添加组间无显著差异(P>0.05)。
| 表4 饲料中添加GPC对吉富罗非鱼血脂水平的影响 Table 4 Effects of GPC supplementation on serum lipid levels of GIFT mmol/L |
2.4 饲料中添加GPC对吉富罗非鱼肝胰脏抗氧化能力的影响
由表5可知，各GPC添加组肝胰脏T-AOC和CAT活性均显著高于对照组(P<0.05)，各GPC添加组间无显著差异(P>0.05)。饲料中添加GPC后肝胰脏GSH-Px活性升高，且在添加水平为600和800 mg/kg时达到显著水平(P<0.05)，600和800 mg/kg添加组间无显著差异(P>0.05)。随GPC添加水平的升高，肝胰脏SOD活性呈先升高后降低趋势，在200 mg/kg添加组达到最高，显著高于除400 mg/kg添加组外的其他组(P<0.05)。与对照组相比，各GPC添加组肝胰脏MDA含量均显著降低(P<0.05)，以800 mg/kg添加组的含量最低，显著低于其他GPC添加组(P<0.05)。
| 表5 饲料中添加GPC对吉富罗非鱼肝胰脏抗氧化能力的影响 Table 5 Effects of GPC supplementation on hepatopancreas antioxidant capacity of GIFT |
本研究结果显示，饲料中添加200～800 mg/kg GPC可显著提高吉富罗非鱼的WGR和SGR，并显著降低FCR，表明饲料中添加GPC能促进吉富罗非鱼的生长，提高饲料利用率；以400 mg/kg添加组的WGR最高，200 mg/kg添加组的FCR最低，从统计结果的差异显著性及添加成本考虑，建议在吉富罗非鱼饲料中添加200 mg/kg的GPC。目前，GPC在鱼类饲料中的应用研究较少，仅见于未明确GPC含量的复合植物提取物添加在黄鳝[ 7 ]、湘云金鲫[ 8 ]饲料中的报道。研究表明，在饲料中添加含有GPC的多种植物复合提取物20～30 mg/kg可显著提高黄鳝的WGR和SGR，降低FCR[ 7 ]；在饲料中添加含有GPC的葡萄籽与青蒿提取物10 000 mg/kg后，试验组湘云金鲫的WGR提高53.77%，FCR降低33.06%[ 8 ]。此外，Wang等[ 5 ]报道，在肉鸡饲粮中添加20 mg/kg的GPC可显著提高试验鸡的日增重，降低料重比；张海军等[ 6 ]在肉鸡饲粮中添加22.5 mg/kg的GPC后也有类似的结果。可见，在动物饲粮中添加GPC具有促生长作用，但本试验中促进吉富罗非鱼生长性能显著提高的GPC添加水平与他人的报道存在一定差异，这可能与试验动物的物种、试验饲料、试验条件以及GPC中原花青素含量和聚合度等不同有关。本试验中，各GPC添加组吉富罗非鱼肠道脂肪酶和蛋白酶活性均较对照组显著升高，这与黄光中等[ 7 ]在黄鳝饲料中添加含有GPC的葡萄籽与青蒿提取物的研究结果相似。Tebib等[ 9 ]研究也发现，在大鼠膳食中添加GPC可提高其肠道蛋白酶和脂肪酶活性。关于GPC提高鱼类肠道消化酶活性的机理尚不明确，可能与其对消化腺组织器官的保护作用有关。研究表明，GPC可以缓解氧化应激对肠黏膜和肝脏的损伤[ 10,11 ]，这间接促进了消化腺功能的完善和消化酶的分泌。此外，GPC可降低肠道pH，增加肠道中有益菌的数量和降低有害菌的数量，间接提高消化酶活性[ 6 ]。GPC提高肠道消化酶活性可相应提高动物对饲料的吸收利用[ 12 ]，这可能是GPC提高吉富罗非鱼生长性能的原因之一。此外，GPC在调节血脂水平、提高自身抗氧化能力和增强机体免疫功能方面的作用也可能是其促进动物生长的原因[ 5, 6, 13 ]。
3.2 饲料中添加GPC对吉富罗非鱼血脂水平的影响鱼类血脂水平的变化可以反映机体脂类代谢情况，被用来评价鱼体的健康水平，TG和LDL-C水平高表明肝脏中脂肪的分解代谢较低，而HDL-C可以将肝外组织的胆固醇运送到肝脏，其水平相对较高对机体健康比较有利[ 14 ]。本试验中，饲料中添加GPC可以降低吉富罗非鱼血清TC、TG和LDL-C水平，提高HDL-C水平，表明GPC可改善机体健康状况。研究表明，GPC可以抑制高胆固醇大鼠血清LDL-C水平的升高[ 15 ]；在仓鼠动脉硬化模型试验中，GPC降低了血清TC和TG水平[ 16 ]。此外，GPC还可降低正常血脂大鼠的血清TG和LDL-C水平[ 13 ]。研究发现，GPC可通过抑制胆固醇在肠道内腔形成胶束，提高胆固醇流出量，延迟脂肪和胆固醇吸收，提高内源胆固醇的逆向转运[ 17,18,19 ]；增强胆汁酸的排泄，抑制低密度脂蛋白(LDL)转化为泡沫细胞，缩短LDL在血管腔里的停留时间，有助于减少LDL被氧化的数量[ 20,21 ]；抑制胆固醇合成的关键酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的活性，降低血清TC和LDL-C水平[ 13 ]；提高LDL受体的表达，抑制载脂蛋白B合成，降低Caco-2内胆固醇酯的合成[ 22,23 ]等途径调节血脂水平。GPC也可能通过以上机制调节吉富罗非鱼的血脂水平，但这一点还有待进一步研究。
3.3 饲料中添加GPC对吉富罗非鱼肝胰脏抗氧化能力的影响SOD、CAT和GSH-Px等组成的抗氧化酶系统可清除自由基，减少脂质过氧化损伤[ 24 ]。T-AOC是衡量机体抗氧化能力的综合指标，可以反映鱼体对外界刺激的代偿能力和自由基代谢状态[ 25 ]。MDA是脂质过氧化物的主要分解产物，具有很强的生物毒性，会对机体产生过氧化损伤，它含量的高低间接反映了机体细胞受损伤的严重程度[ 26 ]。上述指标均是反映机体抗氧化性能和脂质过氧化程度的重要指标。
本试验中，饲料中添加GPC可提高吉富罗非鱼肝胰脏T-AOC和抗氧化酶活性(600和800 mg/kg添加组SOD活性除外)，降低MDA含量，说明GPC可提高机体的抗氧化能力，降低机体脂质过氧化损伤。研究表明，GPC在促进机体抗氧化功能提升方面具有明显效果，可提高正常大鼠[ 27 ]、老龄大鼠[ 28 ]、肠缺血大鼠[ 29 ]和经过辐射的小鼠SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量[ 30 ]。GPC可能通过以下途径提高吉富罗非鱼肝胰脏的抗氧化能力：1)GPC分子中B环的邻位酚羟基为主要还原部位，邻位酚羟基作为氢供体可以捕获氧化过程中产生的自由基，自身形成的自由基可以通过形成分子内氢键、半醌式自由基甚至邻苯醌等形式得以稳定[ 4 ]。2)抑制羟自由基(·OH)生成的电子传递，稳定膜的平衡电位，抑制·OH和超氧阴离子自由基(O2-·)引发的脂质过氧化链启动反应，清除脂质过氧化自由基(LOO-·)，阻断脂质过氧化链延长，对已发生的氧化损伤具有减轻或终止作用，从而中断自由基链反应，阻断由自由基引起的生物膜上多不饱和脂肪酸的过氧化，降低MDA含量[ 31 ]。3)GPC高分子结构中，几个与氧原子邻位的二羟酚基使得原花青素充分与金属离子(如Fe3+、Cu2+、Al3+)及蛋白质结合，抑制参与催化自由基反应的金属离子的活性[ 32,33 ]。4)通过清除自由基，使内源性抗氧化酶的损耗减少，间接升高其在机体中的活性[ 34 ]。本试验中，添加600 mg/kg GPC后吉富罗非鱼肝胰脏SOD活性降低，这与刘淑兰[ 35 ]与Elke等[ 36 ]在饲料中添加高水平抗氧化物质(槲皮素)后体内SOD活性及其mRNA表达水平降低的结果类似，这可能与高水平GPC发挥直接清除O2-·的作用[ 37 ]，使肝胰脏SOD活性维持在较低水平有关；而添加800 mg/kg GPC后吉富罗非鱼肝胰脏SOD活性又有所升高可能是GPC清除自由基的同时也在一定程度上诱导SOD活性升高所致，具体原因有待进一步查明。
4 结 论饲料中添加适宜水平的GPC可提高吉富罗非鱼的生长性能、肠道消化酶活性，调节血脂水平，增强肝胰脏抗氧化能力。本试验条件下，建议吉富罗非鱼饲料中GPC添加水平为200 mg/kg。
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